郝美玲，李春輝

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北承德067000)

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·臨床研究·

胃癌組織Oct4表達(dá)變化及意義

郝美玲，李春輝

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北承德067000)

目的 探討八聚體結(jié)合蛋白4(Oct4)在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及其機(jī)制。方法 選擇60例胃癌患者手術(shù)切除的癌組織及其相應(yīng)癌旁正常組織，分別應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)、Western blotting技術(shù)檢測Oct4 mRNA和蛋白表達(dá)；分析胃癌組織Oct4表達(dá)與TGF-β信號通路中TβRⅡ、Smad2、Smad3、E-Cadherin效應(yīng)因子及患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果 胃癌組織Oct4、Smad3 mRNA和蛋白的相對表達(dá)量明顯高于癌旁正常組織(P均<0.05)，TβRⅡ、Smad2、E-Cadherin mRNA和蛋白的相對表達(dá)量明顯低于癌旁正常組織(P均<0.05)。胃癌組織Oct4表達(dá)與TβRⅡ、Smad2、E-Cadherin蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r分別為-0.887、-0.912、-0.879，P均<0.01)，與Smad3蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.779，P<0.01)。胃癌組織Oct4表達(dá)變化與患者性別、年齡無關(guān)(P均>0.05)，與腫瘤組織分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和漿膜浸潤有關(guān)(P均<0.05)。結(jié)論 胃癌組織Oct4高表達(dá)可促進(jìn)胃癌的發(fā)生、發(fā)展，其機(jī)制可能與Oct4參與調(diào)節(jié)TGF-β信號通路、誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化有關(guān)。

胃癌；八聚體結(jié)合蛋白4；TGF-β信號通路；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

八聚體結(jié)合蛋白4(Oct4)是由Pou5F1基因編碼產(chǎn)生、含POU結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子家族成員，可與其他轉(zhuǎn)錄因子(如Sox、FoxD3等)結(jié)合，共同作用于許多下游靶基因的啟動子或增強(qiáng)子，正/負(fù)調(diào)控下游靶基因的表達(dá)。近年研究發(fā)現(xiàn)，Oct4過表達(dá)與乳腺癌、前列腺癌和結(jié)腸癌等發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)[1，2]。已有研究證實(shí)，TGF-β家族是體內(nèi)誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的重要原因。TGF-β信號特異性結(jié)合TGF-β受體磷酸化Smad2/Smad3復(fù)合體，Smad2/Smad3復(fù)合體與輔因子Smad4結(jié)合進(jìn)入核內(nèi)與靶基因特異性結(jié)合，調(diào)控特定基因的轉(zhuǎn)錄[3]。TβRⅡ、Smad2、Smad3作為TGF-β通路信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中至關(guān)重要的響應(yīng)因子，三者表達(dá)異?？梢鹦盘杺鲗?dǎo)異常，誘導(dǎo)EMT的發(fā)生，引起E-鈣黏著蛋白(E-Cadherin)表達(dá)異常[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，Oct4能通過調(diào)節(jié)EMT和細(xì)胞骨架重組等過程，抑制乳腺癌的肺轉(zhuǎn)移。但其在胃癌中的作用鮮見報(bào)道。為此，本研究探討Oct4在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及其機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2014年6月～2015年6月我院收治的胃癌患者60例，均經(jīng)術(shù)后組織病理檢查明確診斷，術(shù)前均未行放療、化療和免疫治療。其中，男37例、女23例，年齡39～87歲、中位年齡56歲；TNM分期(2009年國際抗癌聯(lián)盟分期標(biāo)準(zhǔn))：Ⅰ、Ⅱ期34例，Ⅲ、Ⅳ期26例；組織分化程度：高中分化27例，低分化33例；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移31例，伴漿膜浸潤37例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者均知情同意。

1.2 Oct4、TβRⅡ、Smad2、Smad3、E-Cadherin mRNA表達(dá)檢測 采用qRT-PCR法。取胃癌組織及相應(yīng)癌旁正常組織，TRIzol法提取總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，并將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系20 μL：5x gDNA Eraser Buffer 2.0 μL，gDNA Eraser 1 μL，加RNase Free dH2O至10 μL；Prime Script RT Enzyme MixI 1 μL，RT Prime Mix 1 μL，5x prime Script Buffer 2 4 μL，RNase Free dH2O 4 μL。反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 5 min。隨后對cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：SYBR PrimeMIX Ex Taq Ⅱ 10 μL，F(xiàn)orward Primer 0.8 μL，Reverse Primer 0.8 μL，ROX Reference Dye(50x) 0.4 μL，DNA masterplate 2 μL，dH2O 6 μL。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，95 ℃ 60 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s。得出溶解曲線和擴(kuò)增曲線及Ct值；以GAPDH內(nèi)參作為對照，采用相對定量的2-ΔΔCt法計(jì)算Oct4、TβRⅡ、Smad2、Smad3、E-Cadherin mRNA的相對表達(dá)量。

