張加廷 張東正 侯建雷 張仲文▲

1.武警后勤學院，天津300309；2.武裝警察部隊總醫(yī)院骨軟骨科，北京100039

定向結構Ⅰ/Ⅱ型膠原支架上兔軟骨細胞生長增殖觀察及新生組織生物力學檢測

張加廷1，2張東正2侯建雷2張仲文2▲

1.武警后勤學院，天津300309；2.武裝警察部隊總醫(yī)院骨軟骨科，北京100039

目的探討采用定向結構Ⅰ/Ⅱ型膠原軟骨支架復合軟骨細胞體外構建生物力學性能更好的組織工程軟骨。方法利用牛跟腱和豬軟骨分別提?、裥湍z原和Ⅱ型膠原并以超微量分光光度計測定其最大紫外吸收峰。利用快速冷凍自然真空凍干篩選成型法制備垂直定向微孔結構的Ⅰ/Ⅱ型膠原復合支架，同時采用普通冷凍干燥法制備非定向Ⅰ/Ⅱ型膠原復合支架。將兔軟骨細胞分別接種在兩組支架上，體外靜態(tài)培養(yǎng)3 d后掃描電子顯微鏡下觀察軟骨細胞生長情況，MTT法測量兩組支架體外靜態(tài)培養(yǎng)14 d內細胞生長情況，通過測量第7天和第14天楊氏模量和抗拉強度檢測兩種新生組織工程軟骨的生物力學性能。結果掃描電鏡觀察在兩組支架上體外培養(yǎng)3 d后的軟骨細胞生長情況良好；定向Ⅰ/Ⅱ型膠原復合支架上種子細胞在5～11 d內增殖速度高于非定向Ⅰ/Ⅱ型膠原復合支架，兩者差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；定向結構Ⅰ/Ⅱ型膠原軟骨支架的壓縮彈性模量和抗拉強度高于非定向Ⅰ/Ⅱ型膠原軟骨支架，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結論定向結構Ⅰ/Ⅱ型膠原軟骨支架能夠在特定時間段內促進細胞增殖，與軟骨細胞體外靜態(tài)培養(yǎng)后能夠成功生成具有定向纖維結構、生物力學性能更好的組織工程軟骨，是有良好應用前景的組織工程軟骨支架材料。

Ⅰ/Ⅱ型復合膠原膜；定向支架；軟骨細胞；軟骨組織工程；生物力學

臨床常見的關節(jié)軟骨缺損很難自愈，傳統(tǒng)治療方法不能實現透明軟骨修復［1］。組織工程軟骨植入是治療關節(jié)軟骨缺損效果較為確切且安全性好的治療方法［2］。Stark等［3］通過研究證明了軟骨細胞在膠原膜上能夠生存且進一步增殖。液態(tài)下的膠原蛋白形成一種膠狀溶液，其作用可刺激細胞分裂，同時膠原蛋白的一部分降解產物可被細胞利用合成新的細胞外基質［4］。Yates等［5］的研究中使用Ⅰ型膠原海綿支架搭載牛軟骨細胞，共培養(yǎng)后觀察軟骨細胞可以正常增殖并維持其表型穩(wěn)定?；冖蛐湍z原蛋白具有促進去分化軟骨細胞再分化與活化的能力［6］，Ⅱ型膠原在組織工程軟骨中越來越受重視。

關節(jié)軟骨細胞外基質的膠原成分中Ⅱ型膠原蛋白含量為90%～95%［7］。正常人體關節(jié)軟骨分為淺表層、移行層、柱狀層和鈣化層四層。鈣化層是軟骨與軟骨下骨的過渡層，起著隔離軟骨和軟骨下骨的作用，同時將二者牢固地整合在一起，軟骨營養(yǎng)主要來源于關節(jié)腔滑液，而關節(jié)液中的氧濃度明顯低于軟骨下松質骨的氧供濃度，軟骨細胞適應低氧環(huán)境，低氧條件下有利于軟骨細胞的分化、增殖，如果血液一旦侵入關節(jié)腔內，其中一些成分會因觸發(fā)炎性反應而導致新生軟骨細胞凋亡或壞死［17］。Ⅰ/Ⅱ型膠原復合支架的結構設計是與正常關節(jié)軟骨的分層結構及軟骨細胞順膠原纖維方向呈柱狀排列相對應，同時也有利于提高再生軟骨組織的生物力學性能［8］。有學者曾采用溫度梯度熱誘導相分離（temperaturegradient-guidedthermal-inducedphaseseparation，TIPS）技術成功制備了軟骨細胞基質來源的定向結構支架［9］，此種方式較為繁瑣，儀器設備要求較高，且其支架構成材料為單一Ⅱ型膠原，不能兼顧Ⅰ、Ⅱ型膠原在軟骨細胞生長中的作用［10］。筆者在Ⅱ型膠原支架的制備中發(fā)現膠原在凝膠狀態(tài)轉置于超低溫冰箱迅速冷凍后部分纖維結構可呈定向排列，經過真空凍干后可篩選接切出定向結構較為均勻的定向支架，再經過化學交聯并與Ⅰ型膠原復合后可以制成具有縱向排列纖維結構的膠原支架。尚未見使用快速冷凍真空凍干法制備定向結構Ⅰ/Ⅱ型復合膠原支架并與軟骨細胞共培養(yǎng)體外構建定向結構組織工程軟骨的報道。

