彭樺，何前進(jìn)，金濤，李常海

(1 華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院，武漢430077；2 黃岡市中心醫(yī)院；3 華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院)

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生物鐘基因Timeless在HBV相關(guān)肝癌組織中的表達(dá)及其與乙肝病毒X蛋白的關(guān)系

彭樺1，何前進(jìn)2，金濤1，李常海3

(1 華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院，武漢430077；2 黃岡市中心醫(yī)院；3 華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院)

目的 探討生物鐘基因Timeless在HBV相關(guān)肝癌中的表達(dá)及其與乙肝病毒X蛋白(HBx)的關(guān)系。方法 選擇60例HBV相關(guān)肝癌患者，取其癌組織及癌旁正常組織，采用免疫組化法觀察Timeless的表達(dá)，分析Timeless表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。取人正常肝細(xì)胞系LO2、肝癌細(xì)胞系HepG2，分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HBx質(zhì)粒和pcDNA3.1質(zhì)粒，采用Real-time PCR和Western blotting法檢測細(xì)胞內(nèi)Timeless mRNA及其蛋白表達(dá)。結(jié)果 肝癌組織及癌旁正常組織Timeless陽性表達(dá)率分別為60.0%(36/60)、38.3%(23/60)，二者比較P<0.05。Timeless陽性表達(dá)與肝癌患者血管侵犯有關(guān)(P<0.05)，與患者性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤組織分化程度、血清AFP水平無關(guān)(P均>0.05)。轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HBx質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞和LO2細(xì)胞Timeless mRNA及其蛋白相對表達(dá)量均明顯高于轉(zhuǎn)染pcDNA3.1質(zhì)粒細(xì)胞(P均<0.05)。結(jié)論 HBV相關(guān)肝癌組織中Timeless高表達(dá)，其表達(dá)變化與HBV相關(guān)肝癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)；HBx可能是引起Timeless表達(dá)升高的原因之一。

肝細(xì)胞癌；Timeless；乙型肝炎病毒；乙肝病毒X蛋白

細(xì)胞內(nèi)的生物鐘由多個生物鐘基因共同精密調(diào)控[1～3]。研究發(fā)現(xiàn)，生物鐘紊亂與某些腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，如乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌等[4～7]。HBV感染是我國肝癌的首要致病因素，其編碼產(chǎn)物乙肝病毒X蛋白(HBx)是肝癌發(fā)生、發(fā)展的重要推動因子[8，9]。近年研究發(fā)現(xiàn)，HBx可導(dǎo)致生物鐘基因晝夜節(jié)律運動輸出周期故障基因(clock)、腦和肌肉組織芳香烴受體核轉(zhuǎn)運蛋白的類似蛋白1(Bmal1)、周期蛋白(Period 1～3)的表達(dá)異常，推測HBx可能是導(dǎo)致肝癌細(xì)胞中生物鐘基因表達(dá)紊亂的原因之一[10]。Timeless基因是近年新發(fā)現(xiàn)的一種生物鐘基因，其在肝癌組織中表達(dá)的報道較少，且研究結(jié)果不一，其作用機制亦未完全清楚[11，12]。為此，2006年8月～2012年7月，我們進(jìn)行了以下研究。

1 材料與方法

1.1 材料 選擇同期黃岡市中心醫(yī)院收治的肝癌患者60例，均經(jīng)術(shù)后組織病理檢測明確診斷。其中，男44例、女16例，年齡25～68歲、平均52.6歲；腫瘤組織分化程度：高分化16例，中分化27例，低分化17例；腫瘤直徑≥5 cm 32例，<5 cm 28例；血清AFP水平≤200 ng/mL 33例，>200 ng/mL 27例；有血管侵犯19例，無血管侵犯41例。所有患者血清乙肝表面抗原陽性，丙肝核心抗體陰性，術(shù)前未接受放療、化療、生物靶向治療及其他治療。人正常肝細(xì)胞系LO2、肝癌細(xì)胞系HepG2購自中國典型物種保藏中心。pcDNA3.1-HBx和pcDNA3.1表達(dá)載體，由華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院保存。TRIzol試劑、Lipofectamine 2000(脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染劑)和SYBR? Green PCR Master Mix，購自美國Life公司，PCR引物合成亦由Life公司完成。CO2培養(yǎng)箱，購自德國Heraeus公司；BX51型倒置相差顯微鏡、FV300型熒光顯微鏡，購自日本奧林巴斯公司；ABI 7500型實時熒光定量PCR儀，購自美國賽默飛世爾科技公司，Mini Protean 3 Cell型蛋白質(zhì)電泳儀，購自美國Bio-Rad公司。