1.3 Oct4及TβRⅡ、Smad2、Smad3、E-Cadherin蛋白表達(dá)檢測 采用Western blotting法。取凍存胃癌組織及相應(yīng)癌旁正常組織100 g，冰上裂解，PMSF充分勻漿，4 ℃ 5 500 r/min離心20 min，取上清。BCA法檢測蛋白濃度合格后，加入上樣緩沖液95 ℃水浴5 min；取30 mg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳(12%分離膠+5%濃縮膠)，當(dāng)?shù)鞍着苤翝饪s膠與分離膠交界時(shí)，將電壓由80 mV調(diào)至120 mV，當(dāng)?shù)鞍纂娪九苤练蛛x膠底部時(shí)，停止電泳；恒流130 mA轉(zhuǎn)膜2 h，取出PVDF膜；用5%封閉液封閉2 h；孵育Oct4、TβRⅡ、Smad2、Smad3、E-Cadherin和GAPDH一抗2 h，置入4 ℃冰箱過夜，次日取出后復(fù)溫2 h，TBST洗膜3次，每次15 min；孵育羊抗兔抗體2 h，TBST洗膜3次，每次5 min；ECL發(fā)光液顯影。采用Quantity One V462圖像分析軟件對蛋白電泳條帶的灰度值定量分析，計(jì)算蛋白的相對表達(dá)量。蛋白的相對表達(dá)量=目的蛋白灰度值/β-actin內(nèi)參灰度值。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織與癌旁正常組織Oct4及TβRⅡ、Smad2、Smad3、E-Cadherin表達(dá)比較 胃癌組織及癌旁正常組織Oct4 mRNA相對表達(dá)量分別為4.54±0.79、1.00±0.00，Smad3 mRNA相對表達(dá)量分別為2.92±0.46、1.00±0.00，TβRⅡ mRNA相對表達(dá)量分別為0.56±0.06、1.00±0.00，Smad2 mRNA相對表達(dá)量分別為1.63±0.21、1.00±0.00，E-Cadherin mRNA相對表達(dá)量分別為0.94±0.10、1.00±0.00，胃癌組織Oct4、Smad3 mRNA相對表達(dá)量明顯高于癌旁正常組織，TβRⅡ、Smad2、E-Cadherin mRNA相對表達(dá)量明顯低于癌旁正常組織(P均<0.05)。胃癌組織及癌旁正常組織Oct4蛋白相對表量分別為4.54±0.54、1.73±0.22，Smad3蛋白相對表達(dá)量分別為2.92±0.39、2.58±0.31，TβRⅡ蛋白相對表達(dá)量分別為0.56±0.07、1.22±0.10，Smad2蛋白相對表達(dá)量分別為1.63±0.25、4.39±0.56，E-Cadherin蛋白相對表達(dá)量分別為0.94±0.11、1.97±0.18。胃癌組織Oct4、Smad3蛋白相對表達(dá)量明顯高于癌旁正常組織，TβRⅡ、Smad2、E-Cadherin蛋白相對表達(dá)量明顯低于癌旁正常組織(P均<0.05)。

2.2 胃癌組織Oct4蛋白表達(dá)與TβRⅡ、Smad2、Smad3、E-Cadherin蛋白表達(dá)的關(guān)系 Pearson相關(guān)分析顯示，胃癌組織Oct4蛋白表達(dá)與TβRⅡ、Smad2、E-Cadherin蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r分別為-0.887、-0.912、-0.879，P均<0.01)，與Smad3蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.779，P<0.01)。

2.3 胃癌組織Oct4蛋白表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 見表1。

表1 胃癌組織Oct4蛋白表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系±s)

3 討論

有研究在人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)條件下，在人毛囊組織中發(fā)現(xiàn)Oct4陽性的上皮干細(xì)胞和黑色素干細(xì)胞均能自我修復(fù)和分化成多種細(xì)胞。動物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，下調(diào)Oct4表達(dá)能促進(jìn)鼠神經(jīng)干細(xì)胞分化[5]，異位表達(dá)Oct4基因可阻止鼠上皮祖細(xì)胞的分化，并能引起上皮細(xì)胞的異常增殖[6]。有研究還發(fā)現(xiàn)，胃癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肝癌等多種腫瘤組織中均有Oct4表達(dá)，可維持腫瘤細(xì)胞的未分化性和自我更新潛能，參與腫瘤的形成與進(jìn)展。Chang等[7]研究發(fā)現(xiàn)，將轉(zhuǎn)染Oct3/4的鼠膀胱癌細(xì)胞株(MBT-2/Oct3/4)或轉(zhuǎn)染LacZ的鼠膀胱癌細(xì)胞株(MBT-2/LacZ)注入大鼠尾靜脈制作肺轉(zhuǎn)移動物模型，肺質(zhì)量、腫瘤數(shù)目和大小明顯增加，提示Oct3/4過表達(dá)能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。因此認(rèn)為，Oct4能參與成體干細(xì)胞和多種腫瘤細(xì)胞的自我更新過程，其過表達(dá)能促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。

