王立鵬， 李永旺， 郭連香， 時(shí)長(zhǎng)軍

(蘇州西山生物技術(shù)有限公司，江蘇 215123)

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PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)恒河猴和食蟹猴群體中幽門螺桿菌和“獼猴螺桿菌”的感染

王立鵬， 李永旺， 郭連香， 時(shí)長(zhǎng)軍

(蘇州西山生物技術(shù)有限公司，江蘇 215123)

目的 調(diào)查國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)恒河猴和食蟹猴中幽門螺桿菌和“獼猴螺桿菌”的感染情況。方法 參考文獻(xiàn)中的螺桿菌屬16S rRNA和幽門螺桿菌16S rRNA的引物序列，和新設(shè)計(jì)的“獼猴螺桿菌”16S rRNA特異性引物，在人工養(yǎng)殖的45只成年恒河猴和90只成年食蟹猴糞便樣本中，通過(guò)qPCR或常規(guī)PCR檢測(cè)來(lái)初步調(diào)查這兩種獼猴中兩種螺桿菌的感染情況。結(jié)果 在恒河猴中幽門螺桿菌和“獼猴螺桿菌”的感染率均為100%，在食蟹猴中幽門螺桿菌和“獼猴螺桿菌”的感染率分別為100%和97.8%。結(jié)論 證實(shí)我國(guó)人工繁育飼養(yǎng)的恒河猴和食蟹猴普遍存在“獼猴螺桿菌”感染。幽門螺桿菌和“獼猴螺桿菌”幾乎同時(shí)存在于所有人工繁育的實(shí)驗(yàn)猴個(gè)體中，可能會(huì)對(duì)這兩種獼猴的健康以及相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性存在不利影響。

恒河猴；食蟹猴；幽門螺桿菌； 獼猴螺桿菌；感染；診斷

Warren和Marshall在1983年從胃炎患者胃粘膜活檢標(biāo)本中首次分離出幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，HP)，此后以該細(xì)菌為代表菌建立了螺桿菌屬。目前，螺桿菌屬已有23個(gè)種[1]。幽門螺桿菌，螺旋形彎曲，革蘭氏染色陰性，長(zhǎng)2～4 μm，直徑0.4 μm，菌體一端有4條鞭毛[2]。在人體內(nèi)，幽門螺桿菌主要定居于胃竇粘膜，會(huì)導(dǎo)致胃炎和胃潰瘍，WHO已將其定為胃癌的第一類致癌因子[3]。體外研究表明幽門螺桿菌對(duì)多種抗生素敏感，但是在體內(nèi)應(yīng)用發(fā)現(xiàn)感染人群的許多幽門螺桿菌對(duì)抗生素具有抗性。為了研究出更有效的根治幽門螺桿菌的藥物或疫苗，預(yù)防胃癌的發(fā)生，需要構(gòu)建能夠感染幽門螺桿菌的動(dòng)物模型[4]。目前，只有家貓和非人靈長(zhǎng)類是幽門螺桿菌的自然宿主動(dòng)物[5]。

1987～1990年期間的5篇研究報(bào)告表明，在恒河猴(rhesus monkey)和南方豚尾獼猴(Southern pig-tailed macaque)中存在幽門螺桿菌的自然感染；而在食蟹猴(cynomolgus monkey)中則既沒(méi)有發(fā)現(xiàn)自然感染，人工感染幽門螺桿菌也無(wú)效[2，6-9]。1993年，Takahashi的團(tuán)隊(duì)用人源和恒河猴源的幽門螺桿菌人工感染食蟹猴，結(jié)果證明食蟹猴可以被人工感染幽門螺桿菌[10，11]。1999年，Reindel等首次發(fā)現(xiàn)食蟹猴也存在幽門螺桿菌的自然感染[12]。目前，國(guó)內(nèi)仍未見(jiàn)對(duì)猴群中幽門螺桿菌自然感染情況的調(diào)查研究。

2001年，F(xiàn)ox等學(xué)者從恒河猴結(jié)腸組織中分離培養(yǎng)出一種新的螺桿菌，暫時(shí)命名為“獼猴螺桿菌”(Helicobactermacacae)。“獼猴螺桿菌”，螺旋形彎曲，革蘭氏染色陰性，長(zhǎng)2～3 μm，直徑0.2 μm，菌體兩端各有1條帶鞘的鞭毛[13]。該菌長(zhǎng)期存在于腸道中，可能與結(jié)腸炎的發(fā)生有關(guān)，引發(fā)慢性痢疾、體重下降和脫水等癥狀[14]。目前，國(guó)內(nèi)尚未有對(duì)猴群中該種螺桿菌感染情況的調(diào)查研究。

