劉明，肖自添，邱耀明，邱桂根，何煥清**

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，廣東廣州510640；2.廣東省蔬菜新技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510640；3.珠海市東大食用菌新技術(shù)研究有限公司，廣東珠海519101）

茶樹(shù)菇液體菌種培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件的篩選及其應(yīng)用*

劉明1，2，肖自添1，2，邱耀明3，邱桂根3，何煥清1，2**

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，廣東廣州510640；2.廣東省蔬菜新技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510640；3.珠海市東大食用菌新技術(shù)研究有限公司，廣東珠海519101）

茶樹(shù)菇（Agrocybe cylindracea）液體菌種的培養(yǎng)是工廠化生產(chǎn)的關(guān)鍵技術(shù)和發(fā)展趨勢(shì)。本研究以廣昌2號(hào)茶樹(shù)菇作為供試菌株，通過(guò)搖瓶培養(yǎng)，以菌絲體生物量為指標(biāo)，篩選到適合茶樹(shù)菇液體培養(yǎng)的培養(yǎng)基為豆粕粉0.4%、葡萄糖2%、MgSO40.1%、KH2PO40.1%，最適培養(yǎng)溫度為26℃，pH值6.5；通過(guò)栽培試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)茶樹(shù)菇液體菌種栽培周期短，相比固體菌種，更適合工廠化栽培應(yīng)用。

茶樹(shù)菇；液體菌種；培養(yǎng)基；豆粕粉

茶樹(shù)菇（Agrocybe cylindracea）是一種珍稀的食用菌，富含人體所需的蛋白質(zhì)、氨基酸和微量元素，不僅味美且具有廣泛的藥理作用[1-2]。最近的研究表明茶樹(shù)菇具有抗腫瘤、抗突變的活性，開(kāi)發(fā)利用價(jià)值極大[3-5]。目前茶樹(shù)菇的栽培主要以季節(jié)性手工作坊式為主，使用的固體菌種要經(jīng)過(guò)母種、原種、栽培種三級(jí)培育后才能擴(kuò)大到栽培生產(chǎn)環(huán)節(jié)。固體菌種因生產(chǎn)勞動(dòng)強(qiáng)度大、生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、污染率高等因素，制約了茶樹(shù)菇的發(fā)展[5]。而液體菌種在生產(chǎn)時(shí)有諸多優(yōu)點(diǎn)，例如發(fā)菌時(shí)間短、生長(zhǎng)快速、污染率低等，因此推廣液體菌種將有助于茶樹(shù)菇的產(chǎn)量和質(zhì)量的提高[6-7]。本研究主要通過(guò)對(duì)茶樹(shù)菇液體菌種培養(yǎng)基配方、培養(yǎng)條件進(jìn)行篩選，為應(yīng)用液體菌種進(jìn)行工廠化栽培茶樹(shù)菇提供參考。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)菌株

茶樹(shù)菇廣昌2號(hào)，為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2各種培養(yǎng)基制備

碳源篩選培養(yǎng)基，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基（蛋白胨1%、KH2PO40.1%、MgSO40.05%）中，分別加入2%的葡萄糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉4種碳源，高溫高壓滅菌。

氮源篩選培養(yǎng)基，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基（葡萄糖2%、KH2PO40.1%、MgSO40.05%）中，分別加入0.5%的蛋白胨、豆粕粉、麩皮、硫酸銨4種氮源。

培養(yǎng)條件優(yōu)化培養(yǎng)基：豆粕粉0.4%、葡萄糖2%、MgSO40.1%、KH2PO40.1%。

固體菌種培養(yǎng)基：棉籽殼98%、麩皮1%、石膏1%。裝袋1 000 g，高溫高壓滅菌。

栽培培養(yǎng)基（棉籽殼培養(yǎng)基）：棉籽殼94%、麩皮5%、石膏1%。裝袋1 000 g，高溫高壓滅菌。

1.3菌種活化

將茶樹(shù)菇菌種接種到PDA培養(yǎng)基平板，26℃恒溫培養(yǎng)7 d，備用。

1.4碳源、氮源的篩選

將活化的菌種用直徑2 mm的打孔器，接種5塊到去掉瓊脂粉的PDA培養(yǎng)液中，26℃，160 r·min-1條件下培養(yǎng)7 d后測(cè)定菌絲生物量。將培養(yǎng)好的菌種接種15 mL到篩選培養(yǎng)基中（500 mL三角瓶），裝液量200 mL，相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)7 d。

1.5液體培養(yǎng)基不同組分配比試驗(yàn)

