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        miRNA-338促進施萬細胞成髓鞘*

        2021-06-30 17:14:00周松林謝慧敏杜明智楊述海韓笑笑
        交通醫(yī)學(xué) 2021年3期

        周松林,劉 暢,謝慧敏,杜明智,楊述海,韓笑笑,于 彬

        (1南通大學(xué)江蘇省神經(jīng)再生重點實驗室,江蘇226001;2南通大學(xué)附屬醫(yī)院口腔科;3南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院)

        微小RNA(microRNA,miRNA)是一類物種之間高度保守、長度為19~25個核苷酸、不編碼蛋白質(zhì)的單鏈RNA分子。miRNA在RNA聚合酶Ⅱ作用下形成初級miRNA,經(jīng)核糖核酸酶作用得到前體miRNA,最后在Dicer酶剪切下成為成熟miRNA。miRNA可以通過抑制翻譯或轉(zhuǎn)錄水平來調(diào)控靶基因的表達,參與細胞分化、生長、增殖調(diào)控等重要生命活動過程[1]。已發(fā)現(xiàn)在周圍神經(jīng)損傷后大量miRNAs存在差異表達,在調(diào)節(jié)施萬細胞表型中發(fā)揮重要作用[2]。

        施萬細胞是周圍神經(jīng)系統(tǒng)主要的膠質(zhì)細胞,在周圍神經(jīng)發(fā)育、功能和再生中起著重要作用,能沿神經(jīng)突起形成髓鞘。周圍神經(jīng)損傷后施萬細胞發(fā)生一系列的表型變化,如脫髓鞘和去分化[3]。神經(jīng)再生過程中施萬細胞先去分化為施萬細胞祖細胞,祖細胞在短時間內(nèi)分裂、分化、增殖,生成大量施萬細胞,參與髓鞘碎屑吞噬和Bunger帶的形成,進而引導(dǎo)神經(jīng)再生過程。

        目前已發(fā)現(xiàn)miRNA與中樞及周圍神經(jīng)損傷和修復(fù)密切相關(guān)。脊髓損傷后miR-21顯著上調(diào),通過靶向促凋亡基因Fas配體(FasL)、人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(PTEN)和程序性死亡蛋白4(PDCD4),在限制繼發(fā)細胞死亡方面發(fā)揮重要作用[4]。miR-124在脊髓損傷時顯著升高,可作為診斷脊柱創(chuàng)傷后急性脊髓損傷的潛在標志物。另外,miRNAs促進施萬細胞的再分化與髓鞘形成而修復(fù)神經(jīng)。在體外施萬細胞與背根神經(jīng)節(jié)細胞共培養(yǎng)時,miR-30c可促進周圍神經(jīng)損傷后施萬細胞髓鞘形成[5]。miR-221-3p通過下調(diào)對施萬細胞髓鞘形成至關(guān)重要的NGF1-A結(jié)合蛋白1(Nab1),抑制施萬細胞的髓鞘形成,miR-221-3p也可促進坐骨神經(jīng)損傷后施萬細胞的增殖和遷移[6]。目前發(fā)現(xiàn)miR-338在很多腫瘤中,如肝癌、黑色素瘤中呈低表達。本文主要研究miR-338對周圍神經(jīng)損傷及再生過程中施萬細胞髓鞘形成的影響,尋求周圍神經(jīng)損傷的新治療策略。

        1 材料與方法

        1.1 主要材料和試劑 成年雄性Sprague-Dawley大鼠30只,體重180 g(南通大學(xué)實驗動物中心提供)。TRizol試劑(Invitrogen公司,美國),RT試劑(TaKaRa,中國),SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa,中國),Taqman miRNA檢測試劑盒(Life Technologies公司,美國),Ⅰ型膠原酶(Sigma公司,美國),Neurobasal培養(yǎng)基(Thermo Fisher Scientific公司,美國),神經(jīng)生長因子(NGF)(RD Systems公司,美國),L-glu(Invitrogen公司,美國),anti-S100(DAKO公司,美國),Lipofectamine RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen公司,美國),B27補充劑(Thermo Fisher Scientific公司),粘連蛋白(Invitrogen公司,美國),聚L賴氨酸(Sigma公司),Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)(Sigma公司),抗壞血酸(Sigma公司),Triton X-100(Sigma公司),胎牛血清(Sigma公司),miR-338 agomir、miR-338 antagomir及對照(銳博,中國)。

