魏 杰，鞏 薇，王 洪，李曉波，付 瑞，王 吉，邢 進(jìn)，

馮育芳，王淑菁，高正琴，岳秉飛

(中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050)

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北京中國(guó)農(nóng)大小型豬三個(gè)亞系群體的遺傳狀況分析

魏 杰，鞏 薇，王 洪，李曉波，付 瑞，王 吉，邢 進(jìn)，

馮育芳，王淑菁，高正琴，岳秉飛

(中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050)

目的 對(duì)北京地區(qū)中國(guó)農(nóng)大小型豬三個(gè)亞系群體進(jìn)行遺傳質(zhì)量評(píng)價(jià)與分析。 方法 利用DB11/T828.3-2011中的25對(duì)微衛(wèi)星引物，對(duì)3個(gè)中國(guó)農(nóng)大小型豬亞系群體進(jìn)行微衛(wèi)星分型，利用群體遺傳分析軟件Popgen32對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行處理分析。 結(jié)果 農(nóng)大I系、農(nóng)大II系和農(nóng)大III系小型豬群體分別得到130、122和138個(gè)等位基因，平均雜合度分別為0.6759、0.5967、0.6779，平均多態(tài)信息含量(PIC)分別為0.6344、0.5540、0.6403；農(nóng)大II系和農(nóng)大III系的遺傳距離為0.4251，農(nóng)大I系與農(nóng)大II系的遺傳距離為0.2084。 結(jié)論 三個(gè)亞系中，農(nóng)大II系和農(nóng)大III系小型豬均具有較好的遺傳多樣性和穩(wěn)定性，符合封閉群動(dòng)物的群體遺傳特征。

農(nóng)大小型豬；微衛(wèi)星標(biāo)記；亞系；群體遺傳

小型豬在解剖學(xué)、生理學(xué)、疾病發(fā)生機(jī)理等方面與人有極高的相似性，近年來(lái)已成為生物醫(yī)學(xué)研究中廣泛應(yīng)用的非嚙齒類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[1-3]。上世紀(jì)80年代，北京農(nóng)業(yè)大學(xué)以貴州叢江和廣西環(huán)江引進(jìn)的香豬為親本，經(jīng)近交育種、負(fù)向選擇等手段培育成中國(guó)農(nóng)大I系小型豬。又根據(jù)不同用途，與北京本地黑豬雜交培育出了抗逆性強(qiáng)的農(nóng)大II系；與蘭德瑞斯雜交培育成了白色的農(nóng)大III系[4,5]。該系列小型豬統(tǒng)稱農(nóng)大小型豬或中國(guó)實(shí)驗(yàn)用小型豬(Chinese experimental mini-pig，CEMP)，具有體型小、基因純、健康敏感、抗逆性強(qiáng)的特點(diǎn)，并在心臟模型、外科、口腔、燒傷等領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用[ 5-8]。

三個(gè)亞系的親本來(lái)源的不同，必然構(gòu)成了種群上的差異。在中國(guó)農(nóng)大小型豬的選育上，已經(jīng)過(guò)78項(xiàng)生理生化指標(biāo)測(cè)定及病原凈化，但對(duì)與遺傳質(zhì)量狀況的調(diào)查尚未見(jiàn)報(bào)道[9]。對(duì)于品系資源的保護(hù)和發(fā)展，需要依托科學(xué)的遺傳理論和技術(shù)。微衛(wèi)星DNA標(biāo)記即是群體遺傳學(xué)研究中最常使用的分子標(biāo)記之一[10]。它是以1-6個(gè)核苷酸為單位的段串聯(lián)重復(fù)序列標(biāo)記來(lái)進(jìn)行遺傳的種質(zhì)鑒定和多樣性分析等，具有數(shù)量大、分布廣、多態(tài)性豐富、共顯性遺傳，檢測(cè)快速簡(jiǎn)便且結(jié)果穩(wěn)定性重復(fù)性好等特點(diǎn)[11]。2012年3月，應(yīng)用微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)的北京市地方標(biāo)準(zhǔn)DB11/T828.3-2011正式實(shí)施，這是目前針對(duì)小型豬遺傳質(zhì)量控制最為具體的地方標(biāo)準(zhǔn)。本研究即依據(jù)DB11/T828.3-2011中25對(duì)微衛(wèi)星引物，對(duì)北京地區(qū)三個(gè)農(nóng)大亞系小型豬的群體進(jìn)行遺傳構(gòu)成分析，闡明農(nóng)大小型豬三個(gè)亞系的遺傳質(zhì)量，從而為農(nóng)大小型豬的生產(chǎn)繁育提供科學(xué)的依據(jù)，同時(shí)豐富地標(biāo)DB11/T828.3-2011在實(shí)際檢測(cè)中的應(yīng)用。

