文|楊代常 武漢大學(xué) 編輯|孫潔

在水稻上種出“人血清白蛋白”

文|楊代常 武漢大學(xué) 編輯|孫潔

項目成果：水稻胚乳細(xì)胞生物反應(yīng)器及其應(yīng)用

課題單位：武漢大學(xué)

目前全世界范圍內(nèi)血漿都十分緊缺，各國除了從血漿中提取人血清白蛋白之外，都試圖采用生物技術(shù)生產(chǎn)、重組。武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院的楊代常教授改造了水稻種子從而制造大量的人血清白蛋白，占了種子的總可溶性蛋白的大約10%。

人血白蛋白具有多種臨床應(yīng)用價值，是我國的一線大宗臨床用藥，廣泛地用于肝硬化腹水、燒傷燙傷、手術(shù)后體液的補(bǔ)充、失血過多導(dǎo)致的休克、腦水腫、癌癥和艾滋病人放化療的輔助治療等。由于1克HSA可保留18 毫升的水，每5克的HSA保留循環(huán)內(nèi)水分的能力約相當(dāng)于100毫升血漿或200毫升全血的功能，在戰(zhàn)場上可用于補(bǔ)充因失血導(dǎo)致的體液流失。此外，還被廣泛地用于疫苗的賦形劑、蛋白藥物的保護(hù)劑以及動物細(xì)胞和干細(xì)胞培養(yǎng)的添加劑。我國HSA每年需求量估計在420噸左右。隨著國內(nèi)外生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的蓬勃發(fā)展，HSA的市場需求將持續(xù)增加。

由于HSA在臨床和生物技術(shù)中具有重要作用，存在巨大的市場需求，為擺脫血漿來源有限的產(chǎn)能限制，以及解決利用血漿來源的市售人血清白蛋白存在傳染病毒如艾滋病病毒和肝炎病毒等的風(fēng)險，各國科學(xué)家一直在努力尋找一種不依賴血漿、安全廉價的重組人血清白蛋白（recombinant Human Serum Albumin，rHSA）的技術(shù)。自1987年開始，科學(xué)家們在細(xì)菌、酵母、動物細(xì)胞和植物等宿主中進(jìn)行了大量的探索和嘗試，并取得了一定的進(jìn)展，但細(xì)菌、酵母、動物細(xì)胞各有缺陷，被證明不適于表達(dá)重組人血清白蛋白。

水稻胚乳細(xì)胞具有完整的真核細(xì)胞蛋白質(zhì)加工體系，重組蛋白質(zhì)的翻譯、折疊和修飾都與哺乳細(xì)胞十分相近；而原核細(xì)菌以及酵母表達(dá)系統(tǒng)對蛋白的折疊和翻譯后修飾都與人類有很大區(qū)別，產(chǎn)生的蛋白存在錯誤折疊和修飾的差異。OsrHSA經(jīng)內(nèi)膜系統(tǒng)進(jìn)行加工和折疊成結(jié)構(gòu)正確的有活性的蛋白質(zhì)，并儲藏在水稻種子的蛋白體內(nèi)。

水稻種子繁殖系數(shù)高達(dá)1000倍以上，獲得大量的蛋白質(zhì)只需擴(kuò)大水稻種植面積，而且容易儲藏。而基于細(xì)胞培養(yǎng)和發(fā)酵的表達(dá)體系在擴(kuò)大生產(chǎn)時，需要進(jìn)行購置細(xì)胞生物反應(yīng)器或者發(fā)酵罐及其相應(yīng)設(shè)施，技術(shù)要求十分苛刻，不僅需要很大的固定資產(chǎn)投資，而且周期長。利用基因工程動物生產(chǎn)重組蛋白，實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)受限于非常長的動物繁殖周期。該發(fā)明技術(shù)只需在2年內(nèi)可實現(xiàn)公斤級的重組蛋白質(zhì)產(chǎn)品。

重組蛋白質(zhì)在水稻種子可保存4年，蛋白質(zhì)活性不會喪失，具有極強(qiáng)的穩(wěn)定生產(chǎn)能力，保障穩(wěn)定的產(chǎn)品供應(yīng)。由于水稻種子的儲藏蛋白不僅種類少，而且生化性質(zhì)非常清楚。尤其是水稻基因組數(shù)據(jù)詳實，為設(shè)計分離純化工藝提供了良好的技術(shù)支撐，因而加工、提取和純化工藝較為簡單，從水稻米粉中提取OsrHSA只需3步柱層析即可達(dá)到企業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，單批次生產(chǎn)周期僅需2.5天。

水稻是我國的主食，已有幾千年的食用歷史，其生物學(xué)背景清楚，目前沒有任何有關(guān)動物病原菌和病毒侵入植物細(xì)胞和植物病毒與人共患的報道，因而利用水稻表達(dá)重組蛋白質(zhì)，完全杜絕動物或人類病原菌或病毒的污染，具有更好的安全性。較傳統(tǒng)的微生物如細(xì)菌或酵母發(fā)酵技術(shù)、哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)以及基因工程動物都可能存在內(nèi)毒素、病原細(xì)菌、動物病毒等污染可能存在人畜共患的病原而引發(fā)傳染疾病的風(fēng)險；尤其是酵母或細(xì)菌的細(xì)胞壁具有復(fù)雜的糖結(jié)構(gòu)，人對這類反應(yīng)較為敏感。水稻沒有人源性傳染性疾病的病菌和病毒，還可避免血源性疾病。