1.2 肝癌組織及癌旁正常組織Timeless表達(dá)檢測 取患者手術(shù)切除的肝癌組織及癌旁正常組織，4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片。切片脫蠟至水，PBS洗滌10 min。3% H2O2室溫浸泡10 min。PBS洗滌3次，每次2 min。置于pH 9.0的緩沖液中，92～98 ℃微波加熱抗原修復(fù)20 min，常溫冷卻，PBS洗滌3次，每次2 min。用10%山羊血清37 ℃封閉1 h。棄去封閉液，直接滴加一抗(Timeless多克隆抗體1∶250稀釋)，4 ℃冰箱下孵育過夜。復(fù)溫后PBS洗滌3次，每次2 min。滴加1∶20稀釋的生物素化二抗羊抗兔IgG-HRP，37 ℃孵育30 min。PBS洗3次，每次2 min。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素，室溫孵育20 min。PBS洗3次，每次2 min。滴加DAB，纖維鏡下控制顯色，自來水中止反應(yīng)，蘇木素復(fù)染，脫水、封片。用PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照。Timeless陽性染色定位于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核，為黃色、棕黃色或褐色。根據(jù)染色強度和陽性細(xì)胞所占比例綜合計分。染色強度：無著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細(xì)胞所占比例：無陽性細(xì)胞為0分，陽性細(xì)胞所占比例≤25%為1分，>25%～≤50%為2分，>50%～≤75%為3分，>75%為4分。二者乘積>4分為Timeless陽性表達(dá)[13]。

1.3 細(xì)胞實驗

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 分別取2×105個HepG2細(xì)胞和LO2細(xì)胞，接種于6孔板中，加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至60%～70%融合時行HBx轉(zhuǎn)染。兩種細(xì)胞均分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HBx質(zhì)粒和pcDNA3.1質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染HBx質(zhì)粒細(xì)胞加入1.2 μg pcDNA3.1-HBx質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1質(zhì)粒細(xì)胞加入1.2 μg pcDNA3.1質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HBx質(zhì)粒細(xì)胞檢測到HBx mRNA及其蛋白表達(dá)，而轉(zhuǎn)染pcDNA3.1質(zhì)粒細(xì)胞則無HBx mRNA及其蛋白表達(dá)，表明轉(zhuǎn)染成功。轉(zhuǎn)染過程遵照Lipofectamine 2000說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染24 h收集細(xì)胞，提取細(xì)胞mRNA和總蛋白用于后續(xù)試驗。

1.3.2 肝細(xì)胞Timeless mRNA表達(dá)檢測 采用Real-time PCR法。按照TRIzol試劑說明書提取LO2、HepG2細(xì)胞總RNA，檢測RNA濃度和純度合格后，取2 μg mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。經(jīng)預(yù)實驗，將逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA 5倍稀釋作為模板。在GenBank上查詢Timeless mRNA序列(NM_003920.3)，通過Primer premier5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計。Timeless引物序列：上游引物5′-AGTCTTCTGCCTCTTCAATCGTC-3′，下游引物5′-AGCCATAGCCCTCAGTCATCTC-3′；內(nèi)參β-actin引物序列：上游引物5′-AGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，下游引物5′-CAATAGTGATGACCTGGCCGT-3′?？偡磻?yīng)體系為25 μL，反應(yīng)條件參照文獻(xiàn)[14]。按照SYBR? Green PCR Master Mix(2×)說明書進(jìn)行定量PCR反應(yīng)，每個樣本設(shè)3個復(fù)孔。反應(yīng)完成后在ABI7500軟件系統(tǒng)中調(diào)整基線和閾值，讀出各反應(yīng)孔Ct值。Ct值代表基因的起始拷貝數(shù)，可根據(jù)Ct值比較基因的表達(dá)量并計算基因表達(dá)變化倍率。變化倍率=2-ΔΔCt，ΔΔCt=(目的基因Ct-內(nèi)參基因Ct)/(陰性對照Ct-內(nèi)參基因Ct)。

