馬書杰，嚴雋陶，陶然，陸永嘉，王春紅，潘俊峰，馬穎，周帆，鮑嘉敏，符利娟

推拿手法聯(lián)合跑臺訓練促進大鼠坐骨神經(jīng)再生的效果①

馬書杰1,2，嚴雋陶1，陶然2，陸永嘉1，王春紅1，潘俊峰1，馬穎1，周帆1，鮑嘉敏2，符利娟2

目的 探討推拿手法聯(lián)合跑臺訓練對坐骨神經(jīng)橫斷傷外膜修復后促進神經(jīng)再生的效應及途徑。方法 96只Sprague-Daw ley大鼠隨機分為正常對照組、縫合對照組和縫合手法組，每組32只。后兩組建立坐骨神經(jīng)橫斷傷外膜縫合模型，縫合手法組給予捻揉手法及跑臺訓練，每天1次。分別于干預后2、3、4、8周各組取8只大鼠檢測坐骨神經(jīng)傳導速度、再生神經(jīng)軸突數(shù)及施萬細胞數(shù)。結果 與縫合對照組比較，縫合手法組坐骨神經(jīng)傳導速度在干預后4周、8周加快(P＜0.05)，軸突數(shù)目在2周、4周時有顯著性差異(P＜0.05)；施萬細胞數(shù)無顯著性差異(P＞0.05)。結論 推拿手法聯(lián)合跑臺訓練可促進損傷的周圍神經(jīng)再生。

推拿；跑臺；神經(jīng)再生；坐骨神經(jīng)；傳導速度；大鼠

[本文著錄格式] 馬書杰，嚴雋陶，陶然，等.推拿手法聯(lián)合跑臺訓練促進大鼠坐骨神經(jīng)再生的效果[J].中國康復理論與實踐, 2016,22(11):1276-1280.

CITED AS:Ma SJ,Yan JT,Tao R,etal.Effects of Tuina combined with treadmill training on regeneration of sciatic nerve in rats[J]. Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2016,22(11):1276-1280.

周圍神經(jīng)損傷臨床發(fā)病率高。由于神經(jīng)再生速度緩慢，平均1mm/d，當神經(jīng)纖維長入失神經(jīng)肌肉時，肌肉往往已發(fā)生纖維化，再生神經(jīng)纖維無法形成有效神經(jīng)-肌肉接頭，導致肢體功能喪失。促進神經(jīng)再生，提高神經(jīng)再生速度是肢體功能恢復的重要前提。施萬細胞(Schwann cells,SCs)是周圍神經(jīng)特有的膠質細胞。神經(jīng)損傷后，施萬細胞分裂增殖并分泌多種活性物質，與神經(jīng)再生關系密切。神經(jīng)縫合后的康復治

療是促進神經(jīng)再生、肢體功能恢復的重要手段。傳統(tǒng)中醫(yī)推拿手法及主動運動是十分重要的神經(jīng)康復方法，被廣泛應用于臨床。本研究探討推拿手法聯(lián)合跑臺訓練促進神經(jīng)再生的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級雄性Sprague-daw ley大鼠96只，體質量180～220 g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學動物實驗中心，6只/籠，自由飲水，室溫18℃，濕度40%～50%。

采用SPSS 19.0軟件隨機分為正常對照組(n=32)、縫合對照組(n=32)、縫合手法組(n=32)。每組再分為造模后2周、3周、4周、8周4個亞組，每亞組8只。

1.2 主要試劑及儀器

10%水合氯醛：上海西唐生物科技有限公司。石蠟、甲醛、氨水、二甲苯、無水乙醇、30%H2O2：上海國藥集團。光譜二抗、DBA濃縮試劑盒、中性樹脂、蘇木精：上海長島生物科技有限公司。CX41正置顯微鏡：OLYMPUS公司。SQ2125石蠟切片機：徠克公司。IMS圖像分析系統(tǒng)：基爾頓生物科技(上海)有限公司。D5100數(shù)碼相機：NIKON公司。自制手法模擬儀(與復旦大學共同研制)。RM-6240BD多道生理信號處理系統(tǒng)、YLS-15A大鼠轉輪式跑步機：成都儀器廠。

1.3 動物造模

采用坐骨神經(jīng)橫斷傷立即縫合模型?？p合對照組和縫合手法組以10%水合氯醛3m l/kg腹腔注射麻醉，備皮，俯臥位固定于手術臺。距右側坐骨結節(jié)下方約0.5 cm處沿坐骨神經(jīng)走行，無菌條件下切開，于臀肌間顯露坐骨神經(jīng)干，彎頭組織鑷10倍顯微鏡下鈍性分離，梨狀肌下緣1 cm處整齊切斷坐骨神經(jīng)干，立即在外科顯微鏡下用11-0縫合線以神經(jīng)表面血管走行為標志行神經(jīng)外膜縫合。傷口灑入適量注射用青霉素鈉粉劑，1號縫合線縫合皮膚3～4針，碘伏消毒。

