魏 杰，鞏 薇，王 洪，李曉波，付 瑞，王 吉，邢 進，

馮育芳，王淑菁，高正琴，岳秉飛

(中國食品藥品檢定研究院，北京 100050)

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北京中國農(nóng)大小型豬三個亞系群體的遺傳狀況分析

魏 杰，鞏 薇，王 洪，李曉波，付 瑞，王 吉，邢 進，

馮育芳，王淑菁，高正琴，岳秉飛

(中國食品藥品檢定研究院，北京 100050)

目的 對北京地區(qū)中國農(nóng)大小型豬三個亞系群體進行遺傳質(zhì)量評價與分析。 方法 利用DB11/T828.3-2011中的25對微衛(wèi)星引物，對3個中國農(nóng)大小型豬亞系群體進行微衛(wèi)星分型，利用群體遺傳分析軟件Popgen32對所得結(jié)果進行處理分析。 結(jié)果 農(nóng)大I系、農(nóng)大II系和農(nóng)大III系小型豬群體分別得到130、122和138個等位基因，平均雜合度分別為0.6759、0.5967、0.6779，平均多態(tài)信息含量(PIC)分別為0.6344、0.5540、0.6403；農(nóng)大II系和農(nóng)大III系的遺傳距離為0.4251，農(nóng)大I系與農(nóng)大II系的遺傳距離為0.2084。 結(jié)論 三個亞系中，農(nóng)大II系和農(nóng)大III系小型豬均具有較好的遺傳多樣性和穩(wěn)定性，符合封閉群動物的群體遺傳特征。

農(nóng)大小型豬；微衛(wèi)星標(biāo)記；亞系；群體遺傳

小型豬在解剖學(xué)、生理學(xué)、疾病發(fā)生機理等方面與人有極高的相似性，近年來已成為生物醫(yī)學(xué)研究中廣泛應(yīng)用的非嚙齒類實驗動物[1-3]。上世紀(jì)80年代，北京農(nóng)業(yè)大學(xué)以貴州叢江和廣西環(huán)江引進的香豬為親本，經(jīng)近交育種、負(fù)向選擇等手段培育成中國農(nóng)大I系小型豬。又根據(jù)不同用途，與北京本地黑豬雜交培育出了抗逆性強的農(nóng)大II系；與蘭德瑞斯雜交培育成了白色的農(nóng)大III系[4,5]。該系列小型豬統(tǒng)稱農(nóng)大小型豬或中國實驗用小型豬(Chinese experimental mini-pig，CEMP)，具有體型小、基因純、健康敏感、抗逆性強的特點，并在心臟模型、外科、口腔、燒傷等領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用[ 5-8]。

三個亞系的親本來源的不同，必然構(gòu)成了種群上的差異。在中國農(nóng)大小型豬的選育上，已經(jīng)過78項生理生化指標(biāo)測定及病原凈化，但對與遺傳質(zhì)量狀況的調(diào)查尚未見報道[9]。對于品系資源的保護和發(fā)展，需要依托科學(xué)的遺傳理論和技術(shù)。微衛(wèi)星DNA標(biāo)記即是群體遺傳學(xué)研究中最常使用的分子標(biāo)記之一[10]。它是以1-6個核苷酸為單位的段串聯(lián)重復(fù)序列標(biāo)記來進行遺傳的種質(zhì)鑒定和多樣性分析等，具有數(shù)量大、分布廣、多態(tài)性豐富、共顯性遺傳，檢測快速簡便且結(jié)果穩(wěn)定性重復(fù)性好等特點[11]。2012年3月，應(yīng)用微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)的北京市地方標(biāo)準(zhǔn)DB11/T828.3-2011正式實施，這是目前針對小型豬遺傳質(zhì)量控制最為具體的地方標(biāo)準(zhǔn)。本研究即依據(jù)DB11/T828.3-2011中25對微衛(wèi)星引物，對北京地區(qū)三個農(nóng)大亞系小型豬的群體進行遺傳構(gòu)成分析，闡明農(nóng)大小型豬三個亞系的遺傳質(zhì)量，從而為農(nóng)大小型豬的生產(chǎn)繁育提供科學(xué)的依據(jù)，同時豐富地標(biāo)DB11/T828.3-2011在實際檢測中的應(yīng)用。

