王文芳，邱曉紅(.常州市第四人民醫(yī)院婦產科，江蘇 常州 3000；.哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 5008)

Sestrin1、Sestrin2在子宮內膜異位癥組織中的表達及意義

王文芳1，邱曉紅2
(1.常州市第四人民醫(yī)院婦產科，江蘇 常州 213000；
2.哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150081)

目的 探索應激誘導蛋白家族中Sestrin1、Sestrin2在子宮內膜異位癥（EMS）發(fā)生、發(fā)展過程中的作用，從“類腫瘤”的特點出發(fā)研究EMS的發(fā)病機制，為EMS的治療提供新的思路及方向。方法 選取2013年4月至2014年4月就診于哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院婦科經(jīng)術后病理證實為EMS患者的在位內膜、異位內膜35例（實驗組）及同期非EMS并經(jīng)病理證實無內膜疾病患者的子宮內膜30例（對照組），應用免疫組化SP法檢測實驗組在位內膜、異位內膜及對照組子宮內膜Sestrin1、Sestrin2表達情況。使用SPSS13.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。結果 通過免疫組化SP法證實Sestrin1、Sestrin2在實驗組在位內膜、異位內膜及對照組子宮內膜中有表達，陽性表達率為25.7%、62.9%、96.7%，表明Sestrin1在EMS異位內膜的表達低于另外兩組內膜，且兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；Sestrin2在實驗組異位內膜、在位內膜及對照組子宮內膜陽性表達率為20%、68.6%、96.7%，表明表達在EMS異位內膜的Sestrin2低于另外兩組內膜，且兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結論 Sestrin1、Sestrin2通過對細胞生長的影響實現(xiàn)了EMS形成的基礎，可能為EMS的早期診斷、靶向治療、治療效果及復發(fā)風險的評估提供新的理論依據(jù)。

Sestrin1；Sestrin2；子宮內膜異位癥；免疫組化SP法

【CLC】R711.71 【documentcode】A 【Article number】ISSN.2095-8803.2016.09.003.02

子宮內膜異位癥（簡稱內異癥，endometriosis，EMs）是目前較為常見的婦科疾病，隨著其發(fā)病率的逐年升高及年輕化[1]，對于其發(fā)病機制的研究仍然是當今醫(yī)學界要解決的熱點問題。眾所周知內異癥雖為良性疾病，但卻具有惡性腫瘤細胞異常增殖、侵蝕及轉移等生物學特性，從腫瘤發(fā)病機制的角度來探索內異癥，可能會對其更深入的研究帶來新的突破。

Sestrin1、Sestrin2是1994年Buckbinder[2]及2002年Budanov[3]等先后發(fā)現(xiàn)，受P53調控的基因，隨后和另一種被叉頭盒0轉錄因子激活的sesn3[4]共同組成了sesns應激誘導蛋白家族。研究資料[5]發(fā)現(xiàn)sesns普遍存在于哺乳動物的多種成熟組織中，與氧化應激、衰老、代謝性疾病及腫瘤疾病的發(fā)生有關，目前國內外已有很多研究報道了其與惡性腫瘤性疾病關系[6]，但在內異癥方面的研究報道少見。通過本實驗探索Sestrin1、Sestrin2通過對細胞生長的影響可能實現(xiàn)了EMs形成的基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2013年4月至2014年4月就診于哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院婦科術前診斷為EMs，且經(jīng)術后病理證實確診的患者，在位內膜、異位內膜35例（實驗組），同期收集因婦科良性腫瘤行全子宮或次全子宮切除術的子宮內膜且經(jīng)術后病理證實無內膜疾病的30例（對照組）。在選擇研究對象過程中實驗組及對照組年齡差距無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），在接受治療前6個月內未服用過激素類藥物、無妊娠史及哺乳史，未放置宮內節(jié)育器，都屬于絕經(jīng)前婦女，都有生育史。