        1.2 實驗方法

        1.2.1 大鼠坐骨神經(jīng)夾傷模型:大鼠經(jīng)復(fù)合麻醉劑(0.3 mL/100g)腹腔麻醉后,側(cè)臥位固定,常規(guī)備皮、消毒。沿左側(cè)股骨作1 cm切口,暴露坐骨神經(jīng)。無齒鑷鉗夾坐骨神經(jīng)3次,擠壓寬度3 mm,每次10 s,間隔10 s。

        1.2.2 RT-qPCR檢測miRNA表達量:以Trizol法勻漿提取受損傷坐骨神經(jīng)總RNA,隨后使用Prime-Script RT試劑盒反轉(zhuǎn)錄,Taqman miRNA檢測試劑盒進行miRNA檢測。

        1.2.3 施萬細胞原代培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染:取1日齡SD大鼠,在后肢外側(cè)切開皮膚,暴露坐骨神經(jīng),取出約8 mm長坐骨神經(jīng)。經(jīng)胰蛋白酶消化,分離施萬細胞,再用抗Thy1.1抗體和兔補體去除成纖維細胞。以施萬細胞特異性標記物anti-S100進行免疫染色,最終得到純度接近95%的施萬細胞。將施萬細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM(DMED+10%FBS+1%PS)。使用Lipofectamine RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑分別將miR-338 agomir(20 mmol/L)、agomir-negative control(20 mmol/L)、miR-338 antagomir(100 mmol/L)和antagomir negative control(100 mmol/L)轉(zhuǎn)染施萬細胞。

        1.2.4 施萬細胞-背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元共培養(yǎng):從SD大鼠14.5天胚胎中剝離背根神經(jīng)節(jié)(DRG),將單個DRG轉(zhuǎn)移到無Ca2+/Mg2+的Hank’s緩沖液中。24孔板預(yù)先用多聚L賴氨酸和10 mg/mL層粘連蛋白包被。以0.1%Ⅰ型膠原酶和0.25%胰蛋白酶將DRG消化至單細胞后,重懸于Neurobasal培養(yǎng)基,添加B27補充劑(1∶50)、100 ng/mL神經(jīng)生長因子和L-glu(1∶100)。用尿苷(10 nmol/L)和氟脫氧尿苷(10 nmol/L)處理細胞2次,每次48 h,去除非神經(jīng)元細胞。在與神經(jīng)元共培養(yǎng)前,將miR-338 agomir、miR-338 antagomir轉(zhuǎn)染到施萬細胞中,轉(zhuǎn)染后施萬細胞置于含5%胎牛血清和100 ng/mL NGF的DMEM中,培養(yǎng)2 d,以幫助施萬細胞在DRG突起上粘附。7 d后添加50μg/mL抗壞血酸誘導(dǎo)髓磷脂形成,每2 d重新添加含有抗壞血酸的新鮮培養(yǎng)基維持培養(yǎng)。

        1.2.5 免疫熒光染色:收集共培養(yǎng)的DRG和施萬細胞,4%多聚甲醛室溫固定25 min,0.1%Triton X-100通透10 min,5%BSA室溫封閉30 min,加一抗anti-MBP在4℃過夜,二抗Cy3-conjugated sheep antirabbit IgG在室溫下放置2 h。使用Leica DMi8倒置熒光顯微鏡拍攝照片。

        1.2.6 芯片檢測分析:使用mirVanaTM miRNA分離試劑盒、BioAnalyer 210生物分析儀和NanoDrop ND-1000分光光度計分別進行提取總RNA、質(zhì)檢和量化。Agilent mRNA芯片由上海歐易公司進行標記和雜交,采用安捷倫掃描控制軟件掃描芯片的照片,安捷倫分析軟件進行圖像分析,GeneSpring進行微陣列數(shù)據(jù)解讀和初步分析。

        2 結(jié) 果

        2.1 RT-qPCR定量測定受損傷坐骨神經(jīng)miR-338表達量 坐骨神經(jīng)橫斷后miR-338表達水平迅速下調(diào),在第4天達到最低水平,在第7天、14天逐漸增加,表明miR-338在損傷后急性期下調(diào),然后在再生期緩慢恢復(fù)到正常水平。見圖1。

