李云龍，彭一航，燕騰，鞏合德

（西南林業(yè)大學生態(tài)旅游學院，云南昆明650224）

西南地區(qū)夏塊菌子實體內的細菌多樣性分析*

李云龍，彭一航，燕騰，鞏合德**

（西南林業(yè)大學生態(tài)旅游學院，云南昆明650224）

以夏塊菌（Tuber aestivum）為研究對象，采用傳統(tǒng)室內分離培養(yǎng)的方式對其子實體內細菌菌株分離培養(yǎng)，并對比篩選，對云南省保山市和四川省會東縣的夏塊菌子實體內細菌多樣性進行研究。結果表明，所分離出的細菌屬于5門11屬19種，其中，γ-變形菌門所占比例最大，為67%，假單胞菌屬的Pseudomonas fuscovaginae為優(yōu)勢類群；厚壁菌門（Firmicutes）所占比例其次，為第二大群，以葡萄球菌屬的Staphylococcus simiae、Staphylococcus warneri為優(yōu)勢類群。此外還分離得到擬桿菌門（Bacteroidetes）細菌22株，占9%；α-變形菌門細菌14株，占6%；β-變形菌門6株，占3%。

夏塊菌；子實體；細菌；優(yōu)勢類群

塊菌（truffles）是一大類地下生大型真菌的統(tǒng)稱，因具有較高的營養(yǎng)價值且產地稀少，產量有限，而備受推崇。其中法國黑孢塊菌與意大利白塊菌更是塊菌家族中的明星成員，素有“地下黃金”和“上帝的食物”的美譽，其價值與珍稀程度可見一斑[1]。從分類學上而言，塊菌有廣義與狹義之分，廣義的塊菌是指隸屬于真菌界（Fungi）子囊菌門（Ascmyeotina）擔子菌門（Basidiomyeotina）和接合菌門（Zygomyeotina）的不同種，狹義上的塊菌是指子囊菌門中的塊菌屬（Tuber）所含種類。后者也是日常多為人們平時所認同的塊菌，而眾多經濟價值極高的種類多在本屬，本文所指塊菌也只是狹義上的塊菌種類[2-3]。

夏塊菌（Tuber aestivum）是我國國產塊菌中經濟價值較高但發(fā)現(xiàn)較晚的一個種，《中國的經濟真菌》名錄中較早收錄了夏塊菌一詞，并指出我國北方及西南地區(qū)有該種的分布，但無標本的引證[4]。隨后大量研究者也都報道和介紹了該種，但同樣無具體產地描述及標本。從確認該種在中國存在以后，國產夏塊菌與歐洲塊菌是否為同一種的爭論從未間斷，研究者各執(zhí)一詞，本文對此不予討論。關于國產夏塊菌的地理分布，2014年龍新華[5]分別對云南省保山市和四川省會東縣的夏塊菌進行詳細報道，并有具體的采集記錄及野外采集形態(tài)特征記錄。筆者于2015年8月～10月分赴云南省保山市和四川省會東縣實地采集夏塊菌子實體，運用分子實驗手段，對其子實體內的細菌進行室內培養(yǎng)，以期揭示夏塊菌子實體內的細菌多樣性，為篩選優(yōu)勢菌株及促棲菌（MHB）研究打下基礎，進而加深人們對夏塊菌的認識，并為夏塊菌菌根合成乃至夏塊菌的人工栽培提供參考，促進夏塊菌的研究開發(fā)與保護。

1　材料與方法

1.1材料

以國產夏塊菌為研究實驗材料，新鮮子實體分別采自云南省保山市與四川省會東縣，生境均為華山松（Pinus amandii）為優(yōu)勢樹種的森林，且菌塘（塊菌采集地點）均為塊菌的多年固定生長點，距離與人類主要活動區(qū)域較遠，受人類活動干擾較弱，干擾因素較少，較好地保持了塊菌生長的原始生態(tài)環(huán)境。將發(fā)現(xiàn)的夏塊菌子實體放入無菌袋，置于事先準備好的冰盒中保存，隨后，對采集地的地理信息（地名、采集日期、經緯度、海拔）和生境信息（土壤、溫濕度、林型、優(yōu)勢種、伴生樹種）等進行詳細記錄。采集完畢后在實驗室內將各地采集的子實體編號，見表1。

表1　樣品采集信息Tab.1Samples information used in this study

1.2樣品處理

1.2.1細菌的分離純化與培養(yǎng)