1.3.3 肝細(xì)胞Timeless蛋白表達(dá)檢測 采用Western blotting法。收集LO2、HepG2細(xì)胞，提取總蛋白，通過10%聚丙烯酰胺凝膠電泳轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作，ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，X線曝光，圖像分析軟件分析各樣品顯色灰度，計算灰度值，以β-actin為內(nèi)參照。所測蛋白的灰度值與內(nèi)參照灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 肝癌組織及癌旁正常組織Timeless陽性表達(dá)比較 肝癌組織及癌旁正常組織Timeless陽性表達(dá)率分別為60.0%(36/60)、38.3%(23/60)。肝癌組織Timeless陽性表達(dá)率明顯高于癌旁正常組織(χ2=5.635，P<0.05)。

2.2 肝癌組織Timeless陽性表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 見表1。

表1 肝癌組織Timeless陽性表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 HBx轉(zhuǎn)染后肝細(xì)胞Timeless mRNA及其蛋白相對表達(dá)量比較 見表2。

表2 HBx轉(zhuǎn)染后肝細(xì)胞Timeless mRNA及其蛋白相對表達(dá)量比較±s)

注：與同種細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1比較，*P<0.05。

3 討論

人體細(xì)胞生物鐘在分子水平上由clock、Bmal1、Period等多個生物鐘基因精確調(diào)控[1]。這些基因構(gòu)成兩種重要的反饋回路：①生物鐘核心因子clock通過bHLH-PAS結(jié)構(gòu)域與Bmal1形成異二聚體，與Period 1～3和Cry 1、2基因啟動子上的E盒相結(jié)合并激活其轉(zhuǎn)錄，編碼產(chǎn)物Period 1～3和Cry 1、2蛋白由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，與clock/Bmal1直接結(jié)合并抑制其活性，進(jìn)而阻遏Period 1～3和Cry 1、2的轉(zhuǎn)錄[1]；②clock與Bmal1形成的異二聚體除激活Period 1～3和Cry 1、2基因轉(zhuǎn)錄外，也可激活孤兒核受體Rev-Erb基因的轉(zhuǎn)錄。Rev-Erb基因編碼蛋白可與Bmal1啟動子相結(jié)合并阻遏其轉(zhuǎn)錄[1]。由于基因轉(zhuǎn)錄、翻譯及蛋白入核需要一定時間，使生物節(jié)律分子振蕩以近24 h為周期自律進(jìn)行，生物鐘基因這種負(fù)反饋循環(huán)構(gòu)成人體內(nèi)精確的內(nèi)源性“分子鐘”。人體內(nèi)的“分子生物鐘”紊亂可導(dǎo)致細(xì)胞增殖和凋亡紊亂，細(xì)胞生長失控，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤形成。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，經(jīng)常熬夜人群中乳腺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌的發(fā)病率明顯高于不熬夜人群[1]。動物實驗亦證實，生物鐘紊亂可加快腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[15]。

1994年Sehgal等[16]在果蠅中篩選出了影響生物節(jié)律的新突變體，其對生物節(jié)律的影響與Period相似，與這一突變體對應(yīng)的野生型基因被稱為Timeless基因。Timeless可與Period 1～3結(jié)合，進(jìn)而進(jìn)入細(xì)胞核，抑制clock基因的活性，降低clock基因表達(dá)，從而終止生物鐘周期[16]。研究發(fā)現(xiàn)，Timeless是小鼠胚胎發(fā)育過程中的重要基因之一，在胚胎發(fā)育初期廣泛表達(dá)于心、腦、肝、肺等器官，其缺失可導(dǎo)致胚胎死亡率升高[16]。近年研究發(fā)現(xiàn)，Timeless在肺癌和結(jié)直腸癌中表達(dá)升高[17]；但其在肝癌組織中表達(dá)的報道較少，結(jié)論也不一致。如Lin等[11]報道，Timeless在肝癌組織中低表達(dá)；而Elgohary等[12]報道，其在肝癌組織中高表達(dá)。其原因可能為肝癌是一個異質(zhì)性較大的腫瘤，不同病因?qū)е碌母伟┰诨虮磉_(dá)上存在較大差異。本研究結(jié)果顯示，Timeless在肝癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織，與Elgohary等[12]研究結(jié)果一致。進(jìn)一步分析Timeless與肝癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，Timeless陽性表達(dá)在有血管侵犯的肝癌組織高于無血管侵犯的肝癌組織，亦與Elgohary等[12]研究結(jié)果吻合。表明Timeless可能參與了肝癌的發(fā)生、發(fā)展。

