祖彩華，張國梁，劉濤

(1 天津醫(yī)科大學(xué)一中心臨床學(xué)院，天津300192；2 天津市第一中心醫(yī)院)

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miR-506對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響及其作用機制

祖彩華1，張國梁2，劉濤2

(1 天津醫(yī)科大學(xué)一中心臨床學(xué)院，天津300192；2 天津市第一中心醫(yī)院)

目的 探討miR-506對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響及其作用機制。方法 將結(jié)腸癌細(xì)胞SW620隨機分為四組，分別轉(zhuǎn)染pcDNA3空載體(pcDNA3組)、miR-506過表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3/pri-506(miR-506組)、pSIH1空載體(pSIH1組)及miR-506抑制表達(dá)質(zhì)粒pSIH1/TuD-506(TuD-506組)。采用qRT-PCR法檢測各組miR-506 mRNA的相對表達(dá)量，CCK-8法檢測各組的細(xì)胞活性，集落形成試驗檢測各組的集落形成能力。采用生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-506的潛在靶基因，熒光報告載體試驗驗證結(jié)腸癌細(xì)胞SW620中miR-506對靶基因mRNA的調(diào)控作用。采用qRT-PCR法和Western blotting法檢測miR-506對靶基因mRNA及其蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果 與pcDNA3組比較，miR-506組miR-506 mRNA的相對表達(dá)量明顯升高，而細(xì)胞活性、集落形成能力明顯減弱(P均<0.01)；TuD-506組與pSIH1組miR-506 mRNA的相對表達(dá)量、細(xì)胞活性、集落形成能力比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。生物信息學(xué)軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，層黏連蛋白γ1(LAMC1)是miR-506的潛在靶基因，經(jīng)熒光報告載體試驗驗證，miR-506能夠直接作用于LAMC1 mRNA并負(fù)性調(diào)控其表達(dá)。miR-506組LAMC1 mRNA及其蛋白的相對表達(dá)量均低于pcDNA3組(P均<0.05)，TuD-506組與pSIH1組LAMC1 mRNA及其蛋白的相對表達(dá)量比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。結(jié)論 miR-506可抑制結(jié)腸癌的細(xì)胞活性、集落形成能力，LAMC1可能是miR-506的直接靶基因；miR-506可能通過抑制LAMC1的表達(dá)而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖。

結(jié)腸癌；微小RNA-506；細(xì)胞增殖；層黏連蛋白γ1

微小RNA(miRNA)是一類內(nèi)源性、高度保守的單鏈非編碼小RNA，長約22個核苷酸，其主要作用是與下游靶mRNA的3′-非編碼區(qū)(3′UTR)配對；當(dāng)二者不完全配對時，可抑制靶mRNA的翻譯或促進(jìn)靶mRNA的降解，導(dǎo)致相應(yīng)的蛋白表達(dá)下降[1，2]。有研究表明，miRNAs在細(xì)胞增殖、分化和凋亡中具有重要作用，某些miRNA還具有類似癌基因或抑癌基因作用[3，4]。層黏連蛋白γ1(LAMC1)是層黏連蛋白家族中的一員，在基膜中顯著表達(dá)，可促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。有研究發(fā)現(xiàn)，LAMC1可能是miR-506的潛在靶點，有可能成為治療腫瘤的新方向。2015年7月～2016年3月，本研究觀察了miR-506對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響，并探尋其下游靶基因，旨在為結(jié)腸癌治療提供新靶點。

1 材料與方法

1.1 材料 結(jié)腸癌細(xì)胞系SW620，由中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫提供。miR-506過表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3/pri-506和miR-506抑制表達(dá)質(zhì)粒pSIH1/TuD-506，由本實驗室前期構(gòu)建。miR-506、U6 snRNA、LAMC1及β-actin特異性PCR引物，由北京天潤奧科生物科技有限公司合成。DMEM/F12(1∶1)培養(yǎng)基、FBS，美國Gibco BRL；Opti-MEM Ⅰ無血清培養(yǎng)液、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000 Reagent，美國Life Technologies Corporation；兔源人LAMC1和GAPDH抗體，美國Santa Cruz；HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG Fc抗體，美國Abcam；mirVana RNA提取試劑盒，美國Ambion；PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Premix Ex Taq Ⅱ熒光定量PCR試劑盒，日本TaKaRa。LightCycle 96熒光定量PCR儀，瑞士Roche；Alpha Innotech FluorChem FC2凝膠成像分析系統(tǒng)，美國Alpha Innotech；水平/垂直電泳槽和電泳設(shè)備，北京六一儀器廠；EnSpireTMMultilabel Reader酶標(biāo)儀，美國PerkinElmer。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 取結(jié)腸癌細(xì)胞SW620置于含10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3天按1∶3傳代一次。取對數(shù)生長期細(xì)胞，接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁超過80%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染按照Lipofectamine 2000試劑說明書進(jìn)行。分別轉(zhuǎn)染pcDNA3空載體(pcDNA3組)、miR-506過表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3/pri-506(miR-506組)、pSIH1空載體(pSIH1組)及miR-506抑制表達(dá)質(zhì)粒pSIH1/TuD-506(TuD-506組)。