1.2 方法

1.2.1 標本的采集 術中取EMs患者異位病灶組織（大小約1cm×1cm）為實驗組異位內膜，并同時刮取子宮內膜組織為實驗組在位內膜；術中刮取因婦科良性腫瘤行全子宮或次全子宮切除術的子宮內膜為對照組子宮內膜。所有標本取材均在手術切除后立即進行并放入凍存管中置入液氮保存并轉運到實驗室-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 免疫組化方法（SP法） 將標本組織自-80℃冰箱取出后放入-20℃冰箱內3-4h后，再將其置入已經(jīng)準備好的4℃的4%的多聚甲醛磷酸鹽緩沖液中固定并過夜。將固定好的標本進行脫水、透明、包埋、切片、貼片及拷片后，進行H＆E染色，標本滿意后，進行SP法免疫組化，抗體分別選用的是北京博奧森生物技術有限公司提供的兔抗人Sestrin1多克隆抗體（bs-8325R）及兔抗人Sestrin2多克隆抗體（bs-8326R），使用濃度分別為：1:100、1:300。結果的判定：Sestrin1、Sestrin2主要位于腺細胞的細胞核中，陽性主要表現(xiàn)為細胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒，判定標準：（1）染色強度評分：0分：不著色，1分：黃色，2分：棕黃色，3分：黃褐色；（2）染色面積評分標準：0分：無細胞染色，1分：＜25%，2分：26%-50%，3分：＞50%。免疫組化染色評分=染色面積評分×染色強度評分：0～1分為陰性（-）；2～3分為弱陽性（+）；4～5分為中度陽性（++）；大于5分為強陽性（+++）。

1.3 統(tǒng)計學方法

所有實驗結果經(jīng)Excel，應用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行分析，以百分數(shù)（%）表示，采用x2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 Sestrin1在實驗組及對照組組織表達情況

Sestrin1主要表達于腺體及間質細胞的細胞核中，根據(jù)免疫組化結果判定標準，Sestrin1在內異癥異位內膜表達明顯低于對照組子宮內膜，結果如圖 1（SP×100），表 1所示。

圖1 Sestrin1在實驗組異位內膜、在位內膜及對照組子宮內膜表達情況

表1 Sestrin1在各組織中表達情況

2.2 Sestrin2在實驗組及對照組組織表達情況

Sestrin2主要也同樣表達于腺體及間質細胞的細胞核中，根據(jù)免疫組化結果判定標準，Sestrin2在內異癥異位內膜表達明顯低于對照組子宮內膜，結果如圖2（SP×100），表2所示。

圖2 Sestrin2在實驗組異位內膜、在位內膜及對照組子宮內膜表達情況.

表2 Sestrin2在各組織中表達情況

3 討 論

眾所周知，內異癥雖為良性疾病，但卻具有與惡性腫瘤細胞異常增殖、種植及轉移的生物學行為，可以推斷其同腫瘤形成有相似的基礎，即細胞的異常生長、增殖。P53、mTOR及細胞自噬在調節(jié)細胞的生長、增殖方面扮演重要角色，實驗資料證實三者在內異癥的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用[7-9]，但具體的作用機制目前仍在不斷研究，Sestrin1、Sestrin2是最近發(fā)現(xiàn)的受P53調控的應激誘導蛋白家族成員，Sestrin1作為mTOR的抑制劑、Sestrin2作為細胞自噬的正調節(jié)蛋白在維持細胞的生長及死亡的平衡中起著一定的作用，本實驗探索Sestrin1、Sestrin2的表達下調參與內異癥形成。

3.1 Sestrin 1的表達與內異癥

Sestrin 1/PA26表達于細胞核內，P53應激誘導蛋白，定位于染色體的6q21，廣泛存在于哺乳動物的成熟組織中，研究發(fā)現(xiàn)[10]Sestrin 1在調節(jié)細胞生長方面的作用是通過作為mTOR的抑制劑來實現(xiàn)的。有研究資料證實大部分惡性腫瘤組織中存在mTOR的高表達[11]，而其抑制劑在治療惡性腫瘤的研究中也取得了明顯的效果[12]。2011年Leconte[3]等使用mTOR抑制劑抑制了一個深部浸潤的內異癥小鼠模型的子宮內膜異位細胞的增殖。

在本實驗中，Sestrin1在實驗組異位內膜、在位內膜及對照組在位內膜都有表達，但在三者中的陽性表達率為26.7%、70%、96.7%存在差別，Sestrin1在異位內膜與對照組子宮內膜比較表達明顯下調（P＜0.05）差異有統(tǒng)計學意義，此種結論與Beliad A[13]發(fā)現(xiàn)的內異癥病損部位P53表達下調，Sestrin1作為其靶向誘導蛋白，降低了對其誘導激活相一致。在經(jīng)典的PI3K / Akt / mTOR信號通路中，mTOR高表達已被證實在內異癥的細胞異常增殖及新生血管形成方面著重要作用[14]，Sestrin1表達水平下調，通過另一條信號減弱甚至失去了對mTOR抑制作用，從而出現(xiàn)了mTOR高表達，在異位內膜細胞異常增殖的基礎上有了新生血管的營養(yǎng)，促使內異癥發(fā)展。目前在許多癌癥疾病中經(jīng)試驗證實了P53與mTOR之間的相互作用引發(fā)腫瘤的發(fā)生，但在內異癥的研究中沒有得到證實，Sestrin1的發(fā)現(xiàn)，將二者聯(lián)系起來，可能使內異癥發(fā)病機制及治療的研究更進一步。

