程麗雪，張 華，于虹敏，俞 潔，程 波，王 曦，羅 丹，林 舒

（1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚病性病分院 福建 福州 350000；2.福建中醫(yī)藥大學(xué) 福建 福州 350000）

·基礎(chǔ)研究·

反相高效液相色譜法測(cè)定黃褐斑皮膚表面角鯊烯和亞油酸含量

程麗雪1，張 華2，于虹敏2，俞 潔2，程 波1，王 曦1，羅 丹1，林 舒1

（1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚病性病分院 福建 福州 350000；2.福建中醫(yī)藥大學(xué) 福建 福州 350000）

目的：采用反向高效液相色譜法(RP-HPLC)分析測(cè)定皮膚表層的角鯊烯和亞油酸的含量，探討黃褐斑患者與健康人之間皮脂組成的差異性。方法：樣本中亞油酸和角鯊烯采用正己烷液相萃取后,用反相柱以等度洗脫分離，并在210nm處分析兩組亞油酸和角鯊烯的含量。①角鯊烯組：采集25例黃褐斑患者組及28例健康對(duì)照組的皮脂進(jìn)行測(cè)定角鯊烯含量，并進(jìn)行比較；②亞油酸組：采集20例黃褐斑患者及20例健康對(duì)照者的皮脂進(jìn)行測(cè)定亞油酸含量，并進(jìn)行比較。結(jié)果：黃褐斑組皮脂中的角鯊烯和亞油酸含量明顯低于健康對(duì)照組（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：黃褐斑的發(fā)病機(jī)制中，皮脂腺分泌的皮脂組分改變是其中的一個(gè)重要因素。

RP-HPLC；黃褐斑；皮脂；角鯊烯；亞油酸

黃褐斑是一種常見的面部損容性、慢性皮膚病，好發(fā)于中青年女性，男性少見，病程頑固，纏綿難愈，給患者精神和生活帶來極大的痛苦，造成心身障礙，自閉甚至自傷。黃褐斑的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜。發(fā)病前沒有局部炎癥和外傷史，組織學(xué)特點(diǎn)為表皮中黑素和黑素小體均增加，黑素細(xì)胞活性增強(qiáng)，但真正改變黑素細(xì)胞功能的原因尚不清楚。一般認(rèn)為起病原因有內(nèi)分泌因素、紫外線照射、遺傳因素等，其引發(fā)的機(jī)制可能有氧化抗氧化失衡、皮膚屏障功能受損甚至基底膜受損、血管功能亢進(jìn)、神經(jīng)調(diào)節(jié)機(jī)制異常、炎癥免疫反應(yīng)、黑素代謝障礙等[1-2]。

1　對(duì)象和方法

1.1儀器與試劑：采用LC-20A高效液相色譜儀(日本，島津)，Ultimate XB C18(4.6mm×250mm,5μm)色譜柱，KQ-500型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，AL204型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司），角鯊烯對(duì)照品（美國Sigma公司，批號(hào)：MKBQ5948V，純度≥98%）,亞油酸對(duì)照品（美國Sigma公司，批號(hào)：BCBN6404V，純度≥ 98.5%）,正己烷、甲醇（分析純，上海阿拉丁試劑公司）,均購于廈門鷺隆生物科技發(fā)展有限公司。乙腈、甲醇（色譜純，山東禹王化工公司），水為純化水。

1.2研究對(duì)象：2014年8～9月，福建省皮膚病性病防治院門診25例黃褐斑患者，女性，年齡27～40歲，平均33.12歲。另選擇28例健康人作為對(duì)照，健康人來自某中專學(xué)校17人，年齡16～17歲，醫(yī)科大學(xué)碩士研究生9人，年齡24～25歲，共28人，女性，平均19.36歲。兩組對(duì)象年齡有差異，這是由于黃種人面部無斑的健康女性年齡處于低年齡段。黃褐斑組排除標(biāo)準(zhǔn)：① 排除其他疾?。ㄈ顼E部褐青色痣、Riehl黑變病及色素性光化性扁平苔蘚等）引起的色素沉著；②在1個(gè)月內(nèi)曾使用黃褐斑治療藥物；③孕婦、哺乳期婦女；④嚴(yán)重的心、肝、腎及其他系統(tǒng)疾病的。入選后行伍德氏燈檢測(cè)，均皮損與正常皮膚反差大。