1.3 相關(guān)指標(biāo)觀察

1.3.1 細(xì)胞活性 采用CCK-8法。調(diào)整各組轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞密度為1×105個/mL，接種于96孔板中，每孔100 μL。培養(yǎng)48 h，每孔加入CCK-8試劑10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。酶標(biāo)儀檢測各組450 nm波長處的吸光度(A450)值。試驗重復(fù)3次，取平均值。

1.3.2 細(xì)胞集落形成能力 各組轉(zhuǎn)染24 h，消化計數(shù)，并接種于12孔板，每孔100個細(xì)胞。每3天更換一次培養(yǎng)液，觀察至細(xì)胞出現(xiàn)單個集落，停止培養(yǎng)。用2%結(jié)晶紫染液染色10 min，1×PBS溶液脫色后，顯微鏡下拍照觀察。以大于50個細(xì)胞作為集落形成，計數(shù)集落個數(shù)。試驗重復(fù)3次，取平均值。

1.3.3 miR-506的靶基因預(yù)測及驗證 應(yīng)用生物信息學(xué)軟件TargetScanHuman (http://www.targetscan.org/vert_71/)，輸入miRNA的名稱hsa-miR-506，預(yù)測miR-506的靶基因。根據(jù)生物信息學(xué)軟件預(yù)測的結(jié)果，將LAMC1 3′UTR上的miR-506結(jié)合位點克隆插入GFP熒光報告基因編碼區(qū)下游，同時將miR-506“種子序列”位點突變插入GFP編碼區(qū)下游，分別構(gòu)建帶有野生型(pcDNA3/EGFP-LAMC1-wtUTR)和突變型(pcDNA3/EGFP-LAMC1-mutUTR)結(jié)合位點的熒光報告載體。轉(zhuǎn)染前1天，將結(jié)腸癌細(xì)胞SW620接種于24孔板中。轉(zhuǎn)染當(dāng)天，將載有熒光報告載體的質(zhì)粒和載有miR-506過表達(dá)或miR-506抑制表達(dá)質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染細(xì)胞，每組設(shè)3個復(fù)孔。轉(zhuǎn)染24 h，將細(xì)胞原培養(yǎng)液吸棄，用1×PBS浸洗1次，加入放免分析裂解緩沖液100 μL/孔，冰浴搖床搖動60 min。用移液器反復(fù)吹打各孔細(xì)胞，將細(xì)胞裂解液移至1.5 mL離心管中，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，吸取上清至另一管，得到細(xì)胞蛋白樣品。取各孔蛋白樣品100 μL置于酶標(biāo)板，用酶標(biāo)儀檢測蛋白樣品中綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá)強度(激發(fā)光為488 nm，發(fā)射光為507 nm)，以對照組GFP的表達(dá)量為1，計算各組校正后GFP的相對表達(dá)量。試驗重復(fù)3次，取平均值。

1.3.4 miR-506、LAMC1 mRNA表達(dá) 采用qRT-PCR技術(shù)。采用RNA提取試劑盒提取結(jié)腸癌細(xì)胞的RNA。以此為模板，逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA。按照qRT-PCR SYBR Green法進(jìn)行PCR擴增。引物序列：miR-506-Fwd：5′-TGCGGTAAGGCACCCTTCTGA-GTAG-3′；U6-Fwd：5′-TGCGGGTGCTCGCTCGGCAG-C-3′；miR-506/U6-Rvs：5′-CCAGTGCAGGGTCCGAG-GT-3′；LAMC1-Fwd：5′-CATGTATCTGAATACCTCC-3′；LAMC1-Rvs：5′-CATAGCTTGTAACCTG-3′；β-ac-tion-Fwd：5′-CGTGACATTAAGGAGAAGCTG-3′；β-action-Rvs：5′-CTAGAAGCATTTGCGGTGGAC-3′；LA-MC1-wtUTR-top：GATCCACTGTGGACCTTTTATATG-TGCCTTCACTTTAGCTGTTTGCCTTAATCTG；LAMC-1-wtUTR-bottom：AATTCAGATTAAGGCAAACAGCT-AAAGTGAAGGCACATATAAAAGGTCCACAGTG； LA-MC1-mutUTR-top：GATCCACTGTGGACCTTTTATAT-CAGGGATCACTTTAGCTGTTCACGAAAATCTG； LA-MC1-mutUTR-bottom：AATTCAGATTTTCGTGAACA-GCTAAAGTGATCCCTGATATAAAAGGTCCACAGTG。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃ 5 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，擴增40個循環(huán)后進(jìn)行熔解曲線分析，以2-ΔΔCt法進(jìn)行計算。試驗重復(fù)3次，取平均值。