采集到的子實體在實驗室內進行編號處理后，使用無菌水對子實體表面進行沖洗，將泥土等沖洗干凈之后，置于超凈工作臺至晾干，晾干后使用酒精（75%）或酒精燈對其進行表面消毒滅菌，而后徒手掰開子實體[7]，并使用滅菌后的手術刀取菌肉0.5 g至裝有滅菌完畢的4.5 mL NaCl（0.85%）的離心管中。在稱量前對電子天平進行滅菌。將取好菌肉的離心管，使用高通量組織研磨儀進行研磨至組織塊呈均勻糊狀。隨后在28℃的搖床中放置0.5 h，充分混勻，并將此時的菌液定義為10-1濃度的懸濁液。在超凈工作臺內用移液槍抽取1 mL的10-1的菌液至裝有9 mL無菌水的離心管中，反復吹吸，定義此時懸濁液濃度為10-2。以此類推，得到10-3～10-6濃度的懸濁液[8-10]。將稀釋完畢的10-4～10-6濃度的懸浮液均勻涂抹到TSA培養(yǎng)基上，之后放置在28℃生化培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)約48 h。待培養(yǎng)基中細菌菌落長成后，用消毒完畢的牙簽挑取單菌落至TSB培養(yǎng)液（TSA培養(yǎng)基不加瓊脂）中培養(yǎng)，并對其菌落數(shù)（CFU）進行計數(shù)。

1.2.2細菌的篩選與純化

將TSB培養(yǎng)基中的細菌菌液培養(yǎng)3 d～5 d后，將其在GeneAmp9700 PCR儀進行擴增（25 μL的細菌V3區(qū)），PCR擴增反應體系成分包括：2 μL 10× buffer（含Mg2+），0.5 μL dNTP（1 mmol·L-1），0.5 μL BSA（1%），1 μL MgCl2，0.5 U Taq Polymerase（Takara Taq,Takara Biotechnology,Dalian Co.Ltd., China），引物F341/R518各1 μL（5 μmol·L-1），DNA模板1 μL，加雙蒸水補足至25 μL。擴增程序具體如下：95°C預變性5 min；94°C變性1 min，60°C退火1 min，72°C延伸1 min，共30個循環(huán)；72°C延伸10 min。PCR產物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。放入紫外儀觀察，選取條帶較亮者送檢。將檢測結果進入BLAST進行比對，根據比對結果進行建樹。

2　結果與分析

2.1微生物的計數(shù)

夏塊菌子實體內細菌菌落數(shù)（CFU）統(tǒng)計結果見表2、表3。

2.2種類多樣性

將分離培養(yǎng)的細菌送檢后，以Korarchaeota（AF255604.1）、Uncultured Korarchaeota（KT453572.1）序列為外類群，根據檢測細菌的16Sr-DNA序列，構建得出夏塊菌子實體內細菌的系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖1。

由圖1可知，夏塊菌子實體內可培養(yǎng)細菌主要分布于α-變形菌門、β-變形菌門、γ-變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門。

本次實驗共得到可培養(yǎng)菌株233株，對其多樣性進行分析發(fā)現(xiàn)，本次實驗中分離所得細菌所占比例最大的類群是變形菌門。其中分離得到γ-變形菌門菌株157株，占總數(shù)的67%，為所占比例最大的一支。γ-變形菌門的細菌主要包括：假單胞菌屬（Pseudomonas），占40%（63/157）；布丘氏菌屬（Buttiauxella），占24%（37/157）；寡氧單胞菌屬（Stenotrophomonas），占18%（28/157）；埃希氏菌屬（Escherichia），占11%（18/157）；不動桿菌屬（Acinetobacter），占7%（11/157）。此外，布丘氏菌（Buttiauxella agrestis）占25%（37/157），寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）占18%（28/157），埃希氏桿菌（Escherichia vulneris）占11%（18/ 157），不動桿菌（Acinetobacter junii）占7%（11/ 157）。

除γ-變形菌門外，厚壁菌門是本次實驗分離得到的另一大類群，占14%（33/233）。主要是葡萄球菌屬Staphylococcus simiae、Staphylococcus warneri、 Staphylococcus hominis。本次實驗還得到α-變形菌門細菌14株，占總菌株數(shù)的6%，其中短波單胞菌（Brevundimonas diminuta）、劍菌屬與根瘤菌屬（Ensifer/Sinorhiz obium）各7株。萬山平[11]曾在攀枝花白塊菌土壤中分離得到此類細菌，在一定程度上反映出塊菌子實體內的細菌與其菌塘內細菌具有一定的相關性。β-變形菌門和擬桿菌門細菌分別占總數(shù)的3%和9%，以金黃桿菌屬的Chryseobacterium vrystaatense為代表，擬桿菌門以馬賽菌屬的蒂莫內馬賽菌（Massilia timonae）為主。

表2　12個夏塊菌子囊果內篩選出的細菌及OTUsTab.2Number of bacterial isolates screened from 12 sporocarps of Tuber aestivum