1 材料和方法

1.1 樣本

按照DB11/T828.3-2011的要求，分別從甲、乙2家單位抽取封閉繁育4代以上、不同窩別，雌雄各半的小型豬樣本，采抗凝血用于提取DNA進行遺傳檢測分析。采樣單位、動物品系數(shù)量等信息詳見表1。

1.2 樣本DNA的制備[12]

用改良酚-氯仿抽提法從血樣中提取基因組DNA，雙蒸H2O溶解，1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并用紫外分光光度計測定DNA純度及含量，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物[13]

本研究所用25對引物均按照北京市地方標(biāo)準(zhǔn)對封閉群實驗用小型豬的規(guī)定，并由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。序列詳見DB11/T828.3-2011附錄B。

1.4 主要試劑和儀器

Taq酶，DNA marker均購自上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；dNTP、瓊脂糖為Takara公司產(chǎn)品；其余試劑均為國產(chǎn)。

Mettler GB303電子天平，Bio-Rad MyCycler型PCR儀，Bio-Rad Model 3000Xi型電泳儀，GelLogic 212PRO 紫外與可見光凝膠分析裝置。

1.5 PCR擴增程序

參照DB11/T828.3-2011中的PCR反應(yīng)體系進行實驗，并調(diào)整模板引物濃度，底物濃度及酶含量，采用如下反應(yīng)體系：總反應(yīng)體系20 μL，其中10× PCR buffer 2 μL，上下游引物 (10 pmol/μL) 0.8 μL，dNTP (100 μmol/L) 1.2 μL，0.2 μL Taq 酶 (2.5U/μL)，基因組DNA 0.7 μL(50 ng～100 ng),純水(ddH2O)補齊體積。鎂離子濃度詳見DB11/T828.3-2011附錄B。

PCR 反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性, 4 min；94℃變性，30 s；退火溫度(Tm參照DB11/T828.3-2011附錄表B)，30 s；72℃延伸，30 s；35個循環(huán)；72℃繼續(xù)延伸7 min；擴增產(chǎn)物4℃保存。

1.6 電泳結(jié)果及記錄

2.5%的瓊脂糖凝膠電泳，電壓110 V，由負(fù)極到正極，電泳時間35 min。溴化乙啶(2 μg/mL)染色，紫外可見分析裝置記錄拍照。無效擴增和非特異擴增需要優(yōu)化條件重新實驗，重復(fù)試驗無結(jié)果記為無效位點。

擴增穩(wěn)定條帶送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進行STR分型掃描，依據(jù)掃描結(jié)果記錄純合子與雜合子，并依據(jù)片段大小依次記錄為AA、AB、BB、BC、CC……純合子與雜合子判定見圖1，圖2。片段大小記錄示例詳見表2。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

統(tǒng)計各位點等位基因的組成，利用Popgen32軟件計算不同個體在各微衛(wèi)星位點上的基因頻率、平均有效等位基因數(shù)(Ne)、觀測雜合度、期望雜合度、平均雜合度(H)；利用Littleprogram 0.6計算各位點的多態(tài)性信息含量(PIC)。

圖1 純合子示例圖(S0091)Fig.1 Example picture for homozygote(S0091)

圖2 雜合子示例圖(S0091)Fig.2 Example picture for heterozygote (S0091)

單位Company生產(chǎn)許可證號Productionlicense品系Strains被毛顏色Color數(shù)量(頭)Number甲SCXK(京)2013-0005農(nóng)大II系黑15乙SCXK(京)2012-0005農(nóng)大I系黑15乙SCXK(京)2012-0005農(nóng)大III系白15

表2 微衛(wèi)星掃描結(jié)果片段記錄示例表(SW2494)