3.2 Sestrin 2的表達與內異癥

2002年Budanov[3]等發(fā)現(xiàn)了P53的低氧誘導基因95（Hi95），既Sestrin 2，定居于細胞核內1p35.3染色體，其編碼的蛋白主要在細胞的生長及存活方面起重要作用。現(xiàn)有資料研究結果表明[15]，誘導或抑制Sestrin 2的表達可通過調節(jié)JNK、AMPK及AKT等信號通路發(fā)揮其在人類惡性腫瘤形成過程中的作用，如肝細胞癌，鱗狀細胞癌、黑色素瘤等。另有研究表明Sestrin 2對于細胞生長及存活的調節(jié)，通過各種信號通路最終主要是影響了細胞自噬來實現(xiàn)的[16]，誘導Sestrin 2表達可促進細胞自噬。細胞自噬作為一種最基本的生命現(xiàn)象，參與了心血管系統(tǒng)疾病、微生物感染、腫瘤性疾病等過程。Beclin-1及LC-3為調節(jié)細胞自噬重要的基因，先后有學者利用免疫組化、RT-PCR等實驗方法發(fā)現(xiàn)了當發(fā)生子宮腺肌癥及內異癥時，它們的表達水平明顯降低[17]，從而引起細胞自噬活性降低，成為了內異癥形成的原因之一，同時在位內膜細胞的細胞自噬活性也有所降低，這個結論也作為“在位內膜決定”的重要補充。

在本研究中，Sestrin2在實驗組異位內膜、在位內膜及對照組在位內膜都有表達，但表達水平不同，陽性率分別為20%、66.7%、96.7%，Sestrin2在內異癥異位內膜表達明顯低于在位內膜，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），從而證明當發(fā)生內異癥時Sestrin2低表達甚至不表達，使在位及異位內膜細胞的自噬活性降低，導致細胞增殖與死亡不能達到平衡，而發(fā)生了內異癥，這與Borahay MA[18]等人提出的誘導細胞自噬可以使異位內膜細胞死亡相一致。

3.3 展望

Sestrin1、Sestrin2是腫瘤抑癌基因P53的調控基因，目前關于其與惡性腫瘤關系的研究已有報道，但在內異癥方面少見，通過本次實驗及現(xiàn)有的大量研究的結果發(fā)現(xiàn)當發(fā)生內異癥時，Sestrin1、Sestrin2的低表達甚至不表達，最終參與了內異癥發(fā)生的基礎。Sestrin1、Sestrin2的發(fā)現(xiàn)可能對于內異癥發(fā)病機制的研究及靶向生物治療具有指導意義，誘導Sestrin1的表達或其編碼的蛋白產物可以使內異癥的高mTOR水平得到抑制，從而使降低細胞的增殖；靶向誘導Sestrin2的表達，提高細胞自噬的活性，從而使異常增殖的細胞發(fā)生死亡，達到細胞自身的平衡。因此對于Sestrin1、Sestrin2在內異癥更深入的研究，可能對我們更進一步的了解內異癥具有重要意義。

[1] Roman H,Darwish B.TO excise or ablate endometriosis? The temptation of the overstatement [J].J Minim invasive Gynecol, 2015,22(3):510-511.

[2] Buckbinder L, Talbott R, Seizinger BR, et al. Gene regulation bytemperature-sensitive P53 mutants: Identification of P53 response genes[J]. Proc NatlAcad Sci USA ,1994,91(22):10640-10644.

[3] Budanov AV, Shoshani T, Fearman A,et al.Identification of a new novelstress-responsive gene Hi95 involved inregulation cell viability[J]. Oncogene. 2002,21(39):6017-6031.

[4] Nogueira VA, Park Y, Chen ML, et al. Akt determines replicative senescence and oxidative or oncogenic premature senescence and sensitizes cell to oxidative apoptosis[J] .Cancer Cell,2008,14(6):458-470.

[5] Lee JH, Budanov AV, Park EJ, et al. Sestrins as a feedback inhibitor of TOR that prevent age-related pathologies[J].Scien ce,2010,327(5970):1223-1228.

[6] Budanov AV, Karin M. p53 target genes sestrin1 and sestrin2 connect genotoxic stress and mTOR signaling[J]. Cell,2008,134(3):451-460.

[7] 桑琳,趙衛(wèi)東,杜世華.P53 P21 MDM2蛋白在卵巢子宮內膜異位癥和子宮腺肌癥中的表達及意義[J].安徽醫(yī)學,2012,33(10):1346-1350.