培養(yǎng)基中碳源、氮源、KH2PO4、MgSO4·7H2O各組分的濃度及其配比，按L9(34)設(shè)計(jì)四因素三水平正交試驗(yàn)，重復(fù)3次。試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1　正交試驗(yàn)因子與水平L9(34)表Tab.1Factors and levels of the L9(34)orthogonal experiment

1.6菌絲體生物量測(cè)定

取50 mL液體培養(yǎng)基用8層紗布過(guò)濾，收集菌絲后用蒸餾水洗去多余豆粕粉，干燥箱50℃烘至恒重后稱(chēng)量。

1.7固體菌種的制備

將活化好的菌種接種到棉籽殼培養(yǎng)基，在25℃左右條件下培養(yǎng)至滿(mǎn)袋。

1.8起始pH對(duì)菌絲體生物量的影響

按配比試驗(yàn)得出的最適組合配制培養(yǎng)基，滅菌前用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0共6個(gè)梯度，重復(fù)3次，26℃、160 r·min-1條件下培養(yǎng)7 d后，測(cè)定不同pH對(duì)菌絲體生物量的影響。

1.9最適發(fā)酵溫度篩選

在500 mL三角瓶中加入200 mL培養(yǎng)基，接入15 mL液體菌種，于160 r·min-1，并分別于20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃條件下培養(yǎng)，每個(gè)溫度重復(fù)3次，7 d后測(cè)定菌絲體生物量。

1.10出菇試驗(yàn)

將固體和液體菌種分別接種25 g或25 mL到栽培培養(yǎng)基中，各100袋，25℃左右培養(yǎng)至滿(mǎn)袋，在26℃、相對(duì)濕度85%～90%條件下出菇兩茬，記錄相關(guān)信息。

1.11數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理使用Microsoft Excel 2007和SPSS Version 21軟件。

2　結(jié)果與分析

2.1茶樹(shù)菇液體菌種培養(yǎng)基配方篩選結(jié)果

2.1.1不同碳源對(duì)茶樹(shù)菇菌絲體生長(zhǎng)的影響

以葡萄糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉4種不同碳源，研究碳源對(duì)茶樹(shù)菇液體菌種生長(zhǎng)的影響，在各培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d后測(cè)定菌絲生物量，見(jiàn)表2。

表2　碳源對(duì)茶樹(shù)菇液體培養(yǎng)的影響Tab.2Effect of different carbon source on the mycelial growth of Agrocybe cylindracea

由表2可見(jiàn)，茶樹(shù)菇菌絲在葡萄糖、乳糖、可溶性淀粉3種碳源條件下，生物量差異不大，表明茶樹(shù)菇對(duì)碳源的利用較廣。但在以蔗糖作為碳源的培養(yǎng)基上生物量相對(duì)較低，明顯低于其他3種碳源。

2.1.2不同氮源對(duì)茶樹(shù)菇菌絲體生長(zhǎng)的影響

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入蛋白胨、豆粕粉、麩皮、硫酸銨4種氮源，不同氮源對(duì)茶樹(shù)菇液體培養(yǎng)的影響見(jiàn)表3。

表3　氮源對(duì)茶樹(shù)菇液體培養(yǎng)的影響Tab．3Effect of different nitrogen source on the mycelial growth of Agrocybe cylindracea

從表3中可以看出，不同氮源對(duì)茶樹(shù)菇的生物量有明顯影響。在有機(jī)氮中，以蛋白胨和豆粕粉最好，其次是麩皮，在以硫酸銨為氮源的液體培養(yǎng)基中茶樹(shù)菇菌絲體生物量最低。說(shuō)明茶樹(shù)菇對(duì)有機(jī)氮的利用率較高，而對(duì)無(wú)機(jī)氮的利用率偏低。

2．1．3培養(yǎng)基不同組分配比試驗(yàn)結(jié)果

選用豆粕粉為氮源，葡萄糖為碳源，以MgSO4和KH2PO4為無(wú)機(jī)鹽進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，其結(jié)果見(jiàn)表4。

表4　正交試驗(yàn)結(jié)果Tab．4Results of the L9(34)orthogonal experiment

根據(jù)表4極差值（R）比較，四個(gè)因素對(duì)菌絲體生物量的影響大小依次為A＞B＞D＞C。根據(jù)各因素各水平菌絲體的生物量，茶樹(shù)菇液體培養(yǎng)基理論最優(yōu)水平組合為A2B3C2D2，即豆粕粉0．4%、葡萄糖2%、MgSO40．1%、KH2PO40．1%。