1.3.5 LAMC1蛋白表達(dá) 采用Western blotting法。收集各組轉(zhuǎn)染后細(xì)胞，用RIPA裂解液裂解，提取細(xì)胞蛋白。蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。以兔抗人LAMC1和GAPDH為一抗，以HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG Fc抗體為二抗，進(jìn)行Western blotting檢測。硝酸纖維素膜經(jīng)ECL顯影液孵育后，應(yīng)用LabWorksTM凝膠成像系統(tǒng)采集信號。圖像經(jīng)AlPhaView分析軟件進(jìn)行灰度值測定。通過計算每組樣品灰度值(目的蛋白條帶亮度值-背景值)與對應(yīng)蛋白灰度值(內(nèi)參蛋白GAPDH條帶亮度值-背景值)的比值，得到校正后目的蛋白的相對表達(dá)量。以對照組目的蛋白的表達(dá)量為1，計算各組校正后目的蛋白的相對表達(dá)量。試驗重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 各組miR-506 mRNA相對表達(dá)量及細(xì)胞活性、集落形成能力比較 見表1。

表1 各組miR-506 mRNA相對表達(dá)量及細(xì)胞活性、集落形成能力比較±s)

注：僅同載體間進(jìn)行比較；與pcDNA3組比較，*P<0.01。

2.2 miR-506的靶基因預(yù)測 生物信息學(xué)軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，LAMC1可能為miR-506的潛在靶基因。

2.3 各組pcDNA3/EGFP-LAMC1-wtUTR、pcDNA3/EGFP-LAMC1-mutUTR相對表達(dá)量比較 見表2。

表2 各組pcDNA3/EGFP-LAMC1-wtUTR、pcDNA3/EGFP-LAMC1-mutUTR相對表達(dá)量比較

注：僅同載體間進(jìn)行比較；與pcDNA3組比較，*P<0.01。

2.4 各組LAMC1 mRNA及其蛋白表達(dá)比較 見表3。

表3 各組LAMC1 mRNA及其蛋白相對表達(dá)量比較

注：僅同載體間進(jìn)行比較；與pcDNA3組比較，*P<0.05。

3 討論

目前結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制尚不完全清楚。近年研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs表達(dá)失調(diào)對結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力具有一定影響[5～10]。由此推測，miRNAs可能參與了結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展。

miR-506是miRNAs的一員，其在不同腫瘤細(xì)胞中表達(dá)不同。Sun等[11]研究發(fā)現(xiàn)，與正常乳腺上皮細(xì)胞比較，miR-506在乳腺癌細(xì)胞系(T47D、MDA-MB-231、SK-BR-3、HCC1937)中顯著低表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-506可通過抑制IQGAP1/ERK信號傳導(dǎo)通路來抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲。Arora等[12]研究證實，miR-506能抑制乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及癌細(xì)胞的黏附、侵襲和遷移。Yin等[13]研究發(fā)現(xiàn)，miR-506通過抑制NF-κB p65信號傳導(dǎo)通路，增加活性氧的產(chǎn)生，激活p53信號通路，繼而導(dǎo)致肺癌細(xì)胞的凋亡、抑制肺癌細(xì)胞的活性，但在正常肺組織細(xì)胞中卻無此作用。說明miR-506可選擇性殺傷肺癌細(xì)胞，有可能成為治療肺癌的潛在靶點。Wang等[14]研究發(fā)現(xiàn)，miR-506在原發(fā)性肝癌組織中低表達(dá)，在肝癌細(xì)胞系HepG2和H7402中，miR-506通過靶定yes相關(guān)蛋白(YAP)mRNA的3′UTR來抑制癌細(xì)胞的增殖。有研究報道，80%宮頸癌組織miR-506低表達(dá)，且與Ki-67的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。表明miR-506可抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖。但也有研究報道，在黑色素瘤組織中miR-506表達(dá)升高，并可促進(jìn)黑色素瘤的發(fā)生、發(fā)展[15]。以上研究表明，miR-506可能具有抑癌和促癌雙重作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，與pcDNA3組比較，miR-506組細(xì)胞活性、集落形成能力明顯減弱；而pSIH1組與TuD-506組細(xì)胞活性、集落形成能力比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。因此，尚不能證實抑制miR-506對結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖有影響。其原因可能是結(jié)腸癌細(xì)胞SW620中miR-506低表達(dá)，抑制其表達(dá)對其產(chǎn)生的影響微乎其微。其具體原因尚需進(jìn)一步研究。