本研究用螺桿菌屬16S rRNA特異性引物的普通PCR方法，對(duì)我國(guó)人工繁育的兩種獼猴群中的螺桿菌流行情況進(jìn)行初步調(diào)查。確認(rèn)螺桿菌在猴群中有感染后，進(jìn)一步以幽門螺桿菌16S rRNA特異性引物實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法(qPCR)對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)恒河猴和食蟹猴的幽門螺桿菌感染進(jìn)行調(diào)查。針對(duì)“獼猴螺桿菌”16S rRNA特異性保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR方法檢測(cè)我國(guó)獼猴和食蟹猴中是否存在“獼猴螺桿菌”感染。由于“Helicobactermacacae”(“獼猴螺桿菌”)尚未被原核生物命名國(guó)際委員會(huì)(ICSP)正式采用，因此本文用引號(hào)標(biāo)記以示區(qū)別。

1 材料和方法

1.1 獼猴糞便樣本

45只2～4歲的雄性恒河猴和90只雌雄各半的4歲左右食蟹猴的新鮮糞便樣本分別采集自不同實(shí)驗(yàn)猴人工繁育場(chǎng)，樣本冷藏空運(yùn)至本公司，-20℃保存待用。

1.2 糞便樣本DNA提取

取恒河猴或食蟹猴的糞便樣本200 mg，用糞便基因組DNA提取試劑盒(天根，貨號(hào)#DP328)提取核酸，操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。最終用100 μL無(wú)菌水洗脫，-20℃保存待用。

1.3 幽門螺桿菌陽(yáng)性對(duì)照制備

Helicobacterpylori株(ATCC 43504)，用含有血瓊脂和7%馬血等的彎曲桿菌選擇性血瓊脂培養(yǎng)基，在37℃微需氧環(huán)境下培養(yǎng)。之后用無(wú)菌棉棒刮取部分菌落，計(jì)數(shù)并稀釋至109CFU/mL，10倍梯度稀釋至100CFU/mL。經(jīng)PCR測(cè)試，103CFU/mL菌液提取的DNA模板可作為PCR反應(yīng)的陽(yáng)性對(duì)照。

1.4 其他細(xì)菌DNA樣本

從肺炎克雷伯氏桿菌CVCC3699，大腸埃希氏菌 CMCC44102，嗜肺巴斯德桿菌ATCC35149，假結(jié)核耶爾森CMCC53504，乙型溶血性鏈球菌CMCC32210，肺炎鏈球菌ATCC49619，多殺巴斯德桿菌CVCC458，金黃色葡萄球菌CMCC26003，雞白痢沙門氏菌CVCC528，志賀氏菌CMCC51252，小腸結(jié)腸耶爾森氏菌GIM1.265及空腸彎曲桿菌ATCC33291中提取基因組DNA，用于3種引物的特異性實(shí)驗(yàn)。

1.5 引物及質(zhì)粒合成

引物和質(zhì)粒的合成均由蘇州金唯智生物技術(shù)有限公司合成和構(gòu)建。螺桿菌屬16S rRNA特異性上游引物HSPP767 F: GGCTATGACGGGTATCCG GC，下游引物HSPP767 R:GCCGTGCAGCACCT GTTTTC[15]；幽門螺桿菌16S rRNA特異性上游引物HP-P1 F:TTTGTTAGAGAAGATAATGACGGTATCTA AC，下游引物HP-P1R:CATAGGATTTCACACCT GACTGACTATC[4]；“獼猴螺桿菌”16S rRNA特異性引物H.M8F：GGGATGCTCTTAGAAATGC，H.M8R：GCTCTTTACGCCCAGTGATT，為本公司設(shè)計(jì)。HSPP767 F/HSPP767 R、HP-P1F/HP-P1R和H.M8F/H.M8R的靶序列人工合成后分別連接到pUC57載體上，即為pc12、pc16和pc20。

1.6 普通PCR反應(yīng)