2.2茶樹(shù)菇液體菌種培養(yǎng)條件篩選

2．2．1不同起始pH對(duì)菌絲體生物量的影響

采用篩選得到的培養(yǎng)基配方，研究起始pH對(duì)茶樹(shù)菇液體菌種發(fā)酵的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

由圖1可見(jiàn)，茶樹(shù)菇對(duì)pH的適應(yīng)范圍較廣，在液體培養(yǎng)基中pH5．5～8．0時(shí)菌絲生長(zhǎng)較好，起始pH為6．5時(shí)菌絲體生物量最高。

2．2．2培養(yǎng)溫度對(duì)菌絲體生物量的影響

為了找出茶樹(shù)菇液體菌種發(fā)酵的最佳發(fā)酵溫度，采用篩選得到的培養(yǎng)基，在不同溫度下進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖1　起始pH對(duì)茶樹(shù)菇菌絲體生物量的影響Fig．1Effects of initial pH on mycelial growth in shake flask cultures of Agrocybe cylindracea

圖2　培養(yǎng)溫度對(duì)茶樹(shù)菇菌絲體生物量的影響Fig．2Effects of temperature on mycelial growth in shake flask cultures of Agrocybe cylindracea

由圖2可見(jiàn)，茶樹(shù)菇在液體發(fā)酵過(guò)程中，培養(yǎng)溫度為26℃時(shí)菌絲體生物量最高，在高于26℃后菌絲生物量趨于平緩。

2.3液體菌種的應(yīng)用

為了確定最佳培養(yǎng)時(shí)間，應(yīng)用篩選得到的培養(yǎng)基配方和條件，將經(jīng)過(guò)6 d、7 d、8 d培養(yǎng)的液體菌種接種到棉籽殼培養(yǎng)基上后，觀察菌絲生長(zhǎng)情況，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5　茶樹(shù)菇液體和固體菌種出菇比較Tab.5Comparison of fruiting condition of Agrocybe cylindracea between liquid culture and solid culture

菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)袋平均天數(shù)分別為18 d、15 d、16 d。培養(yǎng)7 d的菌種萌發(fā)時(shí)間最短，長(zhǎng)滿(mǎn)袋所需時(shí)間最短，長(zhǎng)勢(shì)旺盛。記錄同時(shí)接種固體菌種和液體菌種的菌袋生長(zhǎng)過(guò)程，發(fā)現(xiàn)液體菌種栽培袋長(zhǎng)滿(mǎn)菌袋時(shí)間相比固體菌種提前15 d左右，頭潮菇采收提前8 d左右。

3　小結(jié)

在食用菌的液體培養(yǎng)中，碳源、氮源和礦物質(zhì)元素影響菌絲生長(zhǎng)。通過(guò)對(duì)茶樹(shù)菇液體菌種培養(yǎng)過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)生物量的影響研究，發(fā)現(xiàn)以葡萄糖為碳源，培養(yǎng)基的效果較好，這與苗秉義[8]的結(jié)果一致。在最佳氮源的選擇上，蛋白胨和豆粕粉的差異不顯著，但豆粕粉來(lái)源廣泛且價(jià)格低廉，可應(yīng)用于大規(guī)模的生產(chǎn)。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行培養(yǎng)條件的優(yōu)化得出最佳的培養(yǎng)基配方為豆粕粉0.4%、葡萄糖2%、MgSO40.1%、KH2PO40.1%。發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值，對(duì)食用菌生長(zhǎng)具有非常明顯的影響，也是影響培養(yǎng)過(guò)程中各種酶活性的重要因素。本研究發(fā)現(xiàn)茶樹(shù)菇廣昌2號(hào)對(duì)pH值的適應(yīng)性較廣，在初始pH5.5～8.0條件下都能正常生長(zhǎng)；在pH6.5時(shí)菌絲生物量最大，這與劉競(jìng)男等[9]和曾澤彬等[10]的研究結(jié)果基本一致，而與Kim HO[11]等的結(jié)果略有差異，可能是由于選擇的菌種不同而引起的。溫度是食用菌生長(zhǎng)相對(duì)敏感的因素。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)茶樹(shù)菇廣昌2號(hào)在26℃液體培養(yǎng)的菌絲體生物量最大。液體菌種相比固體菌種在大規(guī)模生產(chǎn)上有明顯優(yōu)勢(shì)。通過(guò)出菇試驗(yàn)，液體菌種菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)栽培袋的時(shí)間為17 d，相比固體菌種縮短了15 d的時(shí)間，頭潮菇出菇時(shí)間也有所減少；生物轉(zhuǎn)化率與固體菌種相比沒(méi)有明顯差異，說(shuō)明使用液體菌種能縮短栽培周期，可以應(yīng)用于工廠化生產(chǎn)。

[1]黃年來(lái)，林志彬，陳國(guó)良，等.中國(guó)食藥用菌學(xué)[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社，2010：615-617.