1.3方法

1.3.1色譜條件：①角鯊烯測(cè)定采用RP-HPLC法，色譜條件：Ultimate XB C18(4.6mm×250mm,5μm)色譜柱；流動(dòng)相：乙腈-甲醇（75:25），等度洗脫；流速：1.0ml·min-1；柱溫：25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm。②亞油酸測(cè)定采用RPHPLC法，色譜條件：Ultimate XB C18(4.6mm×250mm,5μm)色譜柱；流動(dòng)相：A相0.1%甲酸，混合B相乙腈-甲醇（6:4）,92.5%，等度洗脫；流速：1.0ml·min－1；柱溫：25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm[3]。

1.3.2樣品制備

1.3.2.1取材：環(huán)境溫度25～35℃，濕度50%～70%。取材對(duì)象潔面后15min，用顯微鏡擦鏡紙（10cm×15cm）取每片5cm×7.5cm大小，用70%乙醇浸潤后敷于取材對(duì)象的單邊臉頰，雙側(cè)各一片，期間70%乙醇揮發(fā)至干時(shí)，用棉簽沾70%乙醇補(bǔ)充。15min后折起存入密封小瓶中。置-40℃冰箱中保存。

1.3.2.2樣品處理：用正己烷1ml萃取，氮吹儀揮干后用甲醇1.1ml溶解，超聲提取15min，過濾，定容至1ml，即得。進(jìn)樣前過0.45μm的微孔濾膜，取續(xù)濾液進(jìn)樣。

1.3.3對(duì)照品溶液配制：分別精密稱取角鯊烯對(duì)照品、亞油酸對(duì)照品0.0437g、0.0383g于25ml容量瓶中，甲醇溶解，超聲，用甲醇定容，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。實(shí)驗(yàn)時(shí)用與甲醇以1:9比例稀釋10倍。

1.3.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用四分位數(shù)法，并用秩和檢驗(yàn)中的非參數(shù)檢驗(yàn)wilcoxon法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)量為Z值。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

由于數(shù)據(jù)為偏態(tài)分布，采用四分位數(shù)法表示結(jié)果。并用秩和檢驗(yàn)中的非參數(shù)檢驗(yàn)wilcoxon法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)量為Z值，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

黃褐斑組皮脂中的角鯊烯含量明顯低于健康對(duì)照組（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。黃褐斑組皮脂中角鯊烯平均含量為6.50×10-7g/cm2，健康對(duì)照組皮脂中角鯊烯平均含量為1.49×10-6g/cm2。見圖1～3和表1。

黃褐斑組皮脂中的亞油酸含量明顯低于健康對(duì)照組（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。黃褐斑組皮脂中亞油酸平均含量為7.60×10-8g/cm2，健康對(duì)照組皮脂中亞油酸平均含量為2.96×10-7g/cm2。見圖4～6和表2。

圖1　黃褐斑組角鯊烯液相色譜圖

圖2　角鯊烯對(duì)照品液相色譜圖

圖3　健康對(duì)照組角鯊烯液相色譜圖

表1　黃褐斑組和健康對(duì)照組皮脂中角鯊烯含量比較

圖4　黃褐斑組亞油酸液相色譜圖

圖5　亞油酸對(duì)照品液相色譜圖

圖6　健康對(duì)照組亞油酸液相色譜圖

表2　黃褐斑組和健康對(duì)照組皮脂中亞油酸含量比較

3　討論

既往的皮脂研究主要是使用薄層色譜分析，自從HPLC的出現(xiàn)，脂類分析的效率和精確度得到了顯著提升。目前脂類分析方法主要是采用 HPLC技術(shù)，該方法方便快捷，靈敏度更高，還可與質(zhì)譜分析儀聯(lián)用，在脂類檢測(cè)方面前景廣闊。Camera E等[1]在2010年使用HPLC-MS法進(jìn)行了20例正常人的皮脂成分分析，其所使用的流動(dòng)相異丙醇縮短高效色譜分析柱使用年限，儀器昂貴，方法重復(fù)、推廣有難度，但是其比較了多種取樣方法較為實(shí)用，應(yīng)用良好。其白種人正常人皮脂成分HPLC測(cè)定，有一定參考價(jià)值。本文建立了RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定皮脂中角鯊烯和亞油酸的含量，具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，適用于檢測(cè)皮脂中角鯊烯和亞油酸的含量。

