李曉娟，朱 云，王立福，杜 寧，孫永強(qiáng)，宋雪艾，景 婧，王麗蘋，張 帆，余思邈，王睿林，李瑞生

(1. 解放軍第302醫(yī)院臨床研究管理中心，北京 100039，2．解放軍第302醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合診療與研究中心，北京 100039)

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桃核承氣湯對(duì)大鼠肝性腦病模型干預(yù)治療的分析

李曉娟1，朱 云2，王立福2，杜 寧2，孫永強(qiáng)2，宋雪艾2，景 婧2，王麗蘋2，張 帆2，余思邈2，王睿林2，李瑞生1

(1. 解放軍第302醫(yī)院臨床研究管理中心，北京 100039，2．解放軍第302醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合診療與研究中心，北京 100039)

目的 探討桃核承氣湯(去甘草)對(duì)硫代乙酰胺(TAA)誘導(dǎo)的大鼠肝性腦病的干預(yù)治療作用。方法 通過TAA腹腔注射誘導(dǎo)建立大鼠肝性腦病模型，觀察桃核承氣湯(去甘草)顆粒對(duì)肝性腦病的神經(jīng)行為改變、神經(jīng)病學(xué)測(cè)試、血清生化指標(biāo)及肝臟和腦病理損傷的影響。結(jié)果 本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了大鼠肝性腦病模型。桃核承氣湯(去甘草)顆粒低、中、高劑量均能不同程度地改善TAA引起的HE大鼠的神經(jīng)反射情況，降低HE級(jí)別，降低血氨和生化指標(biāo)指數(shù)以及使病理結(jié)果均呈現(xiàn)減輕的現(xiàn)象，其中以高劑量組為最佳(P<0.05)，效果與陽性藥相近。結(jié)論 桃核承氣湯(去甘草)對(duì)TAA引起的大鼠肝性腦病有較好的預(yù)防治療作用，本實(shí)驗(yàn)為該方劑的臨床肝性腦病的使用提供了堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

桃核承氣湯；肝性腦??；硫代乙酰胺；大鼠

肝性腦病(hepatic encephalopathy，HE)是一種以可逆性意識(shí)障礙為主要特征的神經(jīng)紊亂和運(yùn)動(dòng)異常綜合征，多為急慢性肝病較嚴(yán)重的并發(fā)癥。臨床先出現(xiàn)精神癥狀，而后出現(xiàn)意識(shí)障礙，甚至并發(fā)的腦水腫常導(dǎo)致顱內(nèi)壓增高和腦卒的發(fā)生，因此具有較高死亡率[1，2]。HE發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，也無有效的防治藥物與方法，因此對(duì)HE的基礎(chǔ)和臨床研究十分迫切。肝性腦病動(dòng)物模型的建立對(duì)于發(fā)病機(jī)制、診斷和治療的研究發(fā)揮著非常重要的作用，其中以大鼠模型應(yīng)用最為廣泛[3]。桃核承氣湯是《傷寒論》治太陽蓄血證的主方，具有活血軟堅(jiān)、疏肝解郁、健脾化濕之功效，研究表明此方劑對(duì)肝臟具有一定的保護(hù)作用[4，5]。因此本實(shí)驗(yàn)擬通過硫代乙酰胺( TAA) 誘導(dǎo)大鼠肝性腦病模型，觀察桃核承氣湯對(duì)其HE評(píng)分、生化指標(biāo)以及肝臟和腦病理結(jié)果的影響，探討其對(duì)肝性腦病的防護(hù)作用和作用機(jī)理，以期為臨床尋求治療HE的藥物提供堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠48只，單鼠體質(zhì)量180～220 g，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證【SCXK(軍)2012-0004】。本實(shí)驗(yàn)室具有SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證【SYXK(軍)2012-0010】。