1 料與方法

1.1 材料

牛跟腱及關節(jié)軟骨：北京市屠宰場購買的新鮮牛跟腱及豬膝關節(jié)關節(jié)軟骨。

1.2 主要試劑及儀器

主要試劑：碳化二亞胺（EDC）（分析純）（國藥集團化學試劑有限公司）；N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）（分析純）（國藥集團化學試劑有限公司）；乙烷磺酸（MES）（分析純）（國藥集團化學試劑有限公司）；氯化鈉（NaCl）（分析純）（國藥集團化學試劑有限公司）；胃蛋白酶（美國Sigma）；Ⅱ型膠原酶（美國Sigma）；鹽酸胍（國藥集團化學試劑有限公司）；氫氧化鈉（NaOH）（分析純）（國藥集團化學試劑有限公司）；超純水（武警總醫(yī)院醫(yī)學實驗中心提供）；DMEM高糖培養(yǎng)基（Invitrogen，美國）；胎牛血清（HyClon-e，美國）。

主要儀器：系統(tǒng)冷凍干燥機（中國四環(huán)LGJ-10C）；磁力加熱攪拌器（中國國華78-1）；電子天平（美國DenverTB-2002/203）；臺式低溫高速離心機（美國貝克曼）；倒置熒光顯微鏡（日本奧林帕斯IX-71）；超微量分光光度計（美國Alphaspecul）；酸堿測定儀（美國貝克曼）；立式恒溫振蕩器（美國精騏）；Milliproe超純水機制造系統(tǒng)（英國ELAGACENTRA-200）；可調高速勻漿機（中國FS-1型）；低速冷凍離心機（中國長沙湘智DL-5）；-80℃低溫冰箱（日本SANYO-530L）；掃描電子顯微鏡（scanningelectronicmicroscope，SEM，Hitachi，日本）；生物材料力學測試機（Shimadzu，日本）。

1.3 方法

1.3.1 定向結構Ⅰ/Ⅱ型膠原軟骨支架制備及性能檢測1.3.1.1Ⅰ型膠原蛋白的提取以新鮮牛跟腱為原料，采用乙醇脫脂-乙酸溶脹-胃蛋白酶消化-鹽析-透析-真空冷凍干燥法提?、裥湍z原蛋白，并用超微量分光光度計在220～800nm波長范圍內，進行紫外吸收峰掃描，測定樣品最大紫外吸收峰的波長。

1.3.1.2 Ⅱ型膠原蛋白的提取將豬膝關節(jié)股骨髁軟骨以手術刀小心剃下，混入少量75%酒精后置于勻漿機打碎，采用乙醇浸泡脫脂-鹽酸胍去糖蛋白-胃蛋白酶消化-鹽析-透析-真空冷凍干燥提取Ⅱ型膠原蛋白［11］，并用超微量分光光度計進行紫外吸收峰掃描，測定樣品最大紫外吸收峰的波長。