皮脂特指皮脂腺分泌的皮膚油脂，相對(duì)于角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生的表皮脂質(zhì)，是一種內(nèi)源性脂質(zhì)。而其中角鯊烯是皮脂的標(biāo)志，亞油酸是人體血循環(huán)中的必需氨基酸，通過皮脂腺細(xì)胞分泌在表皮上。角鯊烯、亞油酸的減少在黃褐斑發(fā)病過程中有其重要作用。

角鯊烯是膽固醇的前體，除了可合成膽固醇，也是一類具有高度滲透力的潤滑劑、保濕劑。角鯊烯在皮膚表面的氧化具有諸多層面的重要意義，一方面角鯊烯的氧化在紫外線保護(hù)中發(fā)揮重要，另一方面在紫外線等作用下氧化的角鯊烯可導(dǎo)致細(xì)胞毒性反應(yīng)、促炎癥反應(yīng)、免疫學(xué)反應(yīng)事件，并可能加速皮膚的老化進(jìn)程[2-4]。當(dāng)黃褐斑患者角鯊烯顯著減少，阻隔紫外線的保護(hù)作用缺失，并且氧化的角鯊烯作為啟動(dòng)因素促進(jìn)了酪氨酸系列氧化反應(yīng)，分解產(chǎn)生具有強(qiáng)氧化作用的丙二醛，使蛋白質(zhì)分子發(fā)生分子內(nèi)和分子間交聯(lián)，生成色素[5]。繼而作為過氧化脂質(zhì)的一部分參與到一系列的炎癥反應(yīng)中。

亞油酸是人類表皮含量最多的脂肪酸，同樣也是神經(jīng)酰胺的前體，而神經(jīng)酰胺是組成角質(zhì)層滲透屏障中細(xì)胞間基質(zhì)的主要成分。亞油酸是一種必需脂肪酸，從食物中攝取，已有研究表明飲食中攝入的脂肪酸和膽固醇可被傳遞到皮膚角質(zhì)層。PUFA對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞中的脂肪酸轉(zhuǎn)移蛋白具有更高的選擇性。當(dāng)飲食中的PUFA如亞油酸缺乏時(shí)，MUFA如油酸，會(huì)取代它的位置，導(dǎo)致角質(zhì)層滲透性異常，經(jīng)表皮水分丟失增多[6]。另一方面，PUFA如亞油酸缺乏，將會(huì)誘導(dǎo)增殖蛋白（K6和K16）和炎癥相關(guān)角蛋白（K17）激活，從而誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)發(fā)生[7]。這些研究都強(qiáng)調(diào)了飲食中脂肪酸的重要性，尤其是亞油酸，對(duì)維持表皮動(dòng)態(tài)平衡和角質(zhì)層滲透屏障起到了重要作用[8]。皮脂中亞油酸的顯著減少破壞了表皮屏障作用。

角鯊烯和亞油酸的顯著較少，導(dǎo)致皮膚屏障功能受損、使皮膚長(zhǎng)期暴露于紫外線影響。研究觀察，過碘酸雪夫染色顯示，黃褐斑皮損95%的基底膜受損，電子顯微鏡進(jìn)一步觀察到該現(xiàn)象。這些結(jié)果提示，黃褐斑皮損存在基底膜缺損，證實(shí)這些細(xì)胞為高度活躍的黑素細(xì)胞[9]。推測(cè)長(zhǎng)時(shí)間紫外線暴露造成金屬基質(zhì)蛋白酶(MMP)2的上調(diào)，可能是導(dǎo)致基底膜受損的重要因素。基底膜帶由Ⅳ型膠原蛋白、層黏連蛋白、Ⅶ型膠原蛋白及細(xì)胞外基質(zhì)等組成，而MMP-2的活性上調(diào)具有降解Ⅳ、Ⅶ型膠原蛋白的作用，有利于高度活躍的黑素細(xì)胞侵入真皮，說明MMP-2表達(dá)上調(diào)可能造成黃褐斑皮損處基底膜缺陷[10]?？梢娮贤饩€與基底膜缺陷互為關(guān)聯(lián)。脂質(zhì)合成受阻導(dǎo)致基底膜受損，黃褐斑皮膚角質(zhì)層完整性被破壞、屏障功能更加難以恢復(fù)[l1]。

