文/賽音呼格吉樂　于景華*（天津科技大學(xué)）

嬰幼兒配方乳粉中乳清蛋白含量測定方法

文/賽音呼格吉樂于景華*
（天津科技大學(xué)）

乳清蛋白具有獨特的生物學(xué)功能，是重要的蛋白來源。為此綜述了國內(nèi)外關(guān)于嬰幼兒配方乳粉中乳清蛋白含量測定的方法以及相關(guān)乳制品中乳清蛋白含量的測定方法。

嬰幼兒配方乳粉；乳清蛋白；含量測定

乳清蛋白作為嬰幼兒生長發(fā)育過程中重要營養(yǎng)成分，比酪蛋白具有更高的營養(yǎng)價值，并且更容易被人體消化吸收。母乳中乳清蛋白和酪蛋白的比例為60︰40[1]，而牛乳中的蛋白質(zhì)組成與人乳相比具有較大的差異，其中乳清蛋白與酪蛋白的比例約為20︰80。為了使以牛乳為原料的嬰兒配方乳粉更接近母乳，為嬰兒提供更利于其生長的營養(yǎng)，可適當(dāng)添加符合相關(guān)規(guī)定的乳清粉或乳清蛋白粉作為營養(yǎng)強化劑。我國國家標(biāo)準(zhǔn)GB 10765-2010《嬰兒配方食品》[2]中有相關(guān)要求，即嬰兒配方食品中乳清蛋白含量應(yīng)大于60%。熱處理是食品加工過程的必要手段，乳清蛋白中主要功能性組分α-乳白蛋白和β-乳球蛋白等會在這些熱處理過程中發(fā)生變性，而熱處理的時間和溫度會導(dǎo)致這些組分發(fā)生不同程度的變性，通常這些變性是影響乳品中乳清蛋白品質(zhì)的重要因素，會影響其活性，降低其營養(yǎng)價值，并且對嬰幼兒的消化吸收造成不利影響[3]。因此，需要一個高效、準(zhǔn)確并且適用于嬰幼兒配方乳粉的測定方法來為其有效的營養(yǎng)價值提供參考依據(jù)和檢測方法。目前，國內(nèi)外關(guān)于乳清蛋白定量檢測方法的報道有很多，其中不乏一些新的方法和對舊方法的改進。因此，有必要總結(jié)多種乳清蛋白檢測方法，評價其優(yōu)缺點，為今后優(yōu)化檢測方法提供基礎(chǔ)。

1　SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳法

聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）用于分離蛋白質(zhì)和寡核苷酸時具有良好的效果，近些年被廣泛用于分離乳清蛋白。十二烷基硫酸鈉（SDS）是一種很強的陰離子表面活性劑，可以與蛋白質(zhì)通過疏水相互作用結(jié)合。不同的蛋白質(zhì)在具有分子篩效應(yīng)的凝膠中發(fā)生遷移，從而實現(xiàn)彼此分離。該方法能有效地分離α-乳白蛋白和β-乳球蛋白。目前我國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5413.2-1997《嬰幼兒配方食品和乳粉乳清蛋白的測定》[4]中就是采用了SDS-PAGE法。具體方法是：首先將凝膠放入電泳槽中，再加入緩沖液，試樣溶液與標(biāo)準(zhǔn)溶液的添加量為每孔10 μL，以10%～20%的梯度復(fù)合凝膠進行電泳，電流為40 mA，時間為60 min。酪蛋白與乳清蛋白會按分子量的順序分離開，采用光密度計對其進行測定，求得其顏色深度（OD）的積分值（=Trace值）。通過3 種酪蛋白（α-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白）譜帶的Trace值計算出酪蛋白的比率，以及采用同樣的方法計算出乳清蛋白的比率[4]。