水稻胚乳細(xì)胞生物反應(yīng)器將通過發(fā)酵來合成蛋白質(zhì)改為通過植物利用光合作用來完成，省去了在發(fā)酵過程中消耗大量能源和大量的污水排放問題，因而具有綠色環(huán)保特點。比較該技術(shù)與酵母發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)一克重組HSA的能耗估算：1克重組HSA的水稻原料生產(chǎn)過程的能耗是酵母的1/28。

水稻胚乳成為“蛋白生產(chǎn)車間”

水稻胚乳生物反應(yīng)器技術(shù)是利用基因工程技術(shù)改造水稻，以水稻胚乳作為“蛋白生產(chǎn)車間”來表達(dá)和生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)或者多肽的技術(shù)。整個生產(chǎn)過程包含了基因克隆、蛋白表達(dá)，原料種植、收獲、運輸、儲藏，蛋白提取、純化、加工等技術(shù)（圖1）。水稻胚乳生物反應(yīng)器以農(nóng)業(yè)的形式完成原料生產(chǎn)，而加工過程和最終產(chǎn)品又以醫(yī)藥的形式完成，將農(nóng)業(yè)和制藥業(yè)有機(jī)整合，因此又叫分子醫(yī)藥（Molecular Pharming），其產(chǎn)品稱為植物源重組藥物。

課題組利用水稻胚乳特異性啟動子、水稻偏愛密碼子優(yōu)化、蛋白質(zhì)定向存儲技術(shù)，根據(jù)人血清白蛋白氨基酸序列，人工合成水稻偏愛密碼子的人血清白蛋白基因全序列，將它克隆到水稻胚乳特異性的谷蛋白基因Gt13a的啟動子和信號肽之后，構(gòu)建了水稻轉(zhuǎn)化載體pOsPMP114，然后轉(zhuǎn)化成水稻植株，通過Western-blotting檢測篩選出在水稻胚乳高效表達(dá)OsrHSA的基因工程純合品系4-114-7。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Western-blotting、質(zhì)譜分析及氨基酸N端序列、C端序列和全序列測序、等電點、圓二色譜和近紫外光譜等進(jìn)行了結(jié)構(gòu)確證，進(jìn)一步說明OsrHSA具有與人血清白蛋白相同的一級和三級結(jié)構(gòu)；通過X射線-晶體衍射證明了OsrHSA具有與HSA（2I2Z）相同的高級結(jié)構(gòu)和構(gòu)象。

按照我國中藥材原料生產(chǎn)規(guī)范，建立了GAP管理規(guī)范，按照GAP規(guī)范和農(nóng)業(yè)部的《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理條例》建立了標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)?；N植4-114-7-9-9-37-23水稻的生產(chǎn)和稻谷加工基地，可以提供優(yōu)質(zhì)的原料。

OsrHSA的純化工藝經(jīng)一系列中試優(yōu)化，最后確定了整個純化工藝流程，即首先高溫提取、低pH沉淀、壓濾澄清后，經(jīng)過三步層析（陽離子、陰離子和疏水層析），產(chǎn)品純度可達(dá)96.0%以上，宿主蛋白含量不高于5微克/克白蛋白，內(nèi)毒素、熱源等指標(biāo)檢測合格。整個純化方法簡便，得率高，每升提取液可獲得350毫克以上純品。經(jīng)過連續(xù)4批中試生產(chǎn)，證實了該工藝穩(wěn)定可行，能夠進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化放大。

“雙規(guī)”準(zhǔn)則下的團(tuán)隊管理

圖1 植物源重組人血清白蛋白技術(shù)流程

禾元生物的研發(fā)團(tuán)隊由具有分子細(xì)胞生物學(xué)、藥理學(xué)、生物化學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)等多種專業(yè)背景的技術(shù)人才組成。本科以上學(xué)歷占公司總?cè)藬?shù)的95%以上，其中碩士/博士學(xué)歷占公司總?cè)藬?shù)的30%以上。技術(shù)人員理論基礎(chǔ)扎實，具有蛋白質(zhì)和多肽表達(dá)及純化工藝研究等生物醫(yī)藥項目研發(fā)的豐富經(jīng)驗。禾元技術(shù)團(tuán)隊穩(wěn)定，堅持創(chuàng)新，對應(yīng)用需求、技術(shù)現(xiàn)狀和未來發(fā)展都有很深的理解，并擁有項目實施經(jīng)驗。開始這個項目之前，武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院楊代常教授組織了調(diào)研團(tuán)隊，對國內(nèi)白蛋白的市場需求和產(chǎn)業(yè)發(fā)展作了詳細(xì)的調(diào)查。他發(fā)現(xiàn)，我國白蛋白需求量達(dá)到210噸/年，都是靠血漿提取。但血漿短缺度達(dá)到2/3，50%靠進(jìn)口。得出結(jié)論后，研發(fā)團(tuán)隊開始了夜以繼日的研究實驗。