1.2 藥品與試劑

硫代乙酰氨(thioacetamide, TAA)(Sigma公司)，產(chǎn)品號(hào)： G2501，批號(hào)： 9029-12-3。氯化鈉注射液(0.9%)來自石家莊四藥有限公司，批號(hào)： 1412273201；氯化鉀來自中國醫(yī)藥公司北京采購供應(yīng)站，產(chǎn)品號(hào)： 090407；葡萄糖來自北京化工廠，產(chǎn)品號(hào)： 20090228；乳果糖(Abbott公司)，產(chǎn)品號(hào)： 1083418。甲醛溶液來自天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào)： 20100523。桃核承氣湯(去甘草)顆粒(桃仁、桂枝、芒硝和生大黃)由本院制劑室制備(6.5g/袋)。

1.3 動(dòng)物分組及模型制備

SD大鼠在本中心SPF級(jí)屏障環(huán)境飼養(yǎng)，動(dòng)物自由飲水、采食正常飼料，1周后隨機(jī)分為六組(8只/組)： 空白對(duì)照組，模型對(duì)照組，桃核承氣湯(去甘草)顆粒低、中、高劑量(1.17、3.51、10.53 g/kg)組，乳果糖組(0.2 mL/d/只)。桃核承氣湯(去甘草)的劑量根據(jù)人臨床劑量換算，換算公式： 大鼠劑量(g/kg)=6.3×人臨床劑量(0.5 g/kg)。此劑量作為低劑量，而中劑量與高劑量分別為低劑量的3倍和9倍。給藥： 中藥高、中、低劑量組以及陽性藥組從造模前1周開始至造模后2 d連續(xù)給藥，中藥各劑量組的灌胃容量為2 mL/200 g大鼠體重，乳果糖組灌胃體積為(0.2 mL/200 g)，1次/d。正常對(duì)照組和模型組給予相同體積的生理鹽水。造模： TAA 250 mg /(kg/d) 隔日腹腔注射2次。正常對(duì)照組則給予生理鹽水ip，共2次。首次注射TAA后每隔12 h，各組大鼠(包括正常對(duì)照組)均皮下注射0.5 mL混合溶液(含0.45% NaCl、5% 葡萄糖、0.2% KCl)行補(bǔ)液治療。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1 造模后，觀察大鼠精神狀態(tài)、體質(zhì)量變化、自主活動(dòng)等情況： 根據(jù)大鼠肝性腦病診斷標(biāo)準(zhǔn)，若大鼠出現(xiàn)嗜睡、反應(yīng)遲緩，自主性活動(dòng)減少、共濟(jì)失調(diào)、昏迷等癥狀之一，即可診斷HE[6]。并根據(jù)Zimmermann法[6]對(duì)大鼠HE進(jìn)行分級(jí)： 0級(jí)： 正常(11分)；I級(jí)： 嗜睡，反應(yīng)遲緩，自主活動(dòng)減少，反射正常(11分)；II級(jí)： 共濟(jì)失調(diào)，但反射仍基本正常(10～11分)；III級(jí)： 反射逐漸消失(<10分)；IV級(jí)： 角膜反射消失，動(dòng)物昏迷(0分)。

1.4.2 血液生化指標(biāo)及肝臟與腦病理學(xué)檢測(cè)： 于末次注射TAA的第2天，各組大鼠禁食8 h后經(jīng)眶后靜脈叢采集3 mL血液分離血清用于檢測(cè)丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)和白蛋白/(總蛋白-白蛋白)A/G 比值等生化指標(biāo)。采集完血液后，取各組大鼠相同部位肝臟組織和兩側(cè)腦組織置4%甲醛溶液固定，切片，HE染色，進(jìn)行病理組織學(xué)檢查[7]。肝組織病理觀察參照文獻(xiàn)[8]方法對(duì)肝組織病變程度進(jìn)行分級(jí)： 正常(-)、肝細(xì)胞水腫(+)、氣球樣變(++)、點(diǎn)狀壞死伴門管區(qū)炎癥細(xì)胞浸潤(+++)、小灶樣壞死(++++)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組間比較采用單因素方差分析并進(jìn)行組間兩兩比較分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 藥物對(duì)各組大鼠行為、神經(jīng)反射、HE等級(jí)影響及血氨對(duì)比分析

