康利民，鄭 永，楊文雄，王阿勇，施紅寧

(普洱市人民醫(yī)院肝膽外科，云南 普洱 665000)

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康萊特注射液對人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1增殖和凋亡影響的實驗研究

康利民，鄭 永，楊文雄，王阿勇，施紅寧

(普洱市人民醫(yī)院肝膽外科，云南 普洱 665000)

目的 通過康萊特注射液作用于人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1，觀察其對PANC-1細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并進一步探討其作用機制。方法 倒置顯微鏡及電鏡觀察80 μL·mL-1康萊特注射液作用PANC-1細(xì)胞72 h后細(xì)胞形態(tài)改變；采用MTT比色法檢測不同濃度(10、20、40、60、80、100 μL·mL-1)康萊特注射液對PANC-1細(xì)胞生長增殖抑制作用的影響；同時采用流式細(xì)胞術(shù)檢測不同濃度(10、20、40、60、80、100 μL·mL-1)康萊特注射液對PANC-1細(xì)胞周期的影響。結(jié)果 細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)80 μL·mL-1康萊特注射液處理PANC-1細(xì)胞72 h后細(xì)胞生長稀疏，細(xì)胞質(zhì)透亮度下降，線粒體等細(xì)胞器功能障礙，細(xì)胞核功能上受到一定的抑制；不同濃度康萊特注射液作用于PANC-1細(xì)胞株不同時段(24、48、72 h)后腫瘤細(xì)胞生長受到了一定的抑制且呈現(xiàn)時間和劑量依賴性；不同濃度康萊特注射液處理PANC-1胰腺癌細(xì)胞72 h后PANC-1細(xì)胞周期均阻滯于G2/M期，康萊特注射液可劑量依賴性的誘導(dǎo)PANC-1細(xì)胞凋亡。結(jié)論 康萊特注射液能夠有效抑制人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1在體外的生長，其機制可能是通過抑制細(xì)胞增殖，促進腫瘤細(xì)胞的凋亡而實現(xiàn)，有望成為胰腺癌的有效治療藥物。

胰腺癌；康萊特注射液；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡

胰腺癌是肝膽外科惡性程度極高的腫瘤之一，近年來發(fā)病率有增高的趨勢。胰腺癌發(fā)現(xiàn)時多已處于中晚期，很難完全依靠手術(shù)達到根治目的[1]。化療作為腫瘤綜合治療的重要手段，在胰腺癌中亦發(fā)揮著重要的作用，然而目前尚缺少對胰腺癌化療特別敏感的抗腫瘤藥物?？等R特注射液是從中藥薏苡仁中提取到的抗腫瘤有效成分。臨床應(yīng)用亦證實其在原發(fā)性肝癌、結(jié)直腸癌的治療中顯示出較好的療效，但其在胰腺癌治療中尚缺乏系統(tǒng)的基礎(chǔ)研究。本實驗通過對人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1的體外培養(yǎng)，研究康萊特注射液對細(xì)胞增殖的影響，探討其在治療胰腺癌中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 康萊特注射液購自浙江康萊特藥業(yè)有限公司；PANC-1細(xì)胞培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素鏈霉素雙抗均購自美國Invitrogen公司；二甲基亞砜(DMSO)、MTT等其他試劑均購自美國Sigma-Aldrich公司；CO2培養(yǎng)箱購自德國Heraeus公司，F(xiàn)ACSCalibur流式細(xì)胞儀購自美國BD生物公司；JEM-ARM200F透射電鏡購自日本JEOL公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 PANC-1細(xì)胞培養(yǎng) PANC-1細(xì)胞購自美國ATCC細(xì)胞庫，PANC-1培養(yǎng)在DMEM完全培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中包含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、50 μL·mL-1青霉素和100 μL·mL-1鏈霉素雙抗。細(xì)胞置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中，待生長良好后取對數(shù)生長期PANC-1細(xì)胞用于本研究。

1.2.2 倒置顯微鏡及電鏡觀察PANC-1細(xì)胞形態(tài)變化 取對數(shù)生長期的PANC-1腫瘤細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度接種于6孔培養(yǎng)板，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)12 h后，加入含80 μL·mL-1康萊特注射液的DMEM培養(yǎng)基2 mL，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)改變；同時胰酶消化吸收細(xì)胞，丙二醛固定，檸檬酸鉛染色，透射電鏡觀察細(xì)胞線粒體等超微結(jié)構(gòu)變化。