PCR儀為Eppendorf 6321。反應(yīng)體系包含10 mM Tris-Cl(pH 8.3)，50 mM KCl和2 mM MgCl2，4種dNTP各0.2 mM，上下游引物各0.4 μM，1U rTaq DNA聚合酶(Takara，#KA201A)，5 μL糞便樣本提取的DNA模板，總體積為25 μL。PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，之后72℃延伸5 min。2%瓊脂糖凝膠電泳，5 V/cm，100 bp DNA marker(天根，#BSA22S1)4 μL，凝膠中摻入0.01% GeneRed(博美達(dá)，#41003-0.5 mL)作為熒光染料，由凝膠成像分析儀(上海勤翔，Genosens1560)采集電泳結(jié)果。每次實(shí)驗(yàn)中，均設(shè)置質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照和模板空白對(duì)照，所有測(cè)試組均重復(fù)2次。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)

PCR儀為ABI 7500 Real-Time PCR System。反應(yīng)體系為20 μL，含2× Premix Ex Taq(SYBR)10 μL，ROX(50×)0.4 μL，上下游引物各0.2 μM，補(bǔ)加無(wú)菌水至20 μL。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火延伸31 s，采集信號(hào)，40個(gè)循環(huán)；95℃變性15 s，60℃退火延伸1 min，95℃變性15 s，60℃ 15 s繪制溶解曲線。每次實(shí)驗(yàn)中，均設(shè)置質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照和模板空白對(duì)照，所有測(cè)試組均重復(fù)2次。

1.8 擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序與比對(duì)

部分PCR產(chǎn)物送交蘇州金唯智生物技術(shù)有限公司測(cè)序。序列比對(duì)分析軟件為DNAMAN 6.0。

2 結(jié)果

2.1 PCR方法建立

以各自相應(yīng)的質(zhì)粒為模板，10-1～10-12做系列梯度稀釋，用于3種引物的敏感性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明HSPP767和H.M8的普通PCR檢測(cè)下限為1 132拷貝/5 μL，HP-P1引物的qPCR檢測(cè)下限為68拷貝/5 μL。3對(duì)引物均不會(huì)擴(kuò)增雞白痢沙門氏菌、志賀氏菌、小腸結(jié)腸耶爾森氏菌、大腸埃希氏菌及空腸彎曲桿菌等細(xì)菌的核酸，表明3對(duì)引物用于糞便提取核酸的PCR特異性好。這一部分的結(jié)果未展示。

2.2 獼猴中螺桿菌屬細(xì)菌檢測(cè)

以HSPP767引物對(duì)恒河猴和食蟹猴的糞便提取DNA樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，45份恒河猴糞便樣本均為螺桿菌陽(yáng)性；90份食蟹猴糞便樣本中有89份為螺桿菌陽(yáng)性，僅有1份樣本為螺桿菌陰性。陽(yáng)性樣本擴(kuò)增產(chǎn)物大小與目的擴(kuò)增片段相同，為767 bp。結(jié)果見(jiàn)圖1和圖2。

2.3 獼猴中幽門螺桿菌的檢測(cè)

用HP-P1引物對(duì)恒河猴和食蟹猴的糞便提取DNA樣本進(jìn)行qPCR檢測(cè)，135份獼猴的糞便樣本檢測(cè)結(jié)果全部為幽門螺桿菌陽(yáng)性，隨機(jī)選取3份樣本的擴(kuò)增產(chǎn)物送交測(cè)序并與靶序列進(jìn)行分析比對(duì)，確認(rèn)擴(kuò)增產(chǎn)物均為幽門螺桿菌。擴(kuò)增產(chǎn)物見(jiàn)結(jié)果圖3。

2.4 獼猴中“獼猴螺桿菌”的檢測(cè)

以H.M8引物對(duì)恒河猴和食蟹猴的糞便提取DNA樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，45份恒河猴糞便樣本均為“獼猴螺桿菌”陽(yáng)性；90份食蟹猴樣本中，有88份為“獼猴螺桿菌”陽(yáng)性，2份陰性。陽(yáng)性樣本擴(kuò)增產(chǎn)物大小與目的片段相同，為493 bp。隨機(jī)選取3份擴(kuò)增產(chǎn)物送交測(cè)序，結(jié)果表明擴(kuò)增子與靶序列高度相似，確認(rèn)為“獼猴螺桿菌”。結(jié)果見(jiàn)圖4和圖5。另外，圖4中展示了這對(duì)引物以Helicobacterpylori菌株DNA為模板時(shí)，擴(kuò)增結(jié)果是陰性的，表明該引物不擴(kuò)增幽門螺桿菌。以上六項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果的匯總見(jiàn)表1。

表1 恒河猴和食蟹猴中螺桿菌感染統(tǒng)計(jì)

M：100 bp marker ladder；BC：不含核酸模板的空白對(duì)照組；PC：陽(yáng)性質(zhì)粒對(duì)照PC12；泳道1～45：為45份恒河猴糞便提取DNA樣本擴(kuò)增產(chǎn)物圖1 恒河猴45份樣本中螺桿菌的檢測(cè)結(jié)果M, 100 bp marker ladder; BC, blank control without nucleic acid template; PC, positive control with plasmid PC12; Lane 1-45, 45 DNA samples from feces of rhesus macaques.Fig.1 PCR results of 45 rhesus macaques stool samples with HSPP767 primers for Helicobacter.