各組大鼠神經(jīng)反射評(píng)分、HE分級(jí)結(jié)果顯示： 空白對(duì)照組大鼠活動(dòng)靈活，神經(jīng)反射靈敏。模型組大鼠均不同程度的出現(xiàn)行動(dòng)遲緩，步態(tài)不穩(wěn)，共濟(jì)失調(diào)等反射極遲鈍或消失等現(xiàn)象。與模型組比較，其他各組HE級(jí)別均降低，但只有陽性對(duì)照組與桃核承氣湯高劑量組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。模型對(duì)照組的血氨顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05)，用藥組均出現(xiàn)不同程度的降低，而與模型組比較，陽性對(duì)照組、中劑量組和高劑量組的血氨顯著降低(P<0.05)(表1)。

2.2 藥物對(duì)各組大鼠生化指標(biāo)的影響

通過對(duì)各組大鼠生化指標(biāo)的對(duì)比分析顯示： 與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠的ALT、AST、ALP均顯著增高(P<0.05)，A/G比值顯著降低(P<0.05)。與模型對(duì)照組比較，其他各組大鼠的ALT、AST、ALP均顯著降低(P<0.05)，A/G比值顯著增高(P<0.05)。與陽性對(duì)照組比較，桃核承氣湯低劑量組的ALT、AST顯著增高(P<0.05)，A/G比值顯著降低(P<0.05)，而桃核承氣湯中劑量組和高劑量組與陽性對(duì)照組結(jié)果差異無顯著性(表2)。

2.3 藥物對(duì)各組大鼠肝臟和腦的病理結(jié)果影響

肝臟病理學(xué)研究結(jié)果顯示： 正常對(duì)照組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本正常，未見脂肪變性、腫脹、炎癥、細(xì)胞變性壞死等明顯的病理組織學(xué)的改變。模型對(duì)照組： 肝細(xì)胞排列紊亂，肝小葉結(jié)構(gòu)不清，呈現(xiàn)不同程度的腫脹、變性、點(diǎn)片狀、小灶或大灶性碎屑狀壞死。與模型對(duì)照組比較，桃核承氣湯低、中和高劑量組以及乳果糖組的肝組織變性、腫脹、壞死均有不同程度的減輕和改善(表3)。腦病理結(jié)果顯示： 正常對(duì)照組未見異常。模型組大腦有輕度腦水腫致血管周圍輕度袖套樣改變，神經(jīng)元光鏡下有少量噬神經(jīng)現(xiàn)象，原漿型膠質(zhì)細(xì)胞散在或灶性退變，部分區(qū)域有輕度增生，輕度腦水腫。與模型組比較，桃核承氣湯低、中和高劑量組以及乳果糖組的腦組織的病變程度均有所減輕和改善(圖1)。

表1 各組大鼠神經(jīng)反射得分、HE等級(jí)及血氨比較結(jié)果

注： 與空白對(duì)照組比較：ΦP<0.05。與模型對(duì)照組比較：*P<0.05。與陽性對(duì)照組比較：ΔP<0.05。

Note. Compared with the control group:ΦP<0.05.Compared with the model group：*P<0.05．Compared with the positive control group：ΔP<0.05．

表2 各組大鼠血清生化指標(biāo)分析

注： 注： 與空白對(duì)照組比較：☆P<0.05。與模型對(duì)照組比較：*P<0.05。與陽性對(duì)照組比較：ΔP<0.05。

Note. Compared with the control group：☆P<0.05．Compared with the model group：*P<0.05．Compared with the positive control group：ΔP<0.05．

表3 各組大鼠肝臟組織的病變程度

注： 正常(-)、肝細(xì)胞水腫(+)、氣球樣變(++)、點(diǎn)狀壞死伴門管區(qū)炎癥細(xì)胞浸潤(+++)、小灶樣壞死(++++)

Note. Normal (-)，Hepatocyte edema(+)，balloon degeneration (++)，punctate necrosis acompanied with inflammatory cell infiltration in portal area (+++)，focal necrosis (++++).