1.4 干預方法

術后3周為造模成功時間。模型對照組和正常對照組不作任何干預，縫合手法組進行以下干預。

①采用自制推拿手法模擬儀進行捻揉法模擬手法治療。手法參數(shù)：壓力0.45 N，120/m in，共5m in。②采用YLS-15A大鼠轉輪式跑步機進行主動訓練，主動運動參數(shù)：0.65m in/轉，5轉/m in，共5m in。

以上干預均每天1次，于上海中醫(yī)藥大學動物實驗中心完成。

1.5 檢測指標

各組于造模成功后2、3、4、8周各取8只大鼠行以下指標檢測。

1.5.1 大體觀察

觀察術后切口情況、肌肉萎縮程度、右下肢活動能力、步態(tài)變化及足趾潰瘍等。

1.5.2 坐骨神經(jīng)傳導速度

采用RM-6240BD四通道生理記錄儀，采集頻率100 kHz，掃描速度0.8ms/格，靈敏度4mV，時間常數(shù)0.2 s；頻波頻率100 Hz，刺激電壓1 V，波寬0.1 ms。將刺激電極正負極平行插入坐骨結節(jié)下方坐骨神經(jīng)走行兩側，兩針約距1 cm；兩對記錄電極分別置于腘窩處和跟腱處神經(jīng)走行兩側；地線位于刺激電極和腘窩處記錄電極之間。兩對記錄電極的距離/動作電位出現(xiàn)的時間差即為神經(jīng)傳導速度。每只大鼠測3次，取平均值。

1.5.3 坐骨神經(jīng)軸突計數(shù)

神經(jīng)傳導速度測定結束后，處死各組大鼠，取出右側坐骨神經(jīng)斷端下神經(jīng)組織1 cm，石蠟包埋后切片。行HE染色。高倍鏡下每標本取5個視野，HPIAS-1000病理圖像分析系統(tǒng)記錄視野內坐骨神經(jīng)軸突數(shù)。

1.5.4 施萬細胞計數(shù)

石蠟切片采用SP-9003試劑盒(美國ZYMED公司) 行S-100免疫組織化學染色。用HPIAS-1000病理圖像分析系統(tǒng)400倍鏡下每標本取5個視野行自動盲測，計數(shù)視野內陽性細胞數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 18.0軟件包進行數(shù)據(jù)分析與處理。計量資料以(±s)表示，采用單因素方差分析。顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 大體觀察

手術過程中除大鼠麻醉意外死亡(由備用大鼠補齊)外，神經(jīng)修復術后全部動物存活。大鼠手術側早期出現(xiàn)失神經(jīng)支配表現(xiàn)，部分足部皮膚發(fā)紅，少數(shù)足趾腫脹，1周左右傷口愈合，傷口無感染。術后1～3周，各組均有大鼠出現(xiàn)不同程度足底潰瘍、噬趾及踝關節(jié)不同程度僵硬、跖屈功能受限，坐骨神經(jīng)支配區(qū)出現(xiàn)肌肉萎縮，右下肢跛行步態(tài)。足部潰瘍經(jīng)百多邦外用后明顯好轉。至8周時，各組大鼠潰瘍均愈合，

術側肌萎縮明顯減輕，跛行步態(tài)減輕，踝關節(jié)功能活動不同程度恢復。

2.2 坐骨神經(jīng)傳導速度

縫合對照組和縫合手法組坐骨神經(jīng)傳導速度均較正常對照組下降(P＜0.05)，縫合手法組4周、8周時坐骨神經(jīng)傳導速度快于縫合對照組(P＜0.05)?？p合手法組坐骨神經(jīng)傳導速度呈逐漸上升趨勢，縫合對照組則呈逐漸下降趨勢。見表1。

表1 各組造模后坐骨神經(jīng)傳導速度比較(m/s)

2.3 坐骨神經(jīng)軸突計數(shù)

縫合對照組和縫合手法組坐骨神經(jīng)軸突數(shù)均高于正常對照組(P＜0.05)，總體呈逐漸下降趨勢?？p合手法組坐骨神經(jīng)軸突數(shù)在4周之前迅速下降，4～8周時保持平穩(wěn)；而對照組在4周以前保持穩(wěn)定，8周時出現(xiàn)下降。見表2。

表2 各組造模后坐骨神經(jīng)軸突計數(shù)比較

2.4 施萬細胞計數(shù)