1.3.1.3 定向與非定向結構Ⅱ型膠原支架制備Wu等［12］研究證明了單向凍干法制備定向多空明膠支架的可行性。筆者將制備好的Ⅱ型膠原二次溶脹制成凝膠狀，濃度為150mg/mL，常溫下小燒杯中磁力攪拌器攪拌6h，將凝膠狀Ⅱ型膠原轉置入培養(yǎng)皿中。膠原凝膠置于未預冷的真空凍干機中，打開真空抽干機，可見大量氣泡逐漸膨脹破裂，待膠原凝膠膨脹至將要溢出器皿時關閉真空抽干機并放氣，重復此操作3～5次可見膠原凝膠中氣泡消失。將除完氣泡的凝膠置于-80℃超低溫冰箱快速冷凍24h，去除冷凍后的膠原凝膠快速置于提前遇冷至-35℃真空凍干機中真空冷凍抽干24h。觀察凍干后的膠原支架有部分區(qū)域呈均勻定向排列，以眼科剪剪取直徑5mm、厚度3mm具有垂直定向結構的Ⅱ型膠原支架。同時采用傳統(tǒng)的真空凍干法制備非定向Ⅱ型膠原支架。

1.3.1.4 制備Ⅰ/Ⅱ復合膠原膜將制備好的Ⅰ型膠原二次溶脹，配制濃度為200mg/mL的Ⅰ型膠原凝膠，均勻鋪在直徑5 cm培養(yǎng)皿中，超凈工作臺中風干。將直徑5mm、厚度3mm的定向結構Ⅱ型膠原支架鋪于風干后的Ⅰ型膠原膜上。非定向Ⅱ型膠原海綿采取同樣方法切割并鋪于風干后的Ⅰ型膠原膜上，倒入配制好的碳二亞胺交聯劑（含0.05 mol/LMES、0.033 mol/L EDC和0.02 mol/L NHS，95%的乙醇溶液）并置入立式恒溫振蕩器室溫下交聯24 h后，配制交聯劑再次交聯24 h，超純水反復沖洗5次。普通光學顯微鏡及SEM觀察定向支架及非定向支架的微觀結構特咖。

1.3.2 構建新生組織工程軟骨及相關檢測

采用3周齡新西蘭大白兔膝關節(jié)軟骨為材料，經Ⅱ型膠原酶消化法提取關節(jié)軟骨細胞［13］，體外擴增培養(yǎng)至第2代，移液器吸取細胞懸液分別接種兩組支架，細胞接種數量控制在10.0×105個/塊。培養(yǎng)3 d后利用SEM觀察軟骨細胞在定向Ⅰ/Ⅱ型膠原支架和非定向支架上的形態(tài)及分布特咖，采用MTT方法檢測細胞在兩組支架上的增殖情況。在共培養(yǎng)第7天和第14天利用生物材料力學測試機分別測定兩組新生組織工程軟骨的楊氏模量（0.05 N，速率0.01 mm/s，行程：初始高度的4%，松弛相：2000 s）和抗拉強度（5mm/min拉伸），檢測兩組新生組織的生物力學性能。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，若數據符合正態(tài)分布以均數±標準差（表示。采用獨立樣本t檢驗（independent-tests）比較MTT法檢測的細胞在兩組支架上增殖情況，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）比較兩組新生組織工程軟骨生物力學性能，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

圖1 膠原蛋白的紫外吸收峰

圖2 定向結構支架與非定向結構Ⅰ/Ⅱ型支架示意圖及Ⅱ型膠原定向與非定向支架

2 果

2.1 膠原紫外吸收峰及大體和顯微鏡觀察支架結構

經過超微量分光光度計（Picdrop Application系統(tǒng)軟件）測定Ⅰ型膠原蛋白的紫外光吸收值在226.5 nm左右形成一個波峰（圖1a）；Ⅱ型膠原凝膠在233.8 nm左右形成一個較高的波峰（圖1b），這符合Ⅱ型膠原最大吸收峰特征［14］。支架大體結構及顯微鏡觀察示Ⅰ/Ⅱ型雙層復合膠原膜結構中，底層為高度致密、光滑、均勻的Ⅰ型膠原膜；頂層為相對低密度Ⅱ型膠原膜層，表面呈白色、粗糙、海綿樣結構，鏡下孔徑致密，分布較均勻，為軟骨細胞提供良好的生長環(huán)境；Ⅰ、Ⅱ型雙層膠原膜之間經過化學交聯，使它們結合緊密，堅固牢靠無空隙。交聯后的定向結構支架顯微鏡下可見膠原纖維平行排列，非定向膠原支架纖維鏡下可見膠原纖維無序排列（圖2～3）。

2.2 掃描電鏡觀察定向與非定向雙層支架微觀結構

對定向支架橫切面的SEM觀察發(fā)現，橫切面膠原纖維排列雖然缺少一定規(guī)律，但可見管狀空道，孔道間有空隙相互貫通（圖4a，封三）?？v切面觀察可見上方縱向規(guī)律排列的Ⅱ型膠原纖維及與之密切交聯、密度較大的Ⅰ型膠原底面（圖4b，封三）。非定向支架SEM觀察其橫向和縱向切面膠原纖維排列無顯著差異，纖維排列呈均勻多孔狀結構，排列無序相互間有微孔貫通（圖5a、b）。