M：100 bp marker ladder；BC：不含核酸模板的空白對(duì)照組；PC：陽(yáng)性質(zhì)粒對(duì)照pc12；泳道1～90：90份食蟹猴糞便提取DNA樣本圖2 食蟹猴90份樣本的螺桿菌檢測(cè)結(jié)果M, 100 bp marker ladder; BC, Blank control without nucleic acid template; PC, positive control with plasmid pc12; Lane 1-90, 90 DNA samples from feces of cynomolgus monkeys.Fig.2 PCR results of the HSPP767 primers for Helicobacter in 90 cynomolgus monkeys.

——：完全一致序列；….:空缺序列圖3 恒河猴3個(gè)樣本HP-P1產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果比對(duì)“——”: The identical sequence; “….”: Absence of sequence.Fig.3 The alignment results of 3 amplicons of HP-P1F/ HP-P1R in rhesus macaques

M：100 bp marker ladder；BC：不含核酸模板的空白對(duì)照組；PC：質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照pc20；HP：H. pylori對(duì)照；泳道1～45：45份恒河猴糞便提取DNA樣本；泳道46～135：90份食蟹猴提取DNA樣本圖4 恒河猴和食蟹猴樣本中“獼猴螺桿菌”PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果M, 100 bp marker ladder; BC, blank control without nucleic acid template; PC, positive control with pc20; HP, H. pylori DNA; Lane 1-45, 45 DNA samples from feces of rhesus macaques; Lane 46-135, 90 DNA samples from feces of cynomolgus monkeysFig.4 PCR results of the Helicobacter macacae in rhesue and cynomolgus monkeys.

——：完全一致序列；….：空缺序列圖5 恒河猴3份樣本H.M8擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果比對(duì)——: The Identical sequence;….: Absence of sequence.Fig.5 The alignment result of the amplicon of H.M8 primers with 3 rhesue macaques samples.

3 討論

本研究建立了PCR用糞便樣本檢測(cè)實(shí)驗(yàn)猴幽門螺桿菌和“獼猴螺桿菌”的方法，并證實(shí)我國(guó)人工繁育的恒河猴和食蟹猴中普遍存在這兩種螺桿菌感染。

恒河猴和食蟹猴中自然感染幽門螺桿菌后，通常都不會(huì)表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀。內(nèi)窺鏡檢常見(jiàn)胃黏膜紅斑、表層粘膜增生及單核細(xì)胞浸潤(rùn)等炎癥反應(yīng)，但未見(jiàn)萎縮性胃炎或胃癌的發(fā)生[2，12]。1988年，Baskerville等在11只恒河猴中以組織學(xué)檢查和胃黏膜微生物分離培養(yǎng)法確認(rèn)其中有6只被幽門螺桿菌感染，感染率為54.5%[7]；1990年，Arther等以上述相同的方法在34只恒河猴中檢測(cè)到12只被幽門螺桿菌自然感染，感染率為35.5%[2]；1995年，Dubios等用ELISA法檢測(cè)血清中抗幽門螺桿菌IgG水平，在196只不同年齡段和飼養(yǎng)方式(包括野生)的恒河猴中，發(fā)現(xiàn)在1歲恒河猴的幽門螺桿菌感染率已達(dá)到50%以上，2～6歲時(shí)感染率為80%左右，在7～10歲時(shí)感染率最高，可達(dá)到90%左右[16]；1997年，Laurence等用PCR檢測(cè)了23只1～3歲中國(guó)來(lái)源恒河猴的胃部活檢組織樣本，其中有21只幽門螺桿菌陽(yáng)性，感染率為91.3%；而同時(shí)用培養(yǎng)的方法檢出率僅52%[5]。這些結(jié)果表明，血清學(xué)或PCR方法檢測(cè)幽門螺桿菌的敏感性遠(yuǎn)高于組織學(xué)檢查或微生物培養(yǎng)。本文用16S rRNA特異性引物對(duì)45只恒河猴糞便樣本的篩查表明，在2～4歲的恒河猴群中，幽門螺桿菌感染率為100%。此結(jié)果說(shuō)明PCR檢測(cè)糞便樣本幽門螺桿菌在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康監(jiān)測(cè)應(yīng)用的可行性，并證明我國(guó)恒河猴群體中幽門螺桿菌感染的普遍性。