1 材料和方法

1.1 樣本

按照DB11/T828.3-2011的要求，分別從甲、乙2家單位抽取封閉繁育4代以上、不同窩別，雌雄各半的小型豬樣本，采抗凝血用于提取DNA進(jìn)行遺傳檢測(cè)分析。采樣單位、動(dòng)物品系數(shù)量等信息詳見(jiàn)表1。

1.2 樣本DNA的制備[12]

用改良酚-氯仿抽提法從血樣中提取基因組DNA，雙蒸H2O溶解，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并用紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA純度及含量，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物[13]

本研究所用25對(duì)引物均按照北京市地方標(biāo)準(zhǔn)對(duì)封閉群實(shí)驗(yàn)用小型豬的規(guī)定，并由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。序列詳見(jiàn)DB11/T828.3-2011附錄B。

1.4 主要試劑和儀器

Taq酶，DNA marker均購(gòu)自上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；dNTP、瓊脂糖為T(mén)akara公司產(chǎn)品；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)。

Mettler GB303電子天平，Bio-Rad MyCycler型PCR儀，Bio-Rad Model 3000Xi型電泳儀，GelLogic 212PRO 紫外與可見(jiàn)光凝膠分析裝置。

1.5 PCR擴(kuò)增程序

參照DB11/T828.3-2011中的PCR反應(yīng)體系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并調(diào)整模板引物濃度，底物濃度及酶含量，采用如下反應(yīng)體系：總反應(yīng)體系20 μL，其中10× PCR buffer 2 μL，上下游引物 (10 pmol/μL) 0.8 μL，dNTP (100 μmol/L) 1.2 μL，0.2 μL Taq 酶 (2.5U/μL)，基因組DNA 0.7 μL(50 ng～100 ng),純水(ddH2O)補(bǔ)齊體積。鎂離子濃度詳見(jiàn)DB11/T828.3-2011附錄B。

PCR 反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性, 4 min；94℃變性，30 s；退火溫度(Tm參照DB11/T828.3-2011附錄表B)，30 s；72℃延伸，30 s；35個(gè)循環(huán)；72℃繼續(xù)延伸7 min；擴(kuò)增產(chǎn)物4℃保存。

1.6 電泳結(jié)果及記錄

2.5%的瓊脂糖凝膠電泳，電壓110 V，由負(fù)極到正極，電泳時(shí)間35 min。溴化乙啶(2 μg/mL)染色，紫外可見(jiàn)分析裝置記錄拍照。無(wú)效擴(kuò)增和非特異擴(kuò)增需要優(yōu)化條件重新實(shí)驗(yàn)，重復(fù)試驗(yàn)無(wú)結(jié)果記為無(wú)效位點(diǎn)。

擴(kuò)增穩(wěn)定條帶送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行STR分型掃描，依據(jù)掃描結(jié)果記錄純合子與雜合子，并依據(jù)片段大小依次記錄為AA、AB、BB、BC、CC……純合子與雜合子判定見(jiàn)圖1，圖2。片段大小記錄示例詳見(jiàn)表2。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)各位點(diǎn)等位基因的組成，利用Popgen32軟件計(jì)算不同個(gè)體在各微衛(wèi)星位點(diǎn)上的基因頻率、平均有效等位基因數(shù)(Ne)、觀測(cè)雜合度、期望雜合度、平均雜合度(H)；利用Littleprogram 0.6計(jì)算各位點(diǎn)的多態(tài)性信息含量(PIC)。

圖1 純合子示例圖(S0091)Fig.1 Example picture for homozygote(S0091)

圖2 雜合子示例圖(S0091)Fig.2 Example picture for heterozygote (S0091)

單位Company生產(chǎn)許可證號(hào)Productionlicense品系Strains被毛顏色Color數(shù)量(頭)Number甲SCXK(京)2013-0005農(nóng)大II系黑15乙SCXK(京)2012-0005農(nóng)大I系黑15乙SCXK(京)2012-0005農(nóng)大III系白15

表2 微衛(wèi)星掃描結(jié)果片段記錄示例表(SW2494)

1.8 結(jié)果評(píng)價(jià)