國標(biāo)法對儀器設(shè)備的要求比較高，張杉等采用了普通的掃描儀和Bandscan軟件[5]。具體方法是：把實驗得到的凝膠進行掃描，用該軟件分析其條帶的灰度值，并通過灰度值和濃度之間的關(guān)系對電泳結(jié)果進行定量分析，在一定的濃度范圍內(nèi)樣品的總灰度值和樣品濃度之間存在著線性關(guān)系[5]。而賈宏信等認(rèn)為國標(biāo)法存在一定的缺陷，因為不同的蛋白質(zhì)結(jié)合考馬斯亮藍的能力不同，因此相同濃度的不同蛋白質(zhì)會表現(xiàn)出不同的光密度值，從而導(dǎo)致檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度較低，誤差較大。因此，他們采用ChemiDoc XRS+成像系統(tǒng)的Quantity One圖像處理軟件處理圖像，得出不同蛋白條帶總的Trace值，然后計算乳粉內(nèi)乳清蛋白占總蛋白的比例[6]。

不難看出，聚丙烯酰胺凝膠電泳法對α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的分離效果顯著，然而對β-乳球蛋白的2 種遺傳變異體β-乳球蛋白A和β-乳球蛋白B并不能進行有效的分離。

2　氨基酸折算法

氨基酸是組成蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位，人體攝入蛋白質(zhì)后會使其分解成氨基酸從而吸收利用；Association of Official Analytical Chemists（AOAC）標(biāo)準(zhǔn)起草人Wesley 等提出采用氨基酸模式來定量計算乳基嬰幼兒配方食品中乳清蛋白百分比[7]。AOAC關(guān)于乳基嬰幼兒配方奶粉中乳清蛋白的檢測標(biāo)準(zhǔn)是根據(jù)乳清蛋白和酪蛋白中的4種特征氨基酸，即天冬氨酸/天冬酰胺（Asx）、丙氨酸（Ala）、苯丙氨酸（Phe）和脯氨酸（Pro）的含量折算出嬰幼兒配方奶粉中乳清蛋白的百分比[8]。計算公式如下：

式中：R—特征氨基酸的比值；fw（%）—乳清蛋白百分比。

李爽等對氨基酸折算法計算嬰幼兒配方乳粉中乳清蛋白含量的方法進行了分析評價。結(jié)果表明，該氨基酸折算法對嬰幼兒配方乳粉中乳清蛋白含量的定量研究具有參考價值。然而添加大豆分離蛋白實驗的結(jié)果表明，添加大豆分離蛋白可明顯改變氨基酸組成，說明該氨基酸折算法評價嬰幼兒配方粉中乳清蛋白含量的方法只適用于乳基嬰幼兒配方乳粉，對含有豆基配方粉的產(chǎn)品不適用[9]。

3　高效液相色譜法

高效液相色譜是色譜法的一個重要分支，以液體為流動相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進入檢測器進行檢測，從而實現(xiàn)對試樣的分析[10]。趙海霞等采用C8色譜柱，流動相A為0.1%的三氟乙酸-水溶液，流動相B為0.09%的三氟乙酸-乙腈溶液，梯度洗脫，流速為0.8 mL/min，二極管陣列檢測器的檢測波長為215 nm，柱溫為30 ℃[11]。外標(biāo)法定量，α-La和β-Lg兩種組分線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)分別為0.9998和0.9984，檢測限分別為3 μg/mL、10 μg/mL，為定量測定α-乳白蛋白和β-乳球蛋白含量提供有效方法[11]。

近年來反相液相色譜作為新興的色譜分離技術(shù)，其機理得到了深入的研究。在乳清蛋白測定方面反相液相色譜的應(yīng)用也越來越廣泛。李慧等應(yīng)用RP-HPLC在乳清蛋白中分離出α-乳白蛋白和β-乳球蛋白[12]。而王浩等采用RP-HPLC法在乳品中分離出7種蛋白質(zhì)[13]。朱鑫鑫等采用RPHPLC法分離出BSA、α-La、β-LgB和β-LgA 4 種乳清蛋白成分，并且可以定量測定出未變性的乳清蛋白[14]。但是在此之前要將變性的乳清蛋白和酪蛋白去除，采用的方法是以鹽酸為pH值調(diào)節(jié)劑，用等電點沉淀法除去變性的乳清蛋白和酪蛋白[14]。以此方法可以檢測出乳清蛋白組分之間變性程度的差異和各種產(chǎn)品之間乳清蛋白量濃度的差異，可以為脫