[2]Cilerdzic J,Stajic M,Vukojevic J,et al.Antioxidant and antifungal potential of Pleurotus ostreatus and Agrocybe cylindracea basidiocarps and mycelia[J].Current Pharmaceutical Biotechnology,2015,16(2):179-186.

[3]Hu DD,Zhang RY,Zhang GQ,et al.A laccase with antiproliferative activity against tumor cells from an edible mushroom,white common Agrocybe cylindracea[J].Phytomedicine, 2011,18(5):374-379.

[4]Chien RC,Tsai SY,Lai EYC,et al.Antiproliferative activities of hot water extracts from culinary-medicinal mushrooms, Ganoderma tsugae and Agrocybe cylindracea(higher basidiomycetes)on cancer cells[J].International Journal of Medicinal Mushrooms,2015,17(5):453-462.

[5]Yonedak,Shiozawa A,Kitahara A,et al.Novel antimutagenic proteins in the edible mushroom Agrocybe cylindracea[J]. Genes and Environment,2012,34(1):9-17.

[6]陳躬國(guó)，林原，鄭英姿，等.茶樹(shù)菇周年生長(zhǎng)栽培技術(shù)[J].中國(guó)食用菌，2012，31（1）：56-57.

[7]戴建清，曾志恒.食用菌液體菌種研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢(shì)[J].中國(guó)食用菌，2012，31（5）：1-3.

[8]邊銀丙.食用菌工廠化生產(chǎn)的關(guān)鍵技術(shù)及其研發(fā)方向[J].食藥用菌，2013，21（3）：139-143.

[9]苗秉義，邵坤.茶樹(shù)菇液體培養(yǎng)碳氮源的篩選[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2009（19）：89-90.

[10]劉競(jìng)男，王四寶，何兵，等.楊樹(shù)菇液體發(fā)酵工藝研究[J].食用菌學(xué)報(bào)，2004，11（3）：50-56.

[11]曾澤彬，劉學(xué)峰，王一，等.茶樹(shù)菇發(fā)酵罐培養(yǎng)的工藝優(yōu)化[J].食用菌，2012（5）：8-9.

[12]Kim HO,Lim JM,Joo JH,et al.Optimization of submerged culture condition for the production of mycelial biomass and exopolysaccharides by Agrocybe cylindracea[J].Bioresource Technology,2005,96(10):1175-1182.

Optimization and Application on Liquid Spawns Cultivation Medium of Agrocybe cylindracea

LIU Ming1,2,XIAO Zi-tian1,2,QIU Yao-ming3,QIU Gui-gen3,HE Huan-qing1,2
(1.Vegetables Research Institute Guangdong Academy of Agriculture Sciences,Guangzhou 510640,China; 2.Guangdong Key Laboratory for New Technology Research of Vegetables,Guangzhou 510640,China; 3.Dongda Mushroom New Technology Research Company Limited,Zhuhai 519101,China)

Liquid spawn cultivation was the key technology and developmental trend for Agrocybe cylindracea production.The optimization of nutritional requirements was studied for the mycelial biomass of A.cylindracea guangchang-2 in a shake flask culture.The optimum concentration of each medium component was determined using the orthogonal matrix method.The optimal combination of the media constituents for mycelial growth was as follows:soybean meal 0.4%,glucose 2%,MgSO40.1%, KH2PO40.1%.The optimal temperature was 26℃and initial pH was 6.5.Producing experiments showed use liquid spawn has shorter cultivation period and better for industrial application.

Agrocybe cylindracea;liquid spawn;cultivation medium;soybean meal

S646.9

A

1003-8310（2016）04-0039-04

10.13629/j.cnki.53-1054.2016.04.010

廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所所長(zhǎng)基金項(xiàng)目（所-201405）；廣東省“三區(qū)”科技人才選派和培養(yǎng)項(xiàng)目（2015A020224015）；佛山市順德區(qū)產(chǎn)學(xué)研合作項(xiàng)目（2014CXY16）。

劉明（1984-）男，博士，助理研究員，主要從事食用菌遺傳與育種研究。E-mail:liuming2021@163.com

**通信作者：何煥清（1964-），男，本科，研究員，主要從事食用菌栽培與推廣研究。E-mail:hhq407@sina.com

2016-05-29