研究所里定下“雙規(guī)”準(zhǔn)則：所有人必須“在規(guī)定時間內(nèi)完成規(guī)定任務(wù)”。2011年，這一項目獲得階段性成功，楊代常和研發(fā)團(tuán)隊一起，迅速開展新工藝白蛋白產(chǎn)品的臨床前藥學(xué)、毒理、藥物代謝動力學(xué)和藥效評價工作?！叭绻粋€技術(shù)開發(fā)者沒有一個控制能力的話，難以做起來。做好這個工作不容易，公司的發(fā)展和項目的推進(jìn)，得益于3個‘No’—no holiday，no weekend，no day and night(沒有節(jié)假日、沒有周末、沒日沒夜)。” 楊代常和他的研發(fā)團(tuán)隊成員一天一次討論實驗結(jié)果，周末晚上連續(xù)加班，僅用了兩個月就把新藥創(chuàng)制的純度從小數(shù)點后面的3個9提高到6個9，達(dá)到99.999999%的純度，是生物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域的一個飛躍?！?/p>

成果轉(zhuǎn)化與應(yīng)用

科研團(tuán)隊采取以市場為導(dǎo)向、以研發(fā)為驅(qū)動、以質(zhì)量為保障的商業(yè)策略，充分發(fā)揮水稻胚乳細(xì)胞特異性表達(dá)技術(shù)平臺的各項優(yōu)勢，研發(fā)具有較大市場前景、符合技術(shù)平臺優(yōu)勢的各種醫(yī)藥產(chǎn)品、工業(yè)試劑和相關(guān)技術(shù)。采取產(chǎn)品及技術(shù)銷售與服務(wù)并舉的商業(yè)模式，短期內(nèi)以產(chǎn)品原輔料與試劑為主、長期以生物醫(yī)藥制劑為主。采取國際與國內(nèi)市場并重的營銷策略，構(gòu)建“研發(fā)驅(qū)動型”的高科技企業(yè)，形成集“研發(fā)、生產(chǎn)、銷售”為一體的國際知名、國內(nèi)首創(chuàng)的植物源生物技術(shù)企業(yè)。

藥用。人血清白蛋白（HSA）是我國的一線大宗臨床用藥，被國家列為具有重大戰(zhàn)略需求、重大市場需求和存在重大安全隱患的生物藥“三重”品種。我們利用DNA重組技術(shù)，以水稻胚乳細(xì)胞作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)植物源重組人血清白蛋白（Recombinant Human Serum Albumin from Oryza sativa，OsrHSA)，克服了酵母體系表達(dá)重組人血清白蛋白（recombinant Human Serum Albumin，rHSA）因結(jié)構(gòu)不均一性和復(fù)雜糖結(jié)構(gòu)引起的熱穩(wěn)定性差與免疫反應(yīng)等問題，具有表達(dá)量高、成本低、安全性好、規(guī)?；菀?、綠色環(huán)保等優(yōu)勢。經(jīng)與市售人血清白蛋白“頭對頭”比較，在一級、二級和高級結(jié)構(gòu)上與市售人血清白蛋白等同；經(jīng)逐級放大，研發(fā)了簡單而穩(wěn)定的提取與純化工藝，批間穩(wěn)定一致；研究并制定了符合《中國藥典》2015版要求的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，除宿主蛋白、殘留核酸含量和糖蛋白含量是自行標(biāo)準(zhǔn)外，其余標(biāo)準(zhǔn)均滿足或高于《中國藥典》2015版三部的人血白蛋白標(biāo)準(zhǔn)；建立了完善而規(guī)范的質(zhì)量保障體系；藥理、毒理和藥代動力學(xué)與市售人血清白蛋白一致；大鼠肝硬化腹水藥效試驗與家兔失血性休克藥效試驗結(jié)果與市售人血清白蛋白等同。

工業(yè)用。本項目的產(chǎn)品已進(jìn)入培養(yǎng)基添加劑、美容市場，產(chǎn)品銷往美國、加拿大、歐盟、韓國、日本等國家，累計實現(xiàn)銷售312萬元，出口占60%。農(nóng)民種植醫(yī)用轉(zhuǎn)基因水稻每畝增收980元，每年增加農(nóng)民收入29.4萬元，累計增加農(nóng)民收入88.2萬元；2013-2015年預(yù)計獲得100噸左右的人血清白蛋白稻谷原料，可生產(chǎn)人血清白蛋白390～450公斤，含有人血清白蛋白的稻谷產(chǎn)值1006萬元。

人血清白蛋白技術(shù)具有完全自主知識產(chǎn)權(quán)，國內(nèi)首創(chuàng)、國際領(lǐng)先，標(biāo)志著我國植物生物反應(yīng)器的研究與應(yīng)用走在世界前列，將對我國醫(yī)藥乃至國際上醫(yī)藥生產(chǎn)帶來革命性影響，生產(chǎn)的OsrHSA可以解決我國人血清白蛋白供應(yīng)緊張的局面，滿足國家重大戰(zhàn)略需求。