張忠獻，王鵬舉，王堯河

(鄭州大學基礎(chǔ)醫(yī)學院、鄭州大學科技部細胞與基因治療國際聯(lián)合研究中心，河南 鄭州 450052)

?

腫瘤基因治療病毒載體相關(guān)研究生物安全問題淺析

張忠獻，王鵬舉，王堯河

(鄭州大學基礎(chǔ)醫(yī)學院、鄭州大學科技部細胞與基因治療國際聯(lián)合研究中心，河南 鄭州 450052)

近年來，腫瘤基因治療無論在科研領(lǐng)域還是在臨床應(yīng)用中都取得突破進展。隨著越來越多的以病毒為載體腫瘤基因治療藥物被批準上市，該領(lǐng)域的研究會快速增長。然而，病毒載體經(jīng)過改造之后，對人類的致病性很弱，使科研工作者很容易忽視其潛在的生物安全風險。本文就常見病毒載體所涉及的生物安全方面的管理規(guī)定及潛在風險進行分析總結(jié)。

基因治療；病毒載體；生物安全

2003年重組人p53腺病毒注射液作為世界上第1個獲準上市的腫瘤基因治療藥在我國上市[1]，至2012年歐洲藥監(jiān)局批準了第1個在西方國家被批準上市的基因治療產(chǎn)品Glybera[2]和2015年美國食品藥品管理局的批準生產(chǎn)的imlygic用于皮膚癌治療等，腫瘤基因治療無論在科研領(lǐng)域還是在臨床應(yīng)用中都取得很多突破進展[3]。病毒載體作為腫瘤基因治療中外源基因?qū)氚屑毎⒂行П磉_從而實現(xiàn)治療疾病的一種非常有效的工具。隨著基礎(chǔ)醫(yī)學和分子病毒學的發(fā)展，人們對病毒載體的進一步改造完善，其在基因治療中發(fā)揮著越來越重要的作用。對病毒載體的不斷優(yōu)化和改良，也在世界各地的實驗室里不間斷進行著。載體中不必要的病毒基因去除可明顯減輕細胞毒性和免疫原性，還可避免產(chǎn)生可復制的病毒顆粒和人體感染病毒的危險。在此基因上，外源基因的定位整合可提高基因治療的效果。然而，病毒載體安全性的提高，更容易讓科研工作者們忽略其潛在的生物安全風險。本文就常見病毒載體的生物安全屬性及其風險進行淺析。

1 常見病毒載體的基本屬性

常見的病毒載體既有非致性的腺相關(guān)病毒載體，也有可引起艾滋病的人類免疫缺陷病毒(HIV)等。各種病毒載體母體的基本生物學特性及致病性見表1[4]。

2 常見病毒載體生物安全管理法律法規(guī)要求

早在基因工程研究領(lǐng)域快速發(fā)展的初期，為促進我國生物技術(shù)的研究與開發(fā)，加強基因工程工作的安全管理，我國就頒布《基因工程安全管理辦法》(國家科委第17號)[5]。至2006年，為加強病原微生物實驗室生物安全管理，規(guī)范病原微生物實驗活動，在《病原微生物實驗室生物安全管理條例》[6]的基礎(chǔ)上，制訂了《人間傳染的病原微生物名錄》[7]，對病原微生物實驗室生物安全管理做了明確的規(guī)定。特別是針對使用人類病毒的重組體作了具體的說明：在新的法規(guī)未出臺的情況下，暫時遵循的原則是：首先，禁止2個不同病原體之間進行完整基因組的重組；其次，對于對人類致病的病毒，如有疫苗株，只允許疫苗株用于外源基因的表達載體；另外，對操作防護條件也提出了明確的要求，具有復制能力的重組活病毒(復制型重組病毒)，要求不低于其母本病毒；復制缺陷型病毒不得低于BSL-2的防護條件。常見病毒載體的生物安全分類見表2。

表1 常見病毒載體基本特性

表2 常見病毒載體的生物安全分類

3 病毒載體科研相關(guān)的生物安全風險分析

病毒載體的實驗室生物安全主要包含病毒載體母體以及載體構(gòu)建實驗或生產(chǎn)過程中使用和誘發(fā)的各類基因片段、重組基因片段。由于生命科學和生物技術(shù)的特殊性，病毒載體母體及各類基因片段一旦進入環(huán)境，就會對人體健康和生態(tài)安全造成潛在威脅。

病毒載體的構(gòu)建及生產(chǎn)，為了開發(fā)更加高效的載體以及引入有治療作用的基因，在分子生物學水平對病毒基因及治療基因進行編輯整合。未轉(zhuǎn)染之前的基因編輯一般在普通實驗室下完成，處理不當或不及時處理，可導致各種基因片段暴露于實驗室。暴露的基因片段為重組提供的模板和可能，如果污染了我們已經(jīng)構(gòu)建好的具有特定療效的新型基因治療產(chǎn)品，那么因為污染有可能造成全部的工作毀于一旦。另外，對環(huán)境的染污還有可能造成潛在有風險的新的微生物的出現(xiàn)。