黃褐斑患者的皮脂分泌減少，皮脂腺細(xì)胞的功能受到性激素的調(diào)控。65%的黑素細(xì)胞能與雌激素起反應(yīng)。雌激素可增強(qiáng)黑色素細(xì)胞活性，使黑色素分泌水平升高；而孕激素可促進(jìn)黑色素體的轉(zhuǎn)運(yùn)。黃褐斑皮損雌激素受體的表達(dá)較正常表皮增多，發(fā)現(xiàn)這些受體在黃褐斑皮損上皮細(xì)胞中高度表達(dá)[14]。說明雌激素是黃褐斑發(fā)生的一個(gè)確定因素。Perrini S等研究發(fā)現(xiàn)脫氫表雄酮和硫酸脫氫表雄酮在外周靶組織可因代謝酶的不同轉(zhuǎn)化為雄激素或雌激素樣的作用[15]。作為雄激素受體最豐富的皮脂腺細(xì)胞可能在黃褐斑的致病過程中發(fā)揮了部分雌激素樣的作用，導(dǎo)致皮脂腺皮脂分泌減少，轉(zhuǎn)運(yùn)皮膚內(nèi)的抗氧化劑失能。研究證明，月經(jīng)周期紊亂、妊娠期和口服避孕藥物的女性，因體內(nèi)雌孕激素水平發(fā)生變化，易患黃褐斑[16]。

綜上所述，黃褐斑的防治在于性激素水平的平穩(wěn)、減少內(nèi)外因素導(dǎo)致的皮脂減少，需要恰當(dāng)?shù)尼t(yī)學(xué)護(hù)膚品用來抗脂質(zhì)氧化[6]、防護(hù)紫外線等不良因素的刺激，尚需進(jìn)一步的研究。

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編輯/張惠娟

The detection of squalene and linoleic acid in the sebum of chloasma by reversedphase high performance liquid chromatography

Cheng Li-xue1, ZHANG Hua2,YU Hong-min2,YU Jie2,CHENG Bo1, WANG Xi1, LUO Dan1, LIN Shu1
(1.The Hospital Branch of Dermatology and Venereology, The First Affiliated Hospital of Fujian Medical University, Fuzhou 350000,Fujian,China; 2. Fujian University of Traditional Chinese Medicine,Fuzhou 350000,Fujian,China)

Objective Using reversed-phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) analyze the content of skin surface squalene and linoleic acid, explore the composition of sebum melasma between patients and healthy people differences. Methods The specimens were handled and last analyzed by HPLC, to obtain the content of linoleic acid and squalene in both groups at 210 nm. ①We detected the squalene content. Sebum lipids were sampled from 25 chloasma patients group and 28 healthy control group. The squalene content were detected and compared between two groups.②We detected the linoleic acid content. Sebum lipids were sampled from 20 chloasma patients group and 20 healthy control group. The linoleic acid content were detected and compared between two groups. Results Statistical significance was found that the content of squalene and linoleic acid of chloasma subjects was significant below than that seen in healthy subjects(P＜0.05). Conclusion Pathogenesis of melasma, the change of sebum components in sebaceous glands and excreted on the skin surface was an important factor.

RP-HPLC;chloasma;sebum;squalene;linoleic acid

R758.4+2

A

1008-6455（2016）10-0073-03

2013～2016年度福建省中醫(yī)藥科研項(xiàng)目（ 編號(hào)wzpw201311）

程波，男，第三軍醫(yī)大學(xué)皮膚性病學(xué)博士，美國Georgetown大學(xué)高級(jí)訪問學(xué)者?，F(xiàn)任福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院副院長(zhǎng)、福建醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院副院長(zhǎng)、皮膚科主任、教研室主任、福建省皮膚病性病防治研究所所長(zhǎng)、教授、主任醫(yī)師、碩士生導(dǎo)師、福建省百千萬人才。E-mail：chengbo630415@126.com

2016-06-27

2016-09-25