圖3 定向結構Ⅰ/Ⅱ型膠原支架大體觀察及顯微鏡下觀察

圖5 掃描電子顯微鏡下非定向支架微結構觀察

2.3 掃描電鏡觀察軟骨細胞在兩組雙層支架上的生長情況

將兔軟骨細胞植入兩組膠原支架后共培養(yǎng)3 d，SEM觀察兩組支架上均能發(fā)現正常生長的軟骨細胞，軟骨細胞黏附于定向支架內平行排列微觀孔道的孔壁上，細胞分布具有一定的規(guī)律性和方向性（圖4c，封三），可見細胞伸出偽足，生長狀況良好（圖4d，封三）；非定向軟骨支架中的軟骨細胞分布較為隨機和均勻，無明顯的方向性（圖5c），生長狀況良好（圖5d）。

圖6 軟骨細胞在定向支架及非定向支架上的增殖

2.4 MTT法檢測軟骨細胞不同時間段在兩組雙層膠原支架上的增殖情況

第1～4天時定向結構Ⅰ/Ⅱ型膠原支架與非定向Ⅰ/Ⅱ型膠原支架上細胞數量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；第5～11天定向結構Ⅰ/Ⅱ型膠原支架中細胞數量大于非定向支架組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；第12～15天兩組支架細胞數量再次趨于一致，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（圖6）。

2.5 生物力學檢測

培養(yǎng)第7天，定向結構Ⅰ/Ⅱ型膠原支架與非定向Ⅰ/Ⅱ型膠原支架壓縮彈性模量分別為（0.21± 0.04）、（0.11±0.03）MPa，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；抗拉強度分別為（0.88±0.05）、（0.53±0.04）MPa，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。培養(yǎng)第14天，定向Ⅰ/Ⅱ型膠原支架壓縮彈性模量為（0.33±0.09）MPa，非定向Ⅰ/Ⅱ型膠原支架壓縮彈性模量為（0.20±0.06）MPa，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；抗拉強度分別為（1.01±0.08）、（0.63±0.07）MPa，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。但兩組均明顯低于正常關節(jié)軟骨的壓縮彈性模量［（0.69± 0.09）MPa］、抗拉強度［（5.20±0.72）MPa］，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖7～8）。

3 論

當前國內臨床醫(yī)生在治療關節(jié)軟骨缺損時采取的主要方法有骨髓刺激技術，如軟骨下鉆孔術、微骨折手術等，而這些技術新生軟骨大多為纖維樣軟骨，另一種常用的手術為馬賽克技術，該技術取自體非負重區(qū)軟骨作為移植供體，對于患者本身可能造成二次損傷［15］。近年蓬勃發(fā)展的基質誘導的自體軟骨細胞移植（MACI）技術已應用于臨床且被證明是一種臨床效果顯著、再生軟骨以透明軟骨為主的軟骨缺損理想治療方法［16］。但是當前國內用于構建組織工程軟骨的細胞支架材料各不相同且多為單一類型支架，實驗研究中若沒有類似軟骨基底層的隔離，來源于軟骨下骨的血液會侵入關節(jié)腔內，其中一些成分不僅會對軟骨缺損修復研究產生干擾，更嚴重地會觸發(fā)炎性反應而導致新生軟骨細胞凋亡或壞死。這也就要求我們在制備軟骨細胞支架時要模擬正常關節(jié)的骨軟骨分層結構，才能更好地促進關節(jié)骨軟骨缺損的修復［17］，其在臨床中對人體關節(jié)軟骨缺損的治療作用尚待進一步試驗證實。膠原纖維和軟骨細胞整體上具有柱狀排列的趨勢并垂直于關節(jié)表面，這種高度方向性的排列方式對于正常關節(jié)軟骨機械力學性能的維持尤為重要［18］。