群體遺傳質(zhì)量評(píng)價(jià)參見(jiàn)DB11/T828.3-2011的判定標(biāo)準(zhǔn)，即采用平均雜合度指標(biāo)或群體平衡狀態(tài)方法進(jìn)行評(píng)價(jià)[13]。當(dāng)平均雜合度在0.5～0.7時(shí)，且期望雜合度與觀測(cè)雜合度經(jīng)卡方檢驗(yàn)無(wú)明顯差異時(shí)，群體為合格的封閉群實(shí)驗(yàn)用小型豬群體。或用群體是否達(dá)到平衡狀態(tài)來(lái)判定，如果沒(méi)有達(dá)到平衡狀態(tài)，說(shuō)明群體的基因頻率或基因型頻率發(fā)生變化，該封閉群實(shí)驗(yàn)用小型豬群體判為不合格。

對(duì)于群間的遺傳變異，采用近交系數(shù)、遺傳距離等指標(biāo)進(jìn)行分析與評(píng)價(jià)遺傳結(jié)構(gòu)和親緣關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 農(nóng)大三個(gè)亞系小型豬的群體遺傳質(zhì)量評(píng)價(jià)

經(jīng)測(cè)定，共有24個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)在I系、農(nóng)大II系和農(nóng)大III系小型豬群體中得到穩(wěn)定擴(kuò)增。SWr312位點(diǎn)在三個(gè)群體樣本中均存在嚴(yán)重的非特異擴(kuò)增，故而舍棄該位點(diǎn)。

農(nóng)大I系、農(nóng)大II系和農(nóng)大III系小型豬群體的平均雜合度分別為0.6759、0.5967、0.6779，平均多態(tài)信息含量(PIC)分別為0.6344、0.5540、0.6403，群體卡方值分別為48.48、29.76、19.85，P值分別為0.0022、0.1927、0.7054。三個(gè)亞系農(nóng)大小型豬平均雜合度均在0.5～0.7之間，但農(nóng)大I系小型豬群體期望雜合度與觀測(cè)雜合度經(jīng)卡方檢驗(yàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，不能判定為合格的封閉群小型豬群體，其余兩個(gè)亞系可判定為合格群體。各品系小型豬遺傳參數(shù)詳見(jiàn)表3～表5。

2.2 農(nóng)大小型豬群體的遺傳距離與遺傳相似系數(shù)

農(nóng)大I系、農(nóng)大II系和農(nóng)大III系三個(gè)群體分別得到了130個(gè)、122個(gè)和138個(gè)等位基因。將三個(gè)亞系的農(nóng)大小型豬群體作進(jìn)一步的分析，兩兩比較得到農(nóng)大I系與農(nóng)大II系的遺傳距離為0.4251，農(nóng)大I系和農(nóng)大III系的遺傳距離為0.3351，農(nóng)大II系和農(nóng)大III系的遺傳距離為0.2084。遺傳相似系數(shù)與遺傳距離互為負(fù)對(duì)數(shù)關(guān)系，結(jié)果詳見(jiàn)表6。

表3 農(nóng)大Ⅰ系小型豬群體遺傳參數(shù)表

*P<0.05

表4 農(nóng)大II系小型豬群體遺傳參數(shù)表

表5 農(nóng)大III系小型豬群體遺傳參數(shù)表

表6 三群農(nóng)大小型豬的遺傳距離與遺傳相似系數(shù)

Tab.6 Genetic distance and genetic identity of 3 groups of China Agricultural University miniature pigs

農(nóng)大I系CEMPⅠ農(nóng)大II系CEMPⅡ農(nóng)大III系CEMPⅢ-0.65370.7153農(nóng)大II系(CEMPII)0.4251-0.8119農(nóng)大III系(CEMPIII)0.33510.2084-

注：對(duì)角線以上為遺傳相似性指數(shù)，對(duì)角線以下為遺傳距離。

Note. Data above the diagonal are genetic similarity index, and which below it are genetic distance.