注： A： 對(duì)照組；B： 模型組；C： 陽性對(duì)照組；D： 桃核承氣湯低劑量組；E： 桃核承氣湯中劑量組；F： 桃核承氣湯高劑量組(標(biāo)尺=1 000μm)圖1 各組大鼠腦組織病理學(xué)檢查結(jié)果(HE染色)Note： A： A control mouse；B： A mouse of model group；C： A mouse of positive control group；D： A mouse of low Taohechengqi Decoction group；E： A mouse of medium Taohe Chengqi Decoction group；F： A mouse of high Taohe Chengqi Decoction group(Bar=1 000 μm)Fig.1 The results of pathological examination of the brain in different groups(HE staining)

3 討論

肝性腦病的臨床表現(xiàn)非常復(fù)雜，雖然氨中毒學(xué)說在肝性腦病的發(fā)病機(jī)制中占著核心地位，但對(duì)肝性腦病的定義以及治療仍存在爭(zhēng)論[9]，目前臨床上仍以西醫(yī)結(jié)合中醫(yī)的綜合治療為主，中醫(yī)法常見有化痰通腑法、通腑開竅法、退黃降氨湯等，能夠降低血氨來改善HE病情。在西醫(yī)無特效療法之時(shí)，中藥治療有著廣闊的發(fā)展空間[10]。張照蘭等[11]運(yùn)用腸毒清顆粒灌腸法治療肝性腦病，達(dá)到瀉下排毒、化濁開竅的目的。胡瑜等[12]證實(shí)丹參注射液對(duì)肝性腦病有較好的防治作用。而桃核承氣湯是仲景之名方，主治瘀血與邪熱互結(jié)于下焦之蓄血證[13]，楊榮源等[4]證實(shí)桃核承氣湯(桃仁、大黃、桂枝、芒硝、甘草)對(duì)膿毒癥大鼠肝臟組織具有保護(hù)作用。而本實(shí)驗(yàn)中對(duì)傳統(tǒng)的桃核承氣湯進(jìn)行了方劑改良，由于中醫(yī)理論認(rèn)為“甘”能令人中滿，肝病常見腹脹癥狀，為防出現(xiàn)中滿之候加重，故去之。本方在臨床使用中對(duì)肝性腦病具有一定的療效，但國內(nèi)外尚無對(duì)該改良方劑的報(bào)道。