圖7 新生組織工程軟骨壓縮彈性模量檢測

圖8 新生組織工程軟骨抗拉強度檢測

Ⅰ/Ⅱ型雙層復合膠原膜結構中，底層為高度致密、光滑、均勻的Ⅰ型膠原膜，鏡下孔徑微??；頂層為高濃度Ⅱ型膠原膜層，表面呈白色、粗糙、海綿樣結構，鏡下孔徑致密，分布較均勻，為軟骨細胞提供良好的生長環(huán)境；Ⅰ、Ⅱ型雙層膠原膜之間經過化學交聯，使它們結合緊密，堅固牢靠無空隙［19］。在培養(yǎng)第5～11天細胞增殖量定向Ⅰ/Ⅱ型膠原支架明顯多于非定向支架，原因可能為培養(yǎng)初期軟骨細胞沿著定向支架中縱向排列的微觀孔道向支架內部快速遷移，同時代謝產物交換和營養(yǎng)物質輸送得到了促進，因而導致細胞增殖速度明顯提高［20］。隨著支架上種子細胞的數量及軟骨細胞不斷分泌的基質成分持續(xù)增多，可能部分堵塞定向微管孔壁上相互貫通的孔隙，抵消了定向支架所具有的優(yōu)勢，導致兩組支架上的細胞數量最終趨于一致。通過壓縮彈性模量檢測和抗拉強度檢測說明定向結構Ⅰ/Ⅱ型膠原支架的機械力學性能高于傳統(tǒng)非定向支架，原因可能是定向結構Ⅰ/Ⅱ型膠原支架所具有的垂直平行排列微管結構提高了組織工程軟骨力學性能，在一定時間段內促進了軟骨細胞的增殖和自分泌，這也可能有助于提高組織工程軟骨的力學性能。雖然筆者在實驗中未檢測比較定向結構Ⅰ/Ⅱ型膠原支架與傳統(tǒng)的定向結構支架間生物力學性能間的差別，但傳統(tǒng)的定向結構微觀通道軟骨支架多為單純Ⅱ型膠原，而本研究在此基礎上于Ⅱ型膠原底部增加了較為致密且生物力學性能更強的Ⅰ型膠原，這也就大大增強了復合膠原膜的生物力學性能，而其增強程度有待于進一步研究。

［1］MarcacciM，FilardoG，Kon E.Treatmentofcartilage lesions：whatworksand why？［J］.Injury，2013，44 Suppl1：S11-S15.

［2］Basad E，Wissing FR，Fehrenbach P，et al.Matrix-induced autologous chondrocyte implantation（MACI）in the knee：clinical outcomes and challenges［J］.Knee Surg Sports TraumatolArthrosc，2015，23（12）：3729-3735.

［3］Stark Y，Suck K，Kasper C，et al.Application of collagen matrices for cartilage tissue engineering［J］.Exp Toxicol Pathol，2006，57（4）：305-311.

［4］Tekari A，Luginbuehl R，Hofstetter W，et al.Chondrocytes expressing intracellular collagen typeⅡenter the cell cycle and co-express collagen type I in monolayer culture［J］.J Orthop Res，2014，32（11）：1503-1511.

［5］Yates KE，Allemann F，Glowacki J.Phenotypic analysis of bovine chondrocytes cultured in 3D collagen sponges：effect of serum substitutes［J］.Cell Tissue Bank，2005，6（1）：45-54.

［6］蔣萍，蔚芃，趙明才，等.Ⅰ、Ⅱ型膠原蛋白對人軟骨細胞生物學特性的影響［J］.中國組織工程研究，2014，18（30）：4845-4850.

［7］Mirzayan R.Cartilage Injury in the Athlete［M］.New York：Thieme Medical，2006：1-20.

［8］Duan W，Da H，Wang W，et al.Experimental study of tissue engineered cartilage construction using oriented scaffold combined with bonemarrow mesenchymal stem cells in vivo［J］.Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi，2013，27（5）：513-519.

［9］Ding X，Zhu M，Xu B，et al.Integrated trilayered silk fibroin scaffold for osteochondral differentiation of adiposederived stem cells［J］.ACSAppl Mater Interfaces，2014，6（19）：16696-16705.

［10］羅琦，劉凱.細胞團塊懸浮培養(yǎng)法對兔關節(jié)軟骨細胞表型維持效果的研究［J］.中國醫(yī)藥導報，2015，12（35）：20-25.［11］劉安軍，宋曉娣，鄭捷，等.豬Ⅱ型膠原及膠原肽抗關節(jié)炎的研究［J］.現代食品科技，2014，30（3）：1-6.

［12］Wu X，Liu Y，LiX，etal.Preparationofaligned porousgelatin scaffolds by unidirectional freeze-dryingmethod［J］.Acta Biomater，2010，6（3）：1167-1177.