縫合對照組和縫合手法組坐骨神經(jīng)施萬細胞數(shù)均有高于正常對照組的趨勢，但除3周時外(P＜0.05)，均無顯著性差異。見表3。

表3 各組造模后坐骨神經(jīng)施萬細胞計數(shù)比較

3 討論

本研究顯示，推拿手法聯(lián)合跑臺訓練能加快周圍神經(jīng)損傷修復后大鼠坐骨神經(jīng)傳導速度，達到正常速度的72.6%。其發(fā)揮作用的機制可能是通過調節(jié)坐骨神經(jīng)軸突的再生與退變，促進神經(jīng)再生并沿正確的方向生長延伸。

手法聯(lián)合跑臺訓練還能夠促進施萬細胞增殖，雖然除個別時間點外均沒有統(tǒng)計學意義，但能使施萬細胞數(shù)長時間維持在較縫合對照組更高水平，有利于神經(jīng)修復后的再生及再生神經(jīng)髓鞘化，從而可能促進神經(jīng)傳導功能的恢復。

周圍神經(jīng)損傷為臨床常見病。2.8%創(chuàng)傷患者受周圍神經(jīng)損傷影響，部分患者甚至因此而終身殘疾[1]。促進神經(jīng)再生是周圍神經(jīng)損傷治療的重要方面[2]，除了藥物和顯微外科手術修復外，運動訓練也是重要手段。無論是否手術，指導患者進行正確、適當?shù)倪\動康復訓練都是促進受損神經(jīng)再生、恢復肢體功能的有效方法[3]，包括被動活動和主動活動(助力運動、抗阻運動、等速運動等)[4]。近年來的研究表明，推拿能促進肌衛(wèi)星細胞分裂增殖、調節(jié)生肌相關因子的表達[5-6]，并早期促進快肌纖維恢復，改善失神經(jīng)支配后骨骼肌結構形態(tài)，延緩失神經(jīng)骨骼肌萎縮[7]。推拿可促進周圍神經(jīng)損傷后行為學、形態(tài)學恢復[8]，并通過促進內源性因子及相關蛋白表達，促進神經(jīng)再生及功能恢復[9-10]?？祻陀柧毮艽龠M有髓神經(jīng)纖維再生[11-12]，對于促進感覺和運動功能恢復有積極作用[13-14]。

神經(jīng)傳導速度可以反映周圍神經(jīng)的功能狀態(tài)。神經(jīng)損傷后神經(jīng)傳導性受損，表現(xiàn)為神經(jīng)傳導速度減慢或消失[15-18]。本研究顯示，神經(jīng)損傷修復后，坐骨神經(jīng)傳導速度明顯減弱；手法及運動訓練后，坐骨神經(jīng)傳導速度明顯恢復。坐骨神經(jīng)傳導速度的提高，提示神經(jīng)修復后軸突再生，并有部分到達終末，對靶器官進行再支配。

周圍神經(jīng)損傷后，軸突近斷端形成生長錐；生長錐發(fā)出許多細小神經(jīng)軸絲，逐漸向遠端延伸，這是神經(jīng)軸突再生的基礎。研究顯示，再生軸絲在達到損傷區(qū)域前的生長速度很慢，約為0.2mm/d；而一旦進入遠端神經(jīng)，生長速度則可達2～3mm/d[19]。到達終末結構的軸絲越多，神經(jīng)功能恢復也越好[20]。本研究顯示，神經(jīng)縫合后，坐骨神經(jīng)軸突計數(shù)升高，提示神經(jīng)進入再生階段，軸絲增多，并通過神經(jīng)縫合口向遠端生長。但與對照組坐骨神經(jīng)軸突數(shù)4周以前一直保持穩(wěn)定，第8周出現(xiàn)下降不同，手法及運動訓練后，大鼠坐骨神經(jīng)軸突數(shù)在第2周之后就出現(xiàn)下降，第4周又有回升趨勢。我們推測，手法及運動訓練在2周以前能促進軸突生芽，增加軸絲數(shù)目，而在2周以后，則加速不能正常長入遠端神經(jīng)鞘膜管或錯配的神經(jīng)軸絲退化萎縮，使軸突數(shù)減少；4周后，又有新的神經(jīng)纖維再生，軸突數(shù)出現(xiàn)上升趨勢。