因此本實(shí)驗(yàn)使用TAA構(gòu)建SD大鼠肝性腦病模型，觀察桃核承氣湯(去甘草)改良方劑對(duì)肝性腦病的作用效果。各組大鼠神經(jīng)反射和HE等級(jí)、血清生化指標(biāo)以及肝臟和腦病理結(jié)果顯示： 模型組大鼠均不同程度的出現(xiàn)行動(dòng)遲緩，步態(tài)不穩(wěn)，共濟(jì)失調(diào)等反射極遲鈍或消失等現(xiàn)象，評(píng)分較低，級(jí)別較高，血氨濃度顯著升高，生化指標(biāo)ALT、AST、ALP均顯著增高(P<0.05)，A/G比值顯著降低(P<0.05)，同時(shí)模型組肝臟病理顯示出現(xiàn)了不同程度的灶樣壞死，腦病理結(jié)果也顯示輕度的腦水腫，由此說明本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了大鼠肝性腦病模型。而其他用藥各組的HE級(jí)別、血氨濃度、血清生化指標(biāo)以及病理學(xué)改變結(jié)果均顯示按照桃核承氣湯(去甘草)顆粒從低、中到高劑量出現(xiàn)了依次的降低和減輕現(xiàn)象，由此表明桃核承氣湯(去甘草)顆粒低、中、高劑量均能不同程度地改善TAA引起的HE大鼠的神經(jīng)反射情況，降低HE級(jí)別，降低生化指標(biāo)的指數(shù)以及使病理結(jié)果均呈現(xiàn)減輕的現(xiàn)象，其中血氨濃度的顯著降低可能對(duì)HE癥狀的改善起到?jīng)Q定性作用，而其中尤以高劑量組為最佳(P<0.05)，效果與陽性藥相近。此結(jié)果與胡瑜等[12]使用丹參對(duì)肝性腦病的干預(yù)結(jié)果較一致，同時(shí)在對(duì)肝臟組織保護(hù)作用方面，與楊榮源等[4]使用桃核承氣湯(桃仁、大黃、桂枝、芒硝、甘草)對(duì)肝臟保護(hù)作用的結(jié)果相一致，但本實(shí)驗(yàn)中的桃核承氣湯(去甘草)為改良方劑，具體的改良劑量對(duì)藥物的作用影響及其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用桃核湯承氣(去甘草)對(duì)TAA大鼠肝性腦病模型進(jìn)行干預(yù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明本方劑對(duì)TAA引起的肝性腦病癥狀具有減緩作用，顯著降低血氨濃度，同時(shí)對(duì)TAA造成的肝損傷具有一定保護(hù)作用，為該方劑用于臨床肝性腦病的治療提供堅(jiān)實(shí)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)支持以及為進(jìn)一步作用機(jī)制的研究奠定研究基礎(chǔ)。

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Analysis of the preventive and therapeutic effects of Taohe Chengqi decoction on a rat model of hepatic encephalopathy

LI Xiao-juan1，ZHU Yun2，WANG Li-fu2，DU Ning2，SUN Yong-qiang2，SONG Xue-ai2， JING Jing2，WANG Li-ping2，ZHANG Fan2，YU Si-miao2，WANG Rui-lin2，LI Rui-sheng1

(1．Research Center for Clinical and Translational Medicine；2．Liver Disease Center for Combined TCM and Western Medicine，302 Hospital of PLA，Beijing 100039，China)

Objective To analyze the preventive and therapeutic effects of a traditional Chinese medicine Taohe Chengqi decoction on a rat models of hepatic encephalopathy (HE) induced by thioacetamide (TAA)．Methods The rat model of HE was established by intraperitoneal injection of TAA，and the effects of Taohe Chengqi decoction were observed by neurobehavioral changes，neurological test，blood ammonia，serum biochemical indexes，and liver and brain pathological examination．Results The rat model of hepatic encephalopathy was successfully established. Low, medium and high dose Taohe Chengqi decoction markedly improved neuro-reflexes and liver and brain pathological damages，and significantly decreased the HE staging and serum biochemical indexes, and the results of high dose group was the best, similar to that of positive drug-treatment group．Conclusions Taohe Chengqi decoction exhibits promising preventive and therapeutic effects on the rat model of TAA-induced hepatic encephalopathy, and these results provide substantial experimetal evidence for its clinical application．

Taohe Chengqi decoction；Hepatic encephalopathy；Thioacetamide; Rat

國家“十二五”科技重大專項(xiàng)資助項(xiàng)目(2012zx10005010-002-002)。

李曉娟(1980-)，女，碩士，E-mail： sxlily55@163.com；朱云(1983-)，女，博士，zynorway@126.com；二者為并列第一作者。

王睿林(1979-)，男，博士，主治醫(yī)師，從事中西醫(yī)結(jié)合治療研究，E-mail： wrl7905@163.com；李瑞生(1969-)，男，博士，副研究員，主要從事人類疾病動(dòng)物模型研究，E-mail： lrsheng@sohu.com。

R-33

A

1671-7856(2016)10-0014-05

10.3969.j.issn.1671-7856.2016.10.004

2016-04-28