梅愛華，李宏文，王婷梅，劉冬先，鄧云華

Hailey-Hailey病四個(gè)家系的ATP2C1基因突變分析

梅愛華，李宏文，王婷梅，劉冬先，鄧云華

目的檢測(cè)Hailey-Hailey?。℉HD）4個(gè)家系的致病基因ATP2C1，鑒定其突變位點(diǎn)和突變類型。方法采集4個(gè)HHD家系成員共9例患者和6名正常人，與100名無關(guān)健康對(duì)照者外周靜脈血各2 ml，提取全基因組DNA。運(yùn)用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增ATP2C1基因的全部28個(gè)外顯子及其側(cè)翼內(nèi)含子序列，擴(kuò)增產(chǎn)物純化后進(jìn)行DNA直接測(cè)序，BLAST比對(duì)分析其突變位點(diǎn)和突變方式。結(jié)果在9例HHD患者中共檢出了3個(gè)ATP2C1基因致病突變：c.888_889insT（p.296TfsX2）、c.1330delC（p.443QfsX33）和c.2416C＞T（p.Arg806X）。在4個(gè)HHD家系的6名正常者和100名健康對(duì)照者中均未發(fā)現(xiàn)上述突變。結(jié)論在9個(gè)HHD家系患者中存在2個(gè)移碼突變（c.888_889insT 和c.1330delC）及1個(gè)無義突變（c.2416C＞T），其中2個(gè)移碼突變?yōu)槭状螆?bào)道。這些突變的發(fā)現(xiàn)有助于HHD的診斷，并豐富了HHD相關(guān)ATP2C1突變數(shù)據(jù)庫。

Hailey-Hailey病；突變分析；ATP2C1基因；DNA測(cè)序

梅愛華

Hailey-Hailey病（Hailey-Hailey disease，HHD；OMIM 169600），又稱家族性慢性良性天皰瘡，是一種常染色體顯性遺傳性皮膚病[1,2]。其致病基因ATP2C1編碼人類高爾基體分泌途徑Ca2+/Mn2+-ATP酶蛋白1(hSPCA1)[2,3]。它的突變會(huì)導(dǎo)致鈣離子依賴的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常，從而引起棘層細(xì)胞間黏附功能的喪失。HHD臨床特征為青少年時(shí)期在腋窩和腹股溝等褶皺部位反復(fù)發(fā)生紅斑、水皰、糜爛和浸漬性皮損，常對(duì)稱分布[1-5]。2013年4月－2015年2月，筆者于皮膚科門診收集到4個(gè)不同HHD家系、共9例HHD患者，在獲得遺傳學(xué)研究的知情同意后，對(duì)這4個(gè)HHD家系進(jìn)行了ATP2C1基因突變分析。

1　資料與方法

1.1臨床資料

家系1先證者，男，32歲。15歲開始在雙側(cè)腹股溝部發(fā)生紅斑、水皰伴瘙癢，皮損逐漸擴(kuò)延至雙側(cè)腋窩及腰周圍（圖1a）。3代家系中，母親和外祖母均有類似疾病。

家系2先證者，男，65歲。18歲開始在雙側(cè)腹股溝部出現(xiàn)小片狀紅斑、糜爛伴癢痛感，后漸發(fā)展至雙側(cè)腋窩。3代家系中，一子和一孫均有類似疾病，癥狀均較重（圖1b）。

家系3先證者，女， 22歲。19歲開始在雙側(cè)股根處部出現(xiàn)小片浸漬紅斑伴癢，后在腋窩、乳房下皺褶處出現(xiàn)類似皮損（圖1c）。三代家系中，父親和祖母患有類似疾病。

家系4先證者，男，28歲。17歲開始在雙側(cè)股根處發(fā)生紅斑、斑塊、浸漬伴癢痛感，皮損面積逐漸擴(kuò)大，且在雙側(cè)腋窩部出現(xiàn)類似皮損（圖1d）。3代家系中，母親和外祖父患有類似疾病。

4個(gè)家系先證者均有典型的臨床皮損。皮損組織病理學(xué)示：表皮內(nèi)程度不一的棘層松解，部分呈“坍塌磚墻”樣（圖1e,1f）。結(jié)合病史、臨床表現(xiàn)以及皮損組織病理學(xué)檢查結(jié)果診斷為Hailey-Hailey病。