表3　12個夏塊菌子囊果內細菌的菌落數(shù)（CFU）Tab.3The bacterial CFU of 12 ascocarps of Tuber aestivum

3　討論

本實驗中采集了12個夏塊菌子實體用作分析，結果表明12個子實體的生物量大致相同，共得5個門233株細菌，分布在α-變形菌門、β-變形菌門、γ-變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門，這與同類相關實驗所得細菌分布大致相同[10，12-15]。

γ-變形菌門是本次實驗中所得數(shù)量最多的一門，假單胞菌屬是其優(yōu)勢類群。假單胞菌類群中多數(shù)與Pseudomonas rhizosphaerae、Pseudomonas japonica、Pseudomonas alkylphenolia、Pseudomonas entomophila相似度極高。假單胞菌屬種類也常從塊菌屬中分離出來，分離自波式塊菌中的假單胞菌中的一些類群具有抑制植物病原菌的作用，并通過控制纖維素分解、幾丁質分解和蛋白水解的方式對波式塊菌菌絲的生長和形態(tài)發(fā)育產生影響[16]；此外Barbara Citterio等[17]的研究表明假單胞菌對于波式塊菌子實體結構的構建與修復具有積極的影響作用。因此假單胞菌屬是一種常見的優(yōu)勢種群，存在于塊菌子實體內。

圖1　基于夏塊菌子實體內部分細菌16S rDNA構建的Neighbor-joining進化樹Fig．1 Neighbor-joining tree based on 16S rDNA gene partial sequences of 21 OTUs isolated from a fruitbody of T.aestivum

厚壁菌門細菌在意大利塊菌和波式塊菌中同樣存在，此外在微繁培養(yǎng)的植株根系中也有此類細菌。經研究表明，此屬細菌在波式塊菌菌絲生長過程中起到抗菌的作用；α-變形菌門劍菌屬與根瘤菌屬細菌在其他種類中經常被分離得到，此外此屬細菌易與豆科植物產生共生聯(lián)合，從而具有固氮功能，也就是為人所熟知的固氮細菌。而劍菌屬與根瘤菌屬正是α-變形菌門細菌中固氮細菌最具典型性的代表，對植物的營養(yǎng)過程甚至真菌的生長及子實體的發(fā)育具有重要影響[18]。

β-變形菌門細菌在波式塊菌和意大利白塊菌中也曾被分離得到。除了相關研究中分離得到絕大多數(shù)細菌之外，本實驗也分離得到其他實驗中較少出現(xiàn)的一些細菌，如桿菌門馬賽菌屬的蒂莫內馬賽菌（Massilia timonae）。相比較而言，β-變形菌門的金黃桿菌在塊菌子實體分離中較多地被分離出來，這與前人的結果相符，而擬桿菌門的細菌則較少地在塊菌中分離得到，此外，此類細菌具有降解能力。筆者認為，此類細菌與塊菌子實體的降解腐壞具有一定的聯(lián)系。這對于豐富塊菌子實體可培養(yǎng)細菌的種類及塊菌的防腐與保存也具有一定的意義。

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Bacteria Diversity Research on Tuber aestivum Fruiting Bodies from Southwest of China

LI Yun-long,PENG Yi-hang,YAN Teng,GONG He-de
(Ecotourism Faculty,Southwest Forestry University,Kunming 650224,China)

In this paper,taking Tuber aestivum as the research object,the bacteria diversity in T.aestivum fruiting bodies was carried out in the form of the tradition way.The fruiting bodies of T.aestivum were collected from Baoshan city(Yunnan province)and Huidong city(Sichuang province).The results revealed that the culturable bacteria,which belonges to 19 species and 11 genera in 5 phyla respectively.Most of the culturable isolations(67%)are affiliated to the γ-Proteobacteria,among of them,the dominated taxon is Pseudomonas fuscovaginae.The second major group is Firmicutes(14%),mainly with Staphylococcus simiae and Staphylococcus warneri as the dominant taxa.The rest of culturable bacterial isolates are members of Bacteroidetes (9%),α-Proteobacteria(6%),and β-Proteobacteria(3%).

Tuber aestivum;fruiting bodies;bacteria;dominant communities

S646.9

A

1003-8310（2016）04-0058-05

10.13629/j.cnki.53-1054.2016.04.015

國家自然科學基金青年科學基金項目（31200482）。

李云龍（1990-），男，碩士，主要從事生物地理學研究。E-mail:1158116277@qq.com

**通信作者：鞏合德（1978-），男，博士，副教授，主要從事森林生態(tài)學研究。E-mail:gonghede3@163.com

2016-05-16