        圖1 實時熒光定量PCR檢測miR-338表達

        2.2 miR-338促進施萬細胞再分化 miR-338 agomir處理的施萬細胞再分化為髓鞘的效果明顯增強,而miR-338 antiagomir處理的施萬細胞再分化為髓鞘明顯減少,表明過表達miR-338可促進施萬細胞再分化為髓鞘,miR-338可能在髓鞘形成過程中具有積極作用。見圖2。

        2.3 過表達miR-338對施萬細胞轉(zhuǎn)錄組的影響 通過熱火圖對過表達miR-338后施萬細胞中的差異基因進行聚類,發(fā)現(xiàn)463個上調(diào)基因和194個下調(diào)基因。通過基因本體(gene ontology,GO)數(shù)據(jù)庫對上調(diào)基因行使的分子功能和參與的生物學(xué)過程進行聚類,發(fā)現(xiàn)差異上調(diào)基因功能富集最顯著的GO與髓鞘形成相關(guān)。見圖3。

        3 討 論

        圖2 miR-338促進施萬細胞髓鞘形成

        日常生活中神經(jīng)損傷非常普遍,中樞神經(jīng)再生能力有限,而周圍神經(jīng)具有一定的再生能力。研究表明,miRNAs能通過調(diào)控施萬細胞而重塑再生微環(huán)境。miR-34a和miR-140是施萬細胞增殖和髓鞘形成的重要功能調(diào)控因子[7];miR-338能夠調(diào)控軸突定位的COXIV,導(dǎo)致線粒體活性下降。通過測量細胞耗氧量和ATP水平的降低,確定miR-338存在于軸突之中[8]。我們先前的研究發(fā)現(xiàn)miR-9通過直接靶向CTHRC1的3’-UTR而顯著下調(diào)CTHRC1表達,從而調(diào)控施萬細胞的遷移作用[9];miR-221/222通過靶向長壽保證同源物2(LASS2)促進雪旺細胞的增殖和遷移[10];miR-3075靶向接觸蛋白2(CNTN2)抑制施萬細胞的遷移;miR-sc3通過靶向星形肌動蛋白1(astrotactin1,ASTN1)來促進施萬細胞的增殖和遷移,而miR-sc4和miR-sc8通過靶向周期蛋白依賴性激酶5激活因子1(CDK5R1)和表皮生長因子受體(EGFR)來抑制施萬細胞的增殖和遷移[11]。let-7和miR-9分別通過靶向人軸突生長誘向因子1(Ntn1)和結(jié)直腸癌缺失基因(DCC),確保受損軸突朝著正確方向增殖[12]。孤兒核受體3(NR4A3)是PI3K-mTOR通路的負調(diào)控因子,miR-20a通過靶向NR4A3促進體外DRG神經(jīng)元的神經(jīng)突生長和體內(nèi)損傷后的軸突再生[13]。另外,miRNAs可調(diào)控少突膠質(zhì)細胞的分化和髓鞘形成過程[14]。目前發(fā)現(xiàn)miRNA的加工是促進少突膠質(zhì)細胞正常分化和髓鞘形成所必需的[15]。miR-338和miR-219對少突膠質(zhì)細胞分化具有疊加作用,并且是髓鞘完整形成所必需的[16]。

        圖3 過表達miR-338對施萬細胞轉(zhuǎn)錄組的影響

        以前有研究證實miR-338可促進中樞少突膠質(zhì)細胞成髓鞘[17],但miR-338在周圍神經(jīng)系統(tǒng)中的作用尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn),在SD大鼠坐骨神經(jīng)損傷后miR-338促進施萬細胞成髓鞘,通過分析坐骨神經(jīng)橫斷后不同時間點的近端神經(jīng)殘段,發(fā)現(xiàn)miR-338表達量先下調(diào),第4天后表達量逐漸上調(diào),表明miR-338在神經(jīng)損傷后的再生中可能發(fā)揮作用。原代培養(yǎng)的施萬細胞與DRG神經(jīng)元共培養(yǎng)試驗顯示,過表達miR-338促使施萬細胞的髓鞘形成,過表達miR-338后差異基因功能富集最顯著的GO與髓鞘形成有關(guān)。miR-338可以促進施萬細胞再分化,有助于更好了解miRNAs在神經(jīng)再生中的調(diào)控作用,為神經(jīng)損傷的治療提供新的途徑。

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