3 討論

3.1 遺傳地方標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)用與三品系農(nóng)大小型豬群體的遺傳質(zhì)量評(píng)價(jià)

DB11/T828.3-2011是國(guó)內(nèi)第一版有具體檢測(cè)方法的小型豬遺傳質(zhì)量地方標(biāo)準(zhǔn)，但目前其應(yīng)用研究并不多見(jiàn)[12]。上海市地方標(biāo)準(zhǔn)DB31/T240-2001對(duì)小型豬遺傳質(zhì)量控制雖然有指導(dǎo)原則，卻沒(méi)有具體的檢測(cè)方法。DB11/T828.3-2011中的25個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記分布于19對(duì)染色體中的18對(duì)上(缺少12號(hào)染色體標(biāo)記)，較為全面的反應(yīng)小型豬的遺傳概貌。本研究即豐富了該標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)際應(yīng)用。

從結(jié)果可見(jiàn)，三個(gè)群體均存在SWr312位點(diǎn)的非特異擴(kuò)增，依據(jù)其余24個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)的遺傳信息進(jìn)行了質(zhì)量評(píng)價(jià)與判斷。三個(gè)品系的小型豬平均雜合度均在0.5～0.7之間，但農(nóng)大I系小型豬的平均雜合度與期望雜合度經(jīng)卡方檢驗(yàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，則農(nóng)大I系小型豬此次采樣群體不能認(rèn)定為合格的封閉群小型豬群體。農(nóng)大II系和農(nóng)大III系均為合格的封閉群小型豬群體。

3.2 三品系農(nóng)大小型豬群體遺傳多樣性

3.2.1 多態(tài)信息含量：多態(tài)信息含量(PIC)是衡量基因座位多態(tài)性的指標(biāo)[14]。高度多態(tài)性座位(PIC>0.5)可提供高度豐富的遺傳信息；中度多態(tài)性座位(0.25

本研究中，三品系農(nóng)大小型豬的平均多態(tài)信息含量均大于0.5。就不同位點(diǎn)而言， 僅SW974和S0005在農(nóng)大II系中表現(xiàn)為低度多態(tài)位點(diǎn)，提供的遺傳信息較差；其余各位點(diǎn)在群體均為中高度多態(tài)位點(diǎn)，提供了豐富合理的遺傳信息。

3.2.2 遺傳距離和遺傳相似系數(shù)：遺傳距離和遺傳相似系數(shù)互為負(fù)對(duì)數(shù)關(guān)系。遺傳距離越大，則遺傳相似系數(shù)越??；反之亦然[15]。本研究中，農(nóng)大I系與農(nóng)大II系的遺傳距離最大(0.4251)，其遺傳相似系數(shù)也最小(0.6537)；農(nóng)大II系和農(nóng)大III系的遺傳距離最小(0.2084)，其遺傳相似系數(shù)也最大(0.8119)；農(nóng)大I系和農(nóng)大III系的遺傳距離居中(0.3351)，其遺傳相似系數(shù)也居中(0.7153)。兩者共同反映群體的遺傳分化，也即在群體親緣關(guān)系上，農(nóng)大II系和農(nóng)大III系小型豬遺傳分化小親緣關(guān)系更近，農(nóng)大I系與農(nóng)大II系小型豬遺傳分化大親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

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Population genetic quality analysis of 3 subbreeds of China Agricultural University miniature pigs in Beijing

WEI Jie, Gong Wei, Wang Hong, LI Xiao-bo, FU Rui, Wang Ji, XING Jin, FENG Yu-fang, WANG Shu-jing, GAO Zheng-qin, YUE Bing-fei

(National Institute for Food and Drug Control, Beijing 100050, China)

Objective To analyze and evaluate the population genetic quality of 3 subbreeds of China Agricultural University miniature pigs in Beijing. Method According to the local standard DB11/T828.3-2011, 25 pairs of microsatellite primers were used in 3 subbreeds of China Agricultural University miniature pigs, and software Popgen32 was used to process the data. Results 24 microsatellite loci shared 130,122 and 138 alleles in the China Agricultural University miniature pigs I, II, III, respectively. The average heterozygosity was 0.6759, 0.5967 and 0.6779, respectively, while the average polymorphism information content (PIC) was 0.6344, 0.5540 and 0.6403, respectively. The genetic distance between China Agricultural University miniature pig II and III was 0.4251, while the genetic distance between China Agricultural University miniature pig I and II was 0.2084. Conclusions In the 3 subbreeds, China Agricultural University miniature pigs II and III have genetic stability and genetic diversity, and both of which satisfy with the genetic characteristics of closed colony laboratory animal．

China Agricultural University miniature pig; Microsatellite; Subbreed; Population genetics

中國(guó)食品藥品檢定研究院中青年基金(2014C4)。

魏杰(1982-)，女，碩士。研究方向：免疫遺傳檢測(cè)。E-mail：jane3040320@163.com。

岳秉飛(1960-)，男，研究員，博士。研究方向：動(dòng)物遺傳學(xué)。E-mail：y6784@126.com。

R-33

A

1671-7856(2016)10-0050-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.10.010

2016-05-02