施萬細胞是周圍神經(jīng)系統(tǒng)中特有的一類神經(jīng)膠質細胞，與神經(jīng)再生關系密切。諸多研究表明，其增殖、遷移、分泌在神經(jīng)再生過程中起關鍵作用[21]，不僅能夠形成Bungner帶，并且能分泌多種生物活性物質[22]，構建周圍神經(jīng)再生的微環(huán)境，引導和支持神經(jīng)再生[23]。施萬細胞在周圍神經(jīng)損傷后修復過程中的促進作用隨著時間的延長而逐漸降低[24]。促進施萬細胞增殖、遷移和分泌，延長損傷遠端失神經(jīng)施萬細胞支持神經(jīng)再生功能的時間，是促進周圍神經(jīng)損傷后神經(jīng)再生和功能恢復的重要途徑。本研究顯示，神經(jīng)顯微修復后3～8周，施萬細胞數(shù)一直穩(wěn)定保持在較高水平；在此期間，手法組施萬細胞數(shù)有持續(xù)高于對照組的趨勢，提示手法及運動訓練有可能促進施萬細胞增殖。施萬細胞的增殖，可為新生神經(jīng)軸漿轉運提供良好環(huán)境，促進再生軸突沿著正確的方向生長，加速神經(jīng)軸突直徑增大、髓鞘厚度增加，提高坐骨神經(jīng)傳導速度。

本研究觀察時間僅為2個月，而坐骨神經(jīng)損傷后肢體功能恢復尚需較長時間，目前的結果尚不能全面顯示推拿聯(lián)合跑臺訓練在促進周圍神經(jīng)損傷再生中的作用。運動訓練對周圍神經(jīng)損傷功能恢復的效果一直存在某些爭議，焦點是運動訓練所采取的負荷強度，如果負荷不當可能對周圍神經(jīng)功能產生不良影響[25]。由于每個研究采用的訓練方式不同，運動負荷有其臨界點，運動量超過臨界點時可能妨礙神經(jīng)再生并導致肌肉損傷，未達到臨界點時可促進運動功能的恢復和神經(jīng)再生[26-27]。另外，周圍神經(jīng)損傷后的再生機制復雜，包括神經(jīng)胞體的存活、炎癥免疫反應、沃勒變性的程度、神經(jīng)損傷局部的微循環(huán)以及神經(jīng)再生的微環(huán)境等。推拿及運動訓練促進神經(jīng)損傷后神經(jīng)再生及肢體功能恢復的機制研究仍然任重而道遠。

我們在今后的研究中，將增加動物數(shù)量，設置不同的運動量，從宏觀角度觀察推拿聯(lián)合康復訓練促進神經(jīng)損傷后肢體功能恢復的影響，并從微觀角度深入研究，從電生理、分子水平及基因水平研究其作用機制。運動對施萬細胞的長期確切效應，也是今后研究的重要內容。

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Effectsof Tuina Combined with Treadm ill Training on Regeneration of Sciatic Nerve in Rats

MA Shu-jie1,2,YAN Jun-tao1,TAO Ran2,LU Yong-jia1,WANG Chun-hong1,PAN Jun-feng1,MA Ying1,ZHOU Fan1, BAO Jia-min2,FU Li-juan2
1.Yueyang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine,Shanghai University of Traditonal ChineseMedicine,Shanghai200437,China;2.Schoolof Rehabilitation Science,ShanghaiUniversity of TraditonalChineseMedicine,Shanghai201203,China

Objective To explore the effectof Tuina combined with treadm ill training on nerve regeneration after sciatic nerve transection.Methods Ninty-six Sprague-Daw ley ratswere random ly divided into normal group(n=32),model group(n=32)and treatment group (n=32).The sciatic nervewas transected and the epineurium was sutured in the latter two groups.The treatmentgroup was given Tuinamanipulation and treadm ill training once a day.Eight rats from each group were detected their sciatic nerve conduction velocity(NCV),the number of axonsand Schwann cells(SCs)two,three,four and eightweeksafter intervention.Results Compared with themodelgroup,the NCV accelerated in the treatmentgroup fourand eightweeksafter intervention(P＜0.05);while the numberof axonswas significantly different two and fourweeks after intervention(P＜0.05),and the numberof SCswas notvery differentbetween the treatmentgroup and themodel group after intervention(P＞0.05).Conclusion Tuina combined with treadmill trainingmay promote the regeneration of peripheral nerve after injury in rats.

Tuina;treadmill;neuranagenesis;sciatic nerve;conduction velocity;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2016.11.007

R745.4

A

1006-9771(2016)11-1276-05

2016-04-06

2016-06-24)

1.國家自然科學基金面上項目(No.30973806；No.81373764)；2.國家自然科學基金青年基金項目(No.81603713)。

1.上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結合醫(yī)院推拿科，上海市200437；2.上海中醫(yī)藥大學康復醫(yī)學院，上海市201203。作者簡介：馬書杰(1986-)，女，漢族，河北邢臺市人，博士，博士后，主要研究方向：傳統(tǒng)康復促進周圍神經(jīng)再生及防治失神經(jīng)骨骼肌萎縮的基礎研究與臨床應用。通訊作者：嚴雋陶，男，主任醫(yī)師、教授，博士研究生導師。E-mail:doctoryjt@sohu.com。