1.2.3 MTT法檢測PANC-1細(xì)胞增殖 培養(yǎng)后的PANC-1細(xì)胞調(diào)整密度后按照105個/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)24 h，然后分別加入含不同濃度康萊特注射液的DMEM培養(yǎng)基，康萊特注射液最終濃度依次為10、20、40、60、80、100 μL·mL-1。每個濃度設(shè)3個復(fù)孔，同時設(shè)陽性對照組(吉西他濱20 μmol·L-1)、陰性對照組(空白溶劑)，分別培養(yǎng)24、48及72 h后終止反應(yīng)，每孔加入5 mg·L-1MTT 20 μL，4 h后每孔加入200 μL DMSO終止反應(yīng)。490 nm波長測定每孔的吸光度(CPM)值。細(xì)胞增殖抑制率(%)=[1-(實驗組平均CPM值/對照組平均CPM值)]×100%。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測PANC-1細(xì)胞周期 取106個PANC-1細(xì)胞加入康萊特注射液(0、10、20、40、60、80、100 μL·mL-1)共培養(yǎng)72 h。4 ℃ PBS洗2遍，用體積分?jǐn)?shù)0.7%冷乙醇固定細(xì)胞，4 ℃過夜，1 500 r·min-1離心去乙醇，PBS洗2遍，棄上清，0.01% RNA酶1 mL處理10 min，0.25%碘化丙啶避光染色20 min后，流式細(xì)胞儀行DNA倍體及細(xì)胞周期分析。

2 結(jié)果

2.1 康萊特注射液對PANC-1細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響 顯微鏡發(fā)現(xiàn)陰性對照組PANC-1細(xì)胞貼壁生長、大小形態(tài)均勻、胞體飽滿成梭形；80 μL·mL-1康萊特注射液處理PANC-1細(xì)胞72 h后細(xì)胞生長密度降低及緩慢，細(xì)胞質(zhì)渾濁，細(xì)胞貼壁生長數(shù)明顯減少。電鏡發(fā)現(xiàn)空白組PANC-1細(xì)胞胞膜完整、線粒體等細(xì)胞器及細(xì)胞核結(jié)構(gòu)均清晰可見；80 μL·mL-1康萊特注射液處理PANC-1細(xì)胞72 h后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞體積明顯縮小，胞膜皺縮、細(xì)胞表面突起和微絨毛減少；細(xì)胞質(zhì)明顯較少、線粒體等細(xì)胞器腫脹甚至出現(xiàn)空泡化；同時細(xì)胞核濃縮成團，染色質(zhì)不均勻聚集在細(xì)胞核膜下，呈邊集現(xiàn)象。見圖1。

2.2 康萊特注射液對PANC-1細(xì)胞增殖的影響 實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)康萊特注射液對PANC-1細(xì)胞的增殖有一定程度的抑制作用，并且康萊特注射液對PANC-1細(xì)胞抑制率隨著康萊特注射液濃度的增加而增加，以80、100 μL·mL-1增殖抑制作用最為顯著，具有明顯的量效關(guān)系；同時隨著與康萊特注射液培養(yǎng)時間的延長，康萊特注射液對PANC-1細(xì)胞的抑制作用有顯著差異(P<0.05)，100 μL·mL-1康萊特注射液共培養(yǎng)72 h時增殖抑制率達86.5%，具有明顯的時效關(guān)系?？傊S著康萊特注射液濃度及作用時間的延長，其對PANC-1腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用越加明顯。見表1。

2.3 康萊特注射液對PANC-1細(xì)胞細(xì)胞周期的影響 不同濃度康萊特注射液處理PANC-1細(xì)胞72 h后，隨康萊特注射液濃度的增加，G0/G1期、G2/M期PANC-1細(xì)胞比例下降，S期PANC-1細(xì)胞比例增加，與陰性對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，在60 μL·mL-1康萊特注射液處理PANC-1細(xì)胞72 h后，凋亡率高達41.5%；同時隨著康萊特注射液濃度的增加，流式細(xì)胞圖可見逐漸增強的DNA亞二倍體峰。流式細(xì)胞分析結(jié)果表明康萊特注射液可劑量依賴性的誘導(dǎo)PANC-1細(xì)胞凋亡并且以60 μL·mL-1康萊特注射液誘導(dǎo)PANC-1細(xì)胞凋亡的能力最強。見表2。