1.8 結(jié)果評價

群體遺傳質(zhì)量評價參見DB11/T828.3-2011的判定標(biāo)準(zhǔn)，即采用平均雜合度指標(biāo)或群體平衡狀態(tài)方法進行評價[13]。當(dāng)平均雜合度在0.5～0.7時，且期望雜合度與觀測雜合度經(jīng)卡方檢驗無明顯差異時，群體為合格的封閉群實驗用小型豬群體?；蛴萌后w是否達到平衡狀態(tài)來判定，如果沒有達到平衡狀態(tài)，說明群體的基因頻率或基因型頻率發(fā)生變化，該封閉群實驗用小型豬群體判為不合格。

對于群間的遺傳變異，采用近交系數(shù)、遺傳距離等指標(biāo)進行分析與評價遺傳結(jié)構(gòu)和親緣關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 農(nóng)大三個亞系小型豬的群體遺傳質(zhì)量評價

經(jīng)測定，共有24個微衛(wèi)星標(biāo)記位點在I系、農(nóng)大II系和農(nóng)大III系小型豬群體中得到穩(wěn)定擴增。SWr312位點在三個群體樣本中均存在嚴(yán)重的非特異擴增，故而舍棄該位點。

農(nóng)大I系、農(nóng)大II系和農(nóng)大III系小型豬群體的平均雜合度分別為0.6759、0.5967、0.6779，平均多態(tài)信息含量(PIC)分別為0.6344、0.5540、0.6403，群體卡方值分別為48.48、29.76、19.85，P值分別為0.0022、0.1927、0.7054。三個亞系農(nóng)大小型豬平均雜合度均在0.5～0.7之間，但農(nóng)大I系小型豬群體期望雜合度與觀測雜合度經(jīng)卡方檢驗有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，不能判定為合格的封閉群小型豬群體，其余兩個亞系可判定為合格群體。各品系小型豬遺傳參數(shù)詳見表3～表5。

2.2 農(nóng)大小型豬群體的遺傳距離與遺傳相似系數(shù)

農(nóng)大I系、農(nóng)大II系和農(nóng)大III系三個群體分別得到了130個、122個和138個等位基因。將三個亞系的農(nóng)大小型豬群體作進一步的分析，兩兩比較得到農(nóng)大I系與農(nóng)大II系的遺傳距離為0.4251，農(nóng)大I系和農(nóng)大III系的遺傳距離為0.3351，農(nóng)大II系和農(nóng)大III系的遺傳距離為0.2084。遺傳相似系數(shù)與遺傳距離互為負(fù)對數(shù)關(guān)系，結(jié)果詳見表6。

表3 農(nóng)大Ⅰ系小型豬群體遺傳參數(shù)表

*P<0.05

表4 農(nóng)大II系小型豬群體遺傳參數(shù)表

表5 農(nóng)大III系小型豬群體遺傳參數(shù)表

表6 三群農(nóng)大小型豬的遺傳距離與遺傳相似系數(shù)

Tab.6 Genetic distance and genetic identity of 3 groups of China Agricultural University miniature pigs

農(nóng)大I系CEMPⅠ農(nóng)大II系CEMPⅡ農(nóng)大III系CEMPⅢ-0.65370.7153農(nóng)大II系(CEMPII)0.4251-0.8119農(nóng)大III系(CEMPIII)0.33510.2084-

注：對角線以上為遺傳相似性指數(shù)，對角線以下為遺傳距離。

Note. Data above the diagonal are genetic similarity index, and which below it are genetic distance.

3 討論

3.1 遺傳地方標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)用與三品系農(nóng)大小型豬群體的遺傳質(zhì)量評價

DB11/T828.3-2011是國內(nèi)第一版有具體檢測方法的小型豬遺傳質(zhì)量地方標(biāo)準(zhǔn)，但目前其應(yīng)用研究并不多見[12]。上海市地方標(biāo)準(zhǔn)DB31/T240-2001對小型豬遺傳質(zhì)量控制雖然有指導(dǎo)原則，卻沒有具體的檢測方法。DB11/T828.3-2011中的25個微衛(wèi)星標(biāo)記分布于19對染色體中的18對上(缺少12號染色體標(biāo)記)，較為全面的反應(yīng)小型豬的遺傳概貌。本研究即豐富了該標(biāo)準(zhǔn)的實際應(yīng)用。