［13］閆虎，蘇友新，林學，等.Ⅱ型膠原酶消化法培養(yǎng)兔關節(jié)軟骨細胞［J］.中國組織工程研究，2013，17（50）：8647-8653.

［14］Ghezzi CE，Marelli B，Muja N，et al.Mesenchymal stem cell-seeded multilayered dense collagen-silk fibroin hybrid for tissue engineering applications［J］.Biotechnol J，2011，6（10）：1198-1207.

［15］Valderrabano V，Leumann A，Rasch H，etal.Knee-to-anklemosaicplasty for the treatmentof osteochondral lesions of the ankle joint［J］.Am JSportsMed，2009，37 Suppl1：105S-111S.

［16］Wiewiorski M，Leumann A，Buettner O，et al.Autologous matrix-induced chondrogenesis aided reconstruction of a large focalosteochondral lesion of the talus［J］.Arch Orthop Trauma Surg，2011，131（3）：293-296.

［17］笪虎，劉建.致密層在骨軟骨復合支架修復兔關節(jié)骨軟骨缺損中作用的研究［D］.西安：第四軍醫(yī)大學，2013.

［18］Wu JZ，HerzogW.Elastic anisotropy ofarticular cartilage is associated with the microstructures of collagen fibers and chondrocytes［J］.JBiomech，2002，35（7）：931-942.

［19］封占增.京尼平、戊二醛或EDC/NHS的交聯對構建膠原/殼聚糖真皮支架的作用［D］.杭州：浙江大學，2014.

［20］Tekari A，Luginbuehl R，HofstetterW，et al.Transforming growth factor beta signaling is essential for the autonomous formation of cartilage-like tissue by expanded chondrocytes［J］.PLoSOne，2015，10（3）：e0120857.

Observation of chondrocytes proliferation in oriented com posite typeⅠ/Ⅱcollagen scaffold and biomechanical property of new tissue

ZHANG Jiating1，2ZHANG Dongzheng2HOU Jianlei2ZHANG Zhongwen2▲
1.logistic University of People's Armed Police Force，Tianjin 300309，China；2.Department of Cartilaginous Orthopeadics，General Hospital of Armed Police Forces，Beijing 100039，China

Objective To fabricate an oriented composite typeⅠ/Ⅱcollagen scaffold combined with chondrocytes for enhancement of the biomechanical property of tissue-engineered cartilage in vitro.M ethods The typeⅠand typeⅡcollagen extracted from bovine tendon and pig knee articular cartilage were prepared.Collagen maximum UV absorption peak was detected by themicroliter spectrophotometer.Oriented composite typeⅠ/Ⅱcollagen scaffoldswere fabricated composed ofmicrotubules arranged in parallel in vertical sectionvia quick freezing and vacuum freeze-drying process.At the same time，non-oriented typeⅠ/Ⅱcollagen scaffolds were fabricated via the vacuum freeze drying method.Oriented typeⅠ/Ⅱcollagen scaffolds and non-oriented typeⅠ/Ⅱcollagen scaffolds were seeded with rabbit chondrocytes and the growth of chondrocytes were observed with scanning electronic microscope 3 days later.Cellscaffold constructs were measured by MTTmethod to observe the growth of chondrocytes within 14 days.Mechanical properties of oriented and non-oriented scaffolds were determined by measurement of Young modulus and tensile strength on the 7th day and 14th day after co-cultured vitro.Resu lts Under the scanning electron microscope，the cells adhered to both oriented scaffolds and non-oriented scaffolds grew well on the third day after co-culture.The proliferation was statistically significantly higher in the oriented typeⅠ/Ⅱcollagen scaffold group than in the non-oriented scaffold group from day 5 to day 11（P＜0.05）.The compressivemodulus and tensile strength of oriented scaffoldswere higher than thatof a typical non-oriented scaffold（P＜0.05）.Conclusion The results indicate that composite typeⅠ/Ⅱcollagen scaffolds can promote cell proliferation within certain time periods and enhance the biomechanical property of tissue-engineered cartilage in vitro and thus represent a promisingmaterial to tissue engineering cartilage.

TypeⅠ/Ⅱcollagen scaffold；Oriented scaffold；Chondrocytes；Cartilage tissue engineering；Biomechanical property

R684.3；R318.01

A

1673-7210（2016）05（c）-0025-06

2016-02-02本文編輯：張瑜杰）

武裝警察部隊總醫(yī)院課題（WZ2012016）。

▲通訊作者