圖1 康萊特注射液對PANC-1細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響

表1 不同濃度的康萊特注射液對不同時段PANC-1細(xì)胞增殖抑制作用

表2 不同濃度康萊特注射液對PANC-1細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

胰腺癌是臨床上惡性程度極高的腫瘤，發(fā)現(xiàn)時多為中晚期，并失去手術(shù)機會，目前，國內(nèi)5 a生存率極低，僅為1%～3%[2]?；熓侵委熗砥谝认侔┑闹匾椒ㄖ?。隨著吉西他濱等抗腫瘤藥物在胰腺癌治療上的應(yīng)用，植物提取化合物抗腫瘤藥物逐漸成為了國內(nèi)外的研究熱點。而我國擁有悠久的傳統(tǒng)中醫(yī)藥及廣泛的藥用植物，進一步挖掘傳統(tǒng)中醫(yī)藥抗腫瘤作用及其機制值得我們深入探索研究。

康萊特注射液是從傳統(tǒng)中藥薏苡仁中提取出的有效抗腫瘤成分，是我國具有自主知識產(chǎn)權(quán)的中藥抗腫瘤藥物代表。近年來多項動物及臨床研究均已證實康萊特注射液在惡性腫瘤中，特別是原發(fā)性肝癌、胃癌、結(jié)直腸癌等的治療中有顯著作用[3]。目前認(rèn)為康萊特注射液能夠作用于腫瘤細(xì)胞的G2/M期，從而抑制細(xì)胞的有絲分裂及生長。同時康萊特注射液能夠有效促進腫瘤細(xì)胞的凋亡及抑制腫瘤血管的生成。并且康萊特注射液具有能夠增強化療患者的免疫力、減輕抗腫瘤藥物的毒副反應(yīng)[4]。因為康萊特注射液具有以上特點，所以目前逐漸得到臨床醫(yī)生的信賴和認(rèn)可。

本實驗細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)80 μL·mL-1康萊特注射液處理PANC-1細(xì)胞72 h后細(xì)胞生長密度降低及緩慢，細(xì)胞質(zhì)渾濁，細(xì)胞貼壁生長數(shù)明顯減少，電鏡顯示細(xì)胞形態(tài)遭到破壞，線粒體等細(xì)胞器功能障礙，細(xì)胞核功能受到抑制。這些均證明康萊特注射液具有明顯抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用；同時MTT實驗發(fā)現(xiàn)100 μL·mL-1康萊特注射液與PANC-1細(xì)胞共培養(yǎng)72 h時增殖抑制率達86.5%，且隨著康萊特注射液溶度的增加及培養(yǎng)實驗的延長，抑制PANC-1細(xì)胞增殖的作用越明顯，說明康萊特注射液對PANC-1細(xì)胞的增殖抑制作用呈現(xiàn)明顯的濃度和時間依賴性。本實驗研究結(jié)果與許健等[5]報道薏苡仁油能夠明顯抑制人原位胰腺癌BxPC-3細(xì)胞的增殖是一致的。

本實驗流式細(xì)胞儀分析發(fā)現(xiàn)經(jīng)康萊特注射液處理后的PANC-1細(xì)胞周期均阻滯于G2/M期，S期細(xì)胞百分比上升，特別是60 μL·mL-1康萊特注射液處理PANC-1細(xì)胞72 h后，凋亡率高達41.5%，實驗結(jié)果證明康萊特注射液能夠顯著誘導(dǎo)PANC-1腫瘤細(xì)胞的凋亡。提示康萊特注射液對PANC-1腫瘤細(xì)胞生長抑制可能是通過阻滯細(xì)胞周期進而促進細(xì)胞凋亡引起的。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)康萊特注射液能夠誘導(dǎo)包括胃癌細(xì)胞、結(jié)直腸癌細(xì)胞及肝癌細(xì)胞在內(nèi)的腫瘤細(xì)胞，下調(diào)細(xì)胞凋亡抑制基因，上調(diào)凋亡誘導(dǎo)基因，從而起到腫瘤治療作用[6-8]。由此推斷康萊特注射液引起腫瘤細(xì)胞周期阻滯可能與凋亡基因的相關(guān)表達變化有一定的關(guān)聯(lián)。

總之，康萊特注射液能夠有效抑制人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1的體外生長，提示其作用機制可能是通過抑制細(xì)胞增殖，促進腫瘤細(xì)胞的凋亡而實現(xiàn)，為該藥物臨床應(yīng)用于胰腺癌的治療提供了一定的實驗依據(jù)。

[1] 舒建山,易峰濤,張帆,等.三維適形放療聯(lián)合介入化療治療局部晚期胰腺癌的臨床觀察[J].腫瘤基礎(chǔ)與臨床,2014,27(2):124-126.