目前，對(duì)食蟹猴感染幽門螺桿菌的研究很少[12]。由于恒河猴資源有限，而食蟹猴的人工養(yǎng)殖更普遍，生物醫(yī)藥研究中應(yīng)用更廣泛。早期用內(nèi)窺鏡檢、胃黏膜樣本組織學(xué)檢查和微生物培養(yǎng)法進(jìn)行的調(diào)查研究認(rèn)為食蟹猴既不會(huì)自然感染幽門螺桿菌，也對(duì)人工感染的人源和恒河猴源的幽門螺桿菌不敏感[2，6]。相反，Takahashi等在1993年成功地用幽門螺桿菌人工感染了食蟹猴[10，11]。Reindel等1999年也報(bào)道了與上述相同方法進(jìn)行的調(diào)查，發(fā)現(xiàn)食蟹猴可以自然感染幽門螺桿菌，在63只2～4歲的食蟹猴中，幽門螺桿菌陽(yáng)性感染率達(dá)69.8%，病理研究也確認(rèn)感染造成組織炎癥改變[12]。目前，尚未見(jiàn)有用PCR方法對(duì)食蟹猴中幽門螺桿菌感染情況的調(diào)查。本文首次用16S rRNA特異性引物對(duì)90只雌雄各半的4歲食蟹猴的糞便樣本進(jìn)行調(diào)查研究，結(jié)果表明幽門螺桿菌感染率為100%，比以往國(guó)外報(bào)道的感染率都高，與本文中恒河猴群中感染率相同，而傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)或血清學(xué)方法檢測(cè)幽門螺桿菌有低敏感性的局限。

Fox等在2007年從一例患有腺癌的恒河猴回腸內(nèi)容物中分離出一種螺桿菌新種并命名為“獼猴螺桿菌”。此后，該研究團(tuán)隊(duì)對(duì)飼養(yǎng)在一起的26只患有回結(jié)腸炎恒河猴的回腸內(nèi)容物進(jìn)行分離培養(yǎng)，其中有21只恒河猴為螺桿菌陽(yáng)性；同時(shí)對(duì)35只沒(méi)有回結(jié)腸炎的恒河猴檢測(cè)發(fā)現(xiàn)也有20只為螺桿菌陽(yáng)性[13，14]。但是作者僅選擇其中少數(shù)樣本進(jìn)行16S rRNA分析，因此無(wú)法得知該群體中“獼猴螺桿菌”感染的實(shí)際數(shù)量。至今尚未見(jiàn)有關(guān)食蟹猴中“獼猴螺桿菌”感染的相關(guān)研究報(bào)道。文獻(xiàn)中獼猴螺桿菌是通過(guò)活組織培養(yǎng)，此培養(yǎng)方法有損動(dòng)物健康；通過(guò)糞便培養(yǎng)分離獼猴螺桿菌難度太大，由于糞便中菌群復(fù)雜，且獼猴螺桿菌生長(zhǎng)環(huán)境、形態(tài)特征普遍，進(jìn)一步分純進(jìn)行微生物培養(yǎng)鑒定難度大。因此我們針對(duì)“獼猴螺桿菌”的7個(gè)細(xì)菌株的16S rRNA序列進(jìn)行比對(duì)分析后，設(shè)計(jì)了特異性引物。實(shí)驗(yàn)表明該引物靈敏度高，且特異性好，與包括幽門螺桿菌在內(nèi)的數(shù)種常見(jiàn)腸道菌無(wú)交叉。我們用該引物進(jìn)行的調(diào)查結(jié)果表明，在45只2～4歲的恒河猴中“獼猴螺桿菌”的感染率為100%；在90只食蟹猴中有88只為“獼猴螺桿菌”陽(yáng)性，感染率達(dá)97.8%，證明了我們建立的檢測(cè)該菌的PCR方法的可行性和實(shí)驗(yàn)猴感染“獼猴螺桿菌”的普遍性。