HBV與肝癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，其編碼產(chǎn)物HBx是肝癌發(fā)生、發(fā)展過程中的重要推動因素[18]。有研究發(fā)現(xiàn)，HBx可引起生物鐘基因clock、Bmal1、Period 1～3等異常表達(dá)，但對HBx與Timeless的關(guān)系鮮見報道[19，20]。本研究結(jié)果顯示，HBx可上調(diào)正常肝細(xì)胞(LO2)和肝癌細(xì)胞(HepG2)Timeless表達(dá)。由此推測，HBx可能是引起肝癌組織中Timeless表達(dá)升高的原因之一。HBx誘導(dǎo)Timeless表達(dá)升高引起的肝臟細(xì)胞生物鐘紊亂可能是HBx推動肝癌發(fā)生、發(fā)展的機制之一。Timeless高表達(dá)與肝癌血管侵犯密切相關(guān)，因此其亦參與HBx介導(dǎo)的肝癌侵襲和轉(zhuǎn)移[13]。關(guān)于HBx上調(diào)Timeless的詳細(xì)機制還有待進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，Timeless在HBV相關(guān)肝癌組織中高表達(dá)，且與血管侵犯相關(guān)，提示Timeless高表達(dá)可能與HBV相關(guān)肝癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)；HBx可能是引起肝癌組織中Timeless表達(dá)升高的原因之一。今后我們將繼續(xù)增加樣本量并檢測HBx在非HBV相關(guān)肝癌中的表達(dá)來驗證這一觀點，同時觀察Timeless與肝癌患者預(yù)后的關(guān)系，為肝癌的防治提供新的思路。

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Expression of Timeless in HBV-related hepatocellular carcinoma and its relationship with hepatitis B virus x protein

PENGHua1,HEQianjin,JINTao,LIChanghai

(1LiyuanHospitalAffiliatedtoTongjiMedicalCollegeofHuazhongScienceandTechnologyUniversity,Wuhan430077,China)

Objective To investigate the expression of circadian clock gene Timeless in hepatitis B virus (HBV)-related hepatocellular carcinoma (HCC) and its correlation with hepatitis B virus x protein (HBx). Methods Immunohistochemistry was employed to detect the expression of Timeless in 60 cases of HCC tissues and adjacent normal tissues. Then we analyzed the relationship between the expression of Timeless and clinic pathological features in HCC patients. Meanwhile, both pcDNA3.1-HBx and pcDNA3.1 were transfected into LO2and HepG2cell lines, respectively. Real-time PCR and Western blotting were used to detect the expression of Timeless mRNA and protein. Results The protein expression levels of Timeless in HCC tissues and adjacent normal tissues were 60.0% (36/60) and 38.3% (23/60), respectively; and significant differences were found (P<0.05). The expression of Timeless in HCC tissues was associated with vascular invasion (P<0.05), was not related with sex, age, level of serum AFP (allP>0.05). HepG2and LO2cell lines transfected with pcDNA3.1-HBx plasmids demonstrated higher protein and mRNA expression levels of Timeless as compared with those transfected with pcDNA3.1 plasmids (allP<0.05). Conclusion High expression of Timeless may be related to the occurrence and progression of HBV-related HCC, and HBx may be one of the reasons that causes the high expression of Timeless.

hepatocellular carcinoma; Timeless; hepatitis B virus; hepatitis B virus x protein

彭樺(1981-)，男，主治醫(yī)師，研究方向為腹部外科。E-mail: 2300836708@qq.com

簡介：何前進(jìn)(1977-)，男，主任醫(yī)師，研究方向為肝膽外科。E-mail： 44223706@qq.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.40.006

R735.7

A

1002-266X(2016)40-0021-04

2015-11-01)