新構(gòu)建病毒載體療效評價，新的病毒載體構(gòu)建好之后一般先在細胞水平評價體外療效，然后進行動物實驗評價體內(nèi)療效。細胞水平的評價常做的實驗是病毒的殺傷和復制實驗。這2個實驗容易忽視的關(guān)鍵點是感染細胞之后剩余的少量病毒及實驗結(jié)束之后細胞培養(yǎng)板中殘存的病毒。腫瘤病毒基因治療的動物實驗，目前以皮下腫瘤模型為主。瘤內(nèi)注射治療時，由于病毒的注射可以使瘤內(nèi)壓力都加，可導致病毒從瘤內(nèi)射出，造成科研工作人員的面部暴露。動物的掙扎或工作人員出現(xiàn)差錯容易發(fā)生注射針頭刺傷也是很重要的風險因素之一。另外，手術(shù)、取材及尸體處理等都是潛在的風險。

4 防控措施

有針對性開展生物安全知識教育，增強科研工作者的生物安全意識。魏明等[8]調(diào)查某醫(yī)學院本科生動物實驗安全防護知識知曉情況，結(jié)果顯示50.3%醫(yī)學生對動物實驗安全的概念不清，52.3%學生對實驗室感染事件、實驗室安全認識不夠，86.9%學生不了解實驗室生物安全法律法規(guī)。不難看出，實驗室生物安全事故多為人為事故的原因。痘苗病毒作為最常用的載體之一，魏強等[9]通過文獻分析了痘苗病毒實驗室獲得性感染病例的狀況及特征，發(fā)現(xiàn)52.9%病例是在進行動物實驗過程中意外針刺手部而導致感染，70.6%病例感染部位發(fā)生在手部，暴露后平均5.1天出現(xiàn)感染癥狀。僅2例病例在出現(xiàn)意外情況后及時采取了現(xiàn)場沖洗、消毒等應(yīng)急處理措施，及時就醫(yī)，并如實向醫(yī)生說明工作中接觸痘苗病毒情況。多數(shù)病例在發(fā)生意外后，并未采取應(yīng)急措施，麻痹大意、繼續(xù)工作，事后在出現(xiàn)癥狀后方去就診。由于一個實驗室所采用的病毒載體都是確定的，所以其生物安全教育培訓的內(nèi)容就需要有針對性、更詳細。

做好日常防護及應(yīng)急預案。病毒載體的弱致病性，長期致使科研工作者們忽視其生物安全。例如，對腫瘤動物模型進行治療時，帶上防護面具對動物治療，實驗操作的方便程度就會大降低。這也是日常防護難以有效執(zhí)行的一個原因。另外，日常防護用具的選擇也十分重要?，F(xiàn)在市場上各種產(chǎn)品質(zhì)量良莠不齊，高質(zhì)量的防護用具有利于日常防護的執(zhí)行。另外，科研工作者發(fā)生意外后及時進行必要的現(xiàn)場應(yīng)急處置，及時就診并向醫(yī)生提供研究背景信息應(yīng)是預防和控制痘苗病毒實驗室獲得性感染的重要方面。

[1] 關(guān)大剛，鄭旭.重組人p53腺病毒注射液(今又生)臨床研究進展[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學，2011，19(12)：2560-2563.

[2] 石亮，劉云波.腺相關(guān)病毒的特性及應(yīng)用進展[J].醫(yī)學綜述，2016,22(11):2088-2092.

[3] 孫友松.2015年10月美國和歐盟新批準藥物概述[J].藥學進展，2015,39(10):794-800.

[4] 黃文林,徐志凱,董小平.分子病毒學[M].北京：人民衛(wèi)生出版社,2016:384-388.

[5] 基因工程安全管理辦法[J].中華醫(yī)學雜志,1994,74(9):577-580.

[6] 病原微生物實驗室生物安全管理條例[J].畜牧獸醫(yī)科技信息,2004,(12):19-21.

[7] 衛(wèi)生部關(guān)于印發(fā)《人間傳染的病原微生物名錄》的通知[J].中華人民共和國衛(wèi)生部公報,2006,(2):32-52.

[8] 魏明,倪嘉莉,趙冬,等.醫(yī)學院本科生動物實驗安全防護知識調(diào)查[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生,2013,29(15):2296-2297.

[9] 魏強，盧選成，武桂珍.痘苗病毒實驗室獲得性感染病例的狀況及特征分析[J].中華實驗和臨床病毒學雜志,2013,27(1):73-75.

張忠獻(1984-)，男，碩士，助理實驗師，主要從事細胞與基因治療相關(guān)研究。E-mail：zhzhx110@126.com

王堯河(1965-)，男，博士，教授，主要從事細胞與基因治療相關(guān)研究。E-mail：yaohewang@zzu.edu.cn

10.3969/j.issn.1673-5412.2016.05.029

R730.54

A

1673-5412(2016)05-0456-03

2016-01-22)