1.2方法

1.2.1外周血DNA提取抽取4個(gè)家系中共9例患者和6名正常人與100名無關(guān)健康對(duì)照者外周血各2 ml，2%EDTA抗凝。采用QIAGEN?全血基因組DNA提取試劑盒（QIAGEN，德國）提取所有標(biāo)本的基因組DNA。

1.2.2ATP2C1的DNA序列擴(kuò)增根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中基因ATP2C1的DNA序列（NC_000003.12）及PCR引物設(shè)計(jì)原則，采用軟件Primer 5.0 設(shè)計(jì)特異性引物，共28對(duì)。所有引物委托上海生工生物工程股份有限公司合成。PCR 擴(kuò)增采用Touch-down反應(yīng)程序進(jìn)行。部分引物序列如下：P11 F：TGTGAGTATGCACAGCATTCA，R：T G G G C T C C AT G TA ATA G T G AT C T；P16 F：CCAGCCAACCTAGTTACAAG，R C T A A A C C C A A A G G T G G A C A G；P 2 5 F：C A G C TAT T C A C TA G G T G AT T，R：CACTCTACTCAAGTGAGTCA。

1.2.3擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序及分析純化后的PCR產(chǎn)物送至北京諾賽基因組研究中心有限公司采用ABI 3730全自動(dòng)DNA測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。應(yīng)用Chromas軟件進(jìn)行讀圖分析，其結(jié)果運(yùn)用BLAST軟件與標(biāo)準(zhǔn)ATP2C1序列（NM_001001487）進(jìn)行比對(duì)分析。

圖1　Hailey-Hailey病4個(gè)家系先證者典型臨床及組織病理表現(xiàn)

2　結(jié)果

家系1中患者 DNA測(cè)序結(jié)果顯示：在ATP2C1基因的第16號(hào)外顯子存在第1330位堿基C缺失：c.1330delC（p.443QfsX33）（圖2a），該突變可引起mRNA在翻譯過程中出現(xiàn)移碼，從而導(dǎo)致翻譯提前終止形成截短蛋白。家系2患者DNA測(cè)序結(jié)果顯示：在ATP2C1基因的第25號(hào)外顯子存在第2416位C轉(zhuǎn)換為T而形成無義突變：c.2416C＞T（p.Arg806X）（圖2b），該突變可使mRNA第806位編碼精氨酸的密碼子變?yōu)榻K止密碼子，從而使翻譯提前終止。家系3患者DNA測(cè)序結(jié)果顯示與家系2患者存在相同的無義突變：c.2416C＞T （p.Arg806X）（圖2c）。家系4中的2例患者DNA測(cè)序結(jié)果顯示：在ATP2C1基因的第11號(hào)外顯子存在第888位堿基與第889位堿基間插入堿基T的移碼突變：c.888_889insT （p.296TfsX2）（圖2d），該突變可使mRNA翻譯過程中出現(xiàn)移碼，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)翻譯提前終止。

這些突變均經(jīng)過了雙向測(cè)序驗(yàn)證，且在各家系健康成員與100名正常對(duì)照者中未發(fā)現(xiàn)。

圖2　Hailey-Hailey病四個(gè)家系患者ATP2C1基因突變點(diǎn)

3　討論

HHD是一種少見的常染色體顯性遺傳性皮膚病，以皮膚褶皺部位紅斑基礎(chǔ)上的松弛性水皰為主要特征，皮損處組織病理學(xué)表現(xiàn)為棘層松解，形似“倒塌的磚墻”。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)大約70%患者存在明確的家族史，男女發(fā)病率大致相等[1-3]。2000年，Sudbrak等[2]和Hu等[3]通過家系連鎖分析和基因定位克隆技術(shù)首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了HHD的致病基因-ATP2C1，該基因編碼一種新型鈣離子泵，對(duì)維持高爾基體的鈣離子濃度起重要作用。迄今為止，國內(nèi)外學(xué)者在不同的HHD家系和散發(fā)病例中發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了超過150種HHD相關(guān)的ATP2C1基因突變，突變類型包括無義突變、錯(cuò)義突變、剪接位點(diǎn)突變、插入或缺失突變[2-13]。