TGF-β超家族主要由8種蛋白構(gòu)成整個(gè)Smad家族，通過可逆磷酸化對多種信號傳導(dǎo)通路進(jìn)行調(diào)節(jié)，共同擔(dān)負(fù)著細(xì)胞生長、分化、凋亡等過程[8]。TβRⅡ、Smad2和Smad3作為TGF-β信號通路中的響應(yīng)元件，表達(dá)異常會引起此信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)異常[9]。

EMT是上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程，上皮細(xì)胞在該過程中失去細(xì)胞極性及與基底膜的連接等上皮表型，獲得較高的遷移與侵襲、抗凋亡和降解細(xì)胞外基質(zhì)能力等間充質(zhì)表型，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[10～12]。EMT的主要特征為細(xì)胞黏附分子(如E-Cadherin)表達(dá)減少、細(xì)胞角蛋白細(xì)胞骨架轉(zhuǎn)化為Vimentin為主的細(xì)胞骨架及形態(tài)上具有間充質(zhì)細(xì)胞特征等，是上皮細(xì)胞來源的惡性腫瘤細(xì)胞獲得侵襲和遷移能力的重要生物學(xué)過程。腫瘤細(xì)胞發(fā)展到一定程度即可向周圍組織浸潤和轉(zhuǎn)移，當(dāng)發(fā)生EMT時(shí)，其侵襲和遷移能力更強(qiáng)[13]。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，發(fā)生EMT的腫瘤細(xì)胞較正常細(xì)胞能更快地穿過Matrige(類似體內(nèi)的基底膜)[14]。細(xì)胞劃痕試驗(yàn)證實(shí)，發(fā)生EMT的腫瘤細(xì)胞能更快地使劃痕愈合。研究證實(shí)，不同Smad蛋白在TGF-β誘導(dǎo)EMT過程中作用不同[15]。在原代培養(yǎng)的肝臟上皮細(xì)胞中，敲除Smad3基因能阻止EMT的發(fā)生，而敲除Smad2基因即使無TGF-β信號刺激，肝細(xì)胞也會自發(fā)出現(xiàn)EMT，表明smad3對EMT起促進(jìn)作用，而Smad2起抑制作用[16]。

細(xì)胞發(fā)生EMT的重要標(biāo)志是E-Cadherin表達(dá)減少或丟失[17]。E-Cadherin屬于Ⅰ型鈣黏著蛋白，其胞外結(jié)構(gòu)域在相鄰細(xì)胞之間以同親性方式相互結(jié)合；胞內(nèi)分別與α-聯(lián)蛋白、β-聯(lián)蛋白以及肌動蛋白形成復(fù)合物實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的黏附[18]。E-Cadherin的減少使細(xì)胞黏著力下降，甚至極性消失，表現(xiàn)出許多非上皮細(xì)胞的特性。因此認(rèn)為，E-Cadherin基因突變或消失是腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移過程中的關(guān)鍵分子事件。

本研究結(jié)果顯示，胃癌組織Oct4、Smad3 mRNA相對表達(dá)量明顯高于癌旁正常組織，TβRⅡ、Smad2、E-Cadherin mRNA相對表達(dá)量明顯低于癌旁正常組織。胃癌組織Oct4、Smad3蛋白相對表達(dá)量明顯高于癌旁正常組織，TβRⅡ、Smad2、E-Cadherin蛋白相對表達(dá)量明顯低于癌旁正常組織；相關(guān)分析顯示，Oct4蛋白表達(dá)與TβRⅡ、Smad2蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，與Smad3蛋白表達(dá)呈正相關(guān)；提示Oct4與TGF-β信號通路密切相關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)，Oct4蛋白表達(dá)與腫瘤組織分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及漿膜浸潤有關(guān)；表明Oct4可能參與胃癌的浸潤和轉(zhuǎn)移。

綜上所述，胃癌組織Oct4高表達(dá)與胃癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，其機(jī)制可能與Oct4參與調(diào)節(jié)TGF-β信號通路、誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生EMT有關(guān)。

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河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題計(jì)劃(ZL20140103)。

李春輝(E-mail： chli612@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.40.014

R735.2

B

1002-266X(2016)40-0045-03

2016-01-12)