從結(jié)果可見，三個群體均存在SWr312位點的非特異擴增，依據(jù)其余24個標(biāo)記位點的遺傳信息進行了質(zhì)量評價與判斷。三個品系的小型豬平均雜合度均在0.5～0.7之間，但農(nóng)大I系小型豬的平均雜合度與期望雜合度經(jīng)卡方檢驗有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，則農(nóng)大I系小型豬此次采樣群體不能認(rèn)定為合格的封閉群小型豬群體。農(nóng)大II系和農(nóng)大III系均為合格的封閉群小型豬群體。

3.2 三品系農(nóng)大小型豬群體遺傳多樣性

3.2.1 多態(tài)信息含量：多態(tài)信息含量(PIC)是衡量基因座位多態(tài)性的指標(biāo)[14]。高度多態(tài)性座位(PIC>0.5)可提供高度豐富的遺傳信息；中度多態(tài)性座位(0.25

本研究中，三品系農(nóng)大小型豬的平均多態(tài)信息含量均大于0.5。就不同位點而言， 僅SW974和S0005在農(nóng)大II系中表現(xiàn)為低度多態(tài)位點，提供的遺傳信息較差；其余各位點在群體均為中高度多態(tài)位點，提供了豐富合理的遺傳信息。

3.2.2 遺傳距離和遺傳相似系數(shù)：遺傳距離和遺傳相似系數(shù)互為負(fù)對數(shù)關(guān)系。遺傳距離越大，則遺傳相似系數(shù)越小；反之亦然[15]。本研究中，農(nóng)大I系與農(nóng)大II系的遺傳距離最大(0.4251)，其遺傳相似系數(shù)也最小(0.6537)；農(nóng)大II系和農(nóng)大III系的遺傳距離最小(0.2084)，其遺傳相似系數(shù)也最大(0.8119)；農(nóng)大I系和農(nóng)大III系的遺傳距離居中(0.3351)，其遺傳相似系數(shù)也居中(0.7153)。兩者共同反映群體的遺傳分化，也即在群體親緣關(guān)系上，農(nóng)大II系和農(nóng)大III系小型豬遺傳分化小親緣關(guān)系更近，農(nóng)大I系與農(nóng)大II系小型豬遺傳分化大親緣關(guān)系較遠。

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Population genetic quality analysis of 3 subbreeds of China Agricultural University miniature pigs in Beijing

WEI Jie, Gong Wei, Wang Hong, LI Xiao-bo, FU Rui, Wang Ji, XING Jin, FENG Yu-fang, WANG Shu-jing, GAO Zheng-qin, YUE Bing-fei

(National Institute for Food and Drug Control, Beijing 100050, China)

Objective To analyze and evaluate the population genetic quality of 3 subbreeds of China Agricultural University miniature pigs in Beijing. Method According to the local standard DB11/T828.3-2011, 25 pairs of microsatellite primers were used in 3 subbreeds of China Agricultural University miniature pigs, and software Popgen32 was used to process the data. Results 24 microsatellite loci shared 130,122 and 138 alleles in the China Agricultural University miniature pigs I, II, III, respectively. The average heterozygosity was 0.6759, 0.5967 and 0.6779, respectively, while the average polymorphism information content (PIC) was 0.6344, 0.5540 and 0.6403, respectively. The genetic distance between China Agricultural University miniature pig II and III was 0.4251, while the genetic distance between China Agricultural University miniature pig I and II was 0.2084. Conclusions In the 3 subbreeds, China Agricultural University miniature pigs II and III have genetic stability and genetic diversity, and both of which satisfy with the genetic characteristics of closed colony laboratory animal．

China Agricultural University miniature pig; Microsatellite; Subbreed; Population genetics

中國食品藥品檢定研究院中青年基金(2014C4)。

魏杰(1982-)，女，碩士。研究方向：免疫遺傳檢測。E-mail：jane3040320@163.com。

岳秉飛(1960-)，男，研究員，博士。研究方向：動物遺傳學(xué)。E-mail：y6784@126.com。

R-33

A

1671-7856(2016)10-0050-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.10.010

2016-05-02