在本研究中，有1份食蟹猴樣本的螺桿菌屬特異性引物PCR檢測(cè)結(jié)果為陰性，但幽門螺桿菌特異性引物qPCR檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。由于qPCR比常規(guī)PCR靈敏度高20倍以上，因此該例結(jié)果的不符合可能是不同方法的敏感性的差異所致。需進(jìn)一步建立螺桿菌和“獼猴螺桿菌”的qPCR檢測(cè)方法可提高檢測(cè)敏感性。

目前的研究表明，只有家貓和非人靈長(zhǎng)類是幽門螺桿菌的自然感染動(dòng)物宿主[5]。非人靈長(zhǎng)類與人親緣關(guān)系非常緊密，幽門螺桿菌在非人靈長(zhǎng)類中也分布于胃黏膜中，會(huì)引發(fā)不同程度的持續(xù)性胃炎，以及幽門螺桿菌在猴群中廣泛存在自然感染的情況，使得非人靈長(zhǎng)類成為研究幽門螺桿菌感染人體后的致病機(jī)理、藥物篩選和疫苗開(kāi)發(fā)的最佳實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[5，16]。另一方面，由于幽門螺桿菌感染人群后，會(huì)造成胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍甚至胃癌，在實(shí)驗(yàn)猴群中廣泛存在的幽門螺桿菌污染，可能會(huì)對(duì)飼養(yǎng)人員和實(shí)驗(yàn)人員的身體健康造成威脅，因此應(yīng)及時(shí)發(fā)現(xiàn)并清除實(shí)驗(yàn)猴中自然感染的幽門螺桿菌[3]。而實(shí)驗(yàn)猴感染幽門螺桿菌造成的胃炎以及“獼猴螺桿菌”造成的回結(jié)腸炎，可能會(huì)對(duì)使用這些動(dòng)物進(jìn)行的藥效學(xué)或藥物毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)造成干擾[14]。雖然目前國(guó)內(nèi)外尚未有對(duì)實(shí)驗(yàn)猴中的幽門螺桿菌感染的監(jiān)測(cè)要求，但有必要建立不攜帶幽門螺桿菌的SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)猴應(yīng)用于消化道藥物臨床前研究。

總之，本研究針對(duì)螺桿菌屬、幽門螺桿菌和“獼猴螺桿菌”的16S rRNA特異性區(qū)域建立的PCR方法，檢測(cè)實(shí)驗(yàn)猴糞便樣本中這些細(xì)菌具有特異、敏感和可行的優(yōu)勢(shì)，通過(guò)對(duì)人工繁育的恒河猴和食蟹猴的螺桿菌感染狀況初步調(diào)查，表明實(shí)驗(yàn)恒河猴和食蟹猴都存在幽門螺桿菌和“獼猴螺桿菌”的復(fù)合感染。

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PCR test ofHelicobacterpyloriand “Helicobactermacacae” infections in rhesus and cynomolgus monkey breading colonies

WANG Li-peng, LI Yong-wang, GUO Lian-xiang, SHI Chang-jun

(Suzhou Xishan Biotechnology Inc., Suzhou Jiangsu 215123, China)

Objective To investigate the status ofHelicobacterpyloriand “Helicobactermacacae” infection in rhesus and cynomolgus monkeys in China. Methods With the use of 16S rRNA specific primers for Helicobacter spp andHelicobacterpylori(HP) from published literatures, and new 16S rRNA specific primers designed for “Helicobactermacacae” (HM), we investigated the infection status of these two Helicobacter spps in both of 45 rhesus and 90 cynomolgus monkeys by qPCR or conventional PCR on stool samples. Results All three primer sets for 16S rRNA exhibited excellently sensitivity and specificity. Both the infection rates of HP and HM were 100% among 45 young adult rhesus monkeys. The infection rate of HP and HM in 90 young adult cynomolgus monkeys were 100% and 97.8%, respectively. ConclusionsHelicobacterpyloriand “Helicobactermacacae” are present in almost every artificially bred adult rhesus and cynomolgus individuals which may adversely affect the health of laboratory monkeys and the accuracy of related animal experiments.

Rhesus monkey; Cynomolgus monkey;Helicobacterpylori; “Helicobactermacacae”; Infection; Diagnosis

王立鵬(1989-)，男，碩士。Email：wlpburry@126.com。

時(shí)長(zhǎng)軍(1953-)，男，博士。Email：changjun.shi@vrl.net。

R-33

A

1671-7856(2016)10-0061-08

10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.10.012

2016-05-09