[2] Mukherjee S,Hurt CN,Bridgewater J,et al.Gemcitabine-based or capecitabine-based chemoradiotherapy for locally advanced pancreatic cancer(SCALOP): a multicentre,randomised,phase 2 trial[J].Lancet Oncol,2013，14(4):317-326.

[3] 景俊杰,李小玲,南月清.康萊特注射液對腫瘤治療的作用研究進展[J].中國藥物與臨床,2013,13(11):1447-1448.

[4] 姚小健.康萊特注射液聯(lián)合化療治療老年胃癌臨床觀察 [J].腫瘤基礎(chǔ)與臨床,2015,28(2):160-161.

[5] 許健,沈雯,孫金權(quán),等.薏苡仁油對人原位胰腺癌BxPC-3細(xì)胞生長及VEGF和bFGF表達的影響[J].中草藥,2012,43(4):724-728.

[6] 趙娜,魏素菊,洪雷,等.康萊特注射液對吉非替尼誘導(dǎo)人肺腺癌A549細(xì)胞株凋亡影響的實驗研究[J].臨床腫瘤學(xué)雜志,2015,20(1):1-7.

[7] 印滇,姚登福,王亞非,等.康萊特抑制結(jié)腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用及其分子機制研究 [J].胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志,2012,21(11):1005-1010.

[8] 金鑫,姚良蘋,盧云,等.康萊特對HepG2細(xì)胞凋亡及其Caspase-3和Survivin表達影響 [J].齊魯醫(yī)學(xué)雜志,2012,27(1):1-3.

Effects of Kanglaite Injection on the Proliferation and Apoptosis of Pancreatic Cancer PANC-1 Cells

Kang Limin,Zheng Yong,Yang Wenxiong,Wang Ayong,Shi Hongning

(DepartmentofHepatobiliarySurgery,thePeople’sHospitalofPuerCity,Puer665000,China)

Objective To investigate the effects of kanglaite injection on the proliferation and apoptosis of pancreatic cancer PANC-1 cells.Methods Different concentration of sodium kanglaite injection(10,20,40,60,80,100 μL·mL-1) were adder to PANC-1 cells for 24,48,72 h.Inverted microscope and electron microscope were used to observe the change of cell morphology of 80 μL·mL-1kanglaite injection of PANC-1 cells after 72 h; the MTT assay was performed to reveal the inhibitory effect on cell proliferation; cell cycle was tested by flow cytometry.Results Cell morphology examination found cell growth and sparse cytoplasm brightness decreased,mitochondria dysfunction,nuclear function was inhibited,after 80 μL·mL-1kanglaite injection treatment of PANC-1 cells of 72 h; kanglaite injection with different concentration treatment inhibited the proliferation in a dose and time-dependent manner; different concentration of kanglaite injection cocultured PANC-1 cells after 72 h,most of PANC-1 cell cycle arrested in G2/M phase,kanglaite injection could induce the apoptosis of PANC-1 cells dose dependently.Conclusion Kanglaite injection can effectively inhibit the growth of the human pancreatic cancer PANC-1 cells in vitro,and its mechanism may be through inhibition of cell proliferation,promote apoptosis of tumor cells and implementation,is expected to become the effective drugs for the treatment of pancreatic carcinoma.

pancreatic carcinoma; kanglaite injection; cell proliferation; cell apoptosis

康利民(1984-)，男，博士，主治醫(yī)師，主要從事肝膽胰及微創(chuàng)外科基礎(chǔ)與臨床相關(guān)研究。E-mail：kanglimin2010@163.com

10.3969/j.issn.1673-5412.2016.05.001

R735.9；R730.23

A

1673-5412(2016)05-0369-04

2015-10-22)