本研究共收集了4個(gè)HHD家系中的9例患者和6名正常人以及100例健康對(duì)照者進(jìn)行ATP2C1基因測(cè)序分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4個(gè)家系中所有患者均存在ATP2C1基因突變。家系1中患者ATP2C1基因的第16號(hào)外顯子存在堿基缺失突變，家系2和家系3中的患者ATP2C1基因的第25號(hào)外顯子存在無義突變，家系4中2例患者ATP2C1基因的第11號(hào)外顯子存在堿基插入突變。家系內(nèi)的正常人和健康對(duì)照者未發(fā)現(xiàn)這些突變位點(diǎn)。家系1和家系4患者攜帶的堿基缺失和插入突變可導(dǎo)致mRNA在翻譯過程中出現(xiàn)移碼，從而導(dǎo)致終止密碼子提前出現(xiàn)，家系2和家系3中患者攜帶的無義突變可導(dǎo)致mRNA第806位編碼精氨酸的密碼子變?yōu)榻K止密碼子。終止密碼子的提前出現(xiàn)可導(dǎo)致蛋白質(zhì)翻譯提前終止，形成截短蛋白，無法發(fā)揮正常的功能，維持高爾基體內(nèi)鈣離子濃度，從而導(dǎo)致角質(zhì)形成細(xì)胞間黏附障礙，最終導(dǎo)致表皮棘層松解和疾病的發(fā)生。目前，ATP2C1基因突變引起角質(zhì)形成細(xì)胞間黏附異常的機(jī)制尚不十分清楚，可能與細(xì)胞表面的橋粒蛋白和鈣黏素E表達(dá)降低有關(guān)[14]。

本研究在4個(gè)HHD家系中共發(fā)現(xiàn)3個(gè)ATP2C1基因致病突變，其中2個(gè)移碼突變（c.888_889insT，c.1330delC）均為首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道。家系2和家系3中發(fā)現(xiàn)的無義突變c.2416C＞T已由Dobson-Stone等[12]于2002年報(bào)道，本研究佐證了其研究結(jié)果。本研究所發(fā)現(xiàn)的ATP2C1基因致病突變，豐富了HHD相關(guān)ATP2C1突變數(shù)據(jù)庫，更為患者提供了準(zhǔn)確的分子診斷依據(jù)。

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（本文編輯祝賀）

Gene ATP2C1 mutation analysis for four Chinese families with Hailey-Hailey disease

MEI Ai-hua，LI Hong-wen，WANG Ting-mei，et al
Department of Dermatology, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China

Objective To identify ATP2C1 gene mutations in four Chinese families with Hailey-Hailey disease (HHD). Methods Genomic DNA was extracted from peripheral blood of 9 patients and 6 healthy individuals of 4 HHD families and 100 unrelated normal individuals. All 28 coding exons and their flanking sequences of ATP2C1 were amplified by polymerase chain reaction (PCR), then direct DNA sequencing and comparative analysis were performed. Results Three ATP2C1 gene heterozygous mutations, c.888_889insT (p.296TfsX2), c.1330delC (p.443QfsX33) and c.2416C＞T (p.Arg806X), were identified in 9 patients with HHD. The mutations were not found in the healthy members of the 4 families and normal controls. Conclusion Two novel heterozygous mutations of ATP2C1 gene, c.888_889insT (p.296TfsX2) and c.1330delC (p.443QfsX33), were found among these HHD cases in this study. Our findings provided data for molecular diagnosis of these HHD patients, and added new variants to the database of ATP2C1 mutations associated with HHD.

Hailey-Hailey disease；Mutation analysis；ATP2C1 gene；DNA sequencing [J Pract Dermatol, 2016, 6(5):296-299]

R758.5

A

1674-1293(2016)05-0296-04

10.11786/sypfbxzz.1674-1293.20160503

430030武漢，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院皮膚科（梅愛華，李宏文，王婷梅，劉冬先，鄧云華）；湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院皮膚科（梅愛華）

梅愛華，碩士研究生，研究方向：分子皮膚病學(xué)，

E-mail: meiaihua120@sina.com

鄧云華，E-mail: yhdeng@tjh.tjmu.edu.cn

（2016-04-02

2016-06-23）