[8] Leconte M, Nicco C, Ngo c, et al. The mTOR/AKT inhibitor temsirolimus prevent deep infiltrating endometriosis in mice[J].Am J Pathol.,2011,179(2):880-889.

[9] Ren Y, Mu L,Ding X, et al. Decreased expression of Beclin 1 in eutopicendometrium of women with adenomyosis. Arch Gynecol Obstet[J], 2010,282(4):401-406.

[10] Loayzap-puch F,Drost J,Rooijers K, et al.P53 induces transcriptional and translationalprograms to suppress cell proliferation andgrowth.Genome biol[J], 2013,14(4):32.

[11] LyraJ, winagreJ, BitistaR.mTOR activation in medu llary thyroid carcinoma with RASmutation[J]. Eur JEndocrinol,2014,171(5):633-640.

[12] Zaytseva YY, Valentino JD, Gulhati P, et al. mTOR inhibitors in cancertherapy[J]. Cancer Lett,2012,319(1):1-7.

[13] Beliad A,Noel A,Foidart JM.Reduction of apoptosis and proliferation in endometriosis[J].Fertil Steril,2004,82(1):80-85.

[14] Zhang H, Zhao X, Liu S, et al.17betaE2 promotes cellproliferation in endometriosis by decreasing PTEN via NFkappaBdependentpathway[J]. Mol CellEndocrinol,2010,317:31-43.

[15] Zhao B,Shah P,Budanov AV, et al.Sestrin2 Protein Positively Regulates AKT Enzyme Signaling and survival in humanSquamous Cell Carcinoma and Melanoma Cells[J].J BiolCh em,2014,289(52):35806-35814.

[16] Solhaug A,Torgersen ML,Holme JA, et al.Autophagy and senescence, stress responses induced by the DNA-damaging mycotoxin alternariol[J]. Toxicology,2014,326(4):119-129.

[17] Ren Y, Mu L,Ding X, Zheng W. Decreased expression of Beclin 1 in eutopicendometrium of women with adenomyosis[J]. Arch Gynecol Obstet, 2010,282(4):401-406.

[18] Mostafa A.Borahay , FangXian Lu , Bulent Ozpolat, et al.Mullerian inhibiting substance suppresses proliferation and induces apoptosisand autophagy in endometriosis cells in vitro[J]. ISRN Obstet and Gynecol,2013,2013(2013):361489.

Sestrin1,Sestrin2 Expressed in Endometriosis Group and Significance

WANG Wenfang,QIU Xiaohong
(Obstetrics and Gynecology Department of Changzhou Fourth People's Hospital, Jiangsu Changzhou 213000;The Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Heilongjiang Harbin 150081,China)

Objective Testing stress induced protein family Sestrin1,Sestrin2 in the expression of endometriosis(EMS), to explore Sestrin1,Sestrin2 respectively form cell proliferation, cell autophagy , to research from the aspects of “cancers” behavior in the pathogenesis of EMS preliminary for targeted therapy provides new train of though and direction of the EMS.Methods Choosing the eutopic , ectopic endometrium of 35 patients , between April 2013 and April 2014 in the second affiliate hospital of Harbin Medical University department of gynaecology , confirmed by postoperative pathological diagnosis of EMS (experimental group) , at the same time 30 cases of endometrium with no EMS confirmed by postoperative pathological diagnosis of no endometrial disease (control group) . Detecting the expression of Sestrin1,Sestrin2 in eutopic ,ectopic endometrium and endometrium by using immunohistochemical SP method and reverse transcription PCR(RT-PCR) method. The data was analyzed by SPSS13.0 statistical soft ware.Results By using the immunohistochemical SP method , the positive rate of Sestrin1 inectopic ,eutopic endometriumand normal endometriumwere as follows:25.7%、62.9%、96.7%, indicating that the expression of Sestrin1 in ectopic endometrium with EMS is lower than the other two group, among which significant differences observed(P＜0.05) ; the positive rate of Sestrin2 inectopic ,eutopic endometriumand normal endometriumwere as follows:20%、68.6%、96.7% indicating that the expression of Sestrin1 in ectopic endometrium with EMs is lower than the other two group, among which significant differences observed(P＜0.05). Conclusion Sestrin1,Sestrin2 realize the form of EMs by cell growth ,effecting for early diagnosis, targeted therapy, treatment effect of EMs and the evaluation of the risk of recurrence of proving new theoretical basis.

Endometriosis; Sestrin1;Sestrin2; Immunohistochemical SP

R711.71

A

ISSN.2095-8803.2016.09.003.02