層黏連蛋白是由α、β和γ鏈組成的三聚體化合物，是細(xì)胞外基質(zhì)的重要調(diào)節(jié)因子，對細(xì)胞的分化、遷移和黏附有一定影響[16]。層黏連蛋白表達(dá)升高可促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移和侵襲[17,18]。LAMC1是層黏連蛋白家族中的一員，Ke等[19]報道，在黑色素瘤細(xì)胞中LAMC1表達(dá)升高，其表達(dá)變化與腫瘤短期內(nèi)復(fù)發(fā)及無瘤生存期縮短有關(guān)。Nishikawa等[20]研究證實，LAMC1在前列腺癌中高表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-29s通過直接靶定LAMC1的信號傳導(dǎo)通路而抑制癌細(xì)胞的活性。生物信息學(xué)軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，LAMC1可能是miR-506的下游靶點。本研究結(jié)果顯示，對于帶有野生型結(jié)合位點LAMC1 3′UTR的熒光報告載體，過表達(dá)miR-506能夠抑制GFP的表達(dá)強度；而對于帶有突變型結(jié)合位點LAMC1 3′UTR的熒光報告載體，miR-506不能影響報告基因的GFP表達(dá)強度。證實miR-506能夠直接作用于LAMC1 3′UTR的特定序列，并對結(jié)合位點上游熒光報告基因的表達(dá)起負(fù)性調(diào)控作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，miR-506組LAMC1 mRNA及其蛋白的相對表達(dá)量降低，進(jìn)一步證實LAMC1是miR-506的下游靶點。

綜上所述，miR-506能抑制結(jié)腸癌的細(xì)胞活性和集落形成能力，其作用的靶基因可能是LAMC1。但miR-506是否還調(diào)控其他靶基因來影響結(jié)腸癌細(xì)胞的生物活性尚需進(jìn)一步研究。

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Effects of miR-506 on proliferation of colorectal carcinoma cells and its mechanism

ZUCaihua1,ZHANGGuoliang,LIUTao

(1FirstCentralClinicalCollegeofTianjinMedicalUniversity,Tianjin300192,China)

Objective To investigate the effects of microRNA-506 (miR-506) on proliferation of colorectal carcinoma cells and to identify the target gene for miR-506. Methods The colorectal carcinoma SW620 cells were respectively divided into pcDNA3 group, miR-506 group, pSIH1 group and TuD-506 group according to different tranfection plasmids. The real-time fluorescent quantitative PCR was used to detect the expression of miR-506. Cell viability and colony-forming ability was measured by CCK8 and colony formation assays, respectively. Furthermore, bioinformatics method was applied to predict potential target genes of miR-506.Green fluorescent protein (GFP) reporter assays were used to verify the direct regulation of miR-506 on target mRNA in SW620 cells. The LAMC1 mRNA and protein levels were detected by quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) and Western blotting, respectively. Results Compared with the pcDNA3 group, the relative expression of miR-506 in the miR-506 group was significantly higher, while the activity and colony formation ability of the miR-506 group was significantly decreased (allP<0.01). No statistically significant difference was found in the relative expression of miR-506, cell viability and colony forming ability between the TuD-506 group and pSIH1 group (allP>0.05). LAMC1 was predicted to be a potential target gene of miR-506, and GFP reporter assays verified miR-506 directly targeted LAMC1 mRNA and negatively regulated its expression. The expression of miR-506 in the miR-506 group was significantly lower than that of the pcDNA3 group (allP<0.05). No statistically significant difference was found in the LAMC1 mRNA and protein expression between the TuD-506 group and pSIH1group (allP>0.05). Conclusion miR-506 plays a tumor suppressor role in SW620 cells by inhibiting cell viability and colony formation, LAMC1 is a direct target gene for miR-506, and miR-506 inhibits proliferation of colorectal cancer cells by down-regulating the expression of LAMC1.

colorectal carcinoma; miR-506; cell proliferation; laminin γ1

國家自然科學(xué)基金資助項目(81402322)；2013年度天津市企業(yè)博士后創(chuàng)新項目擇優(yōu)資助計劃。

祖彩華(1989-)，女，碩士在讀，研究方向為消化系統(tǒng)疾病。E-mail: caihuazu@163.com

簡介：劉濤(1981-)，男，主管技師，博士，研究方向為非編碼RNA對腫瘤細(xì)胞的調(diào)控。E-mail: 13821217761@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.40.002

R735.3

A

1002-266X(2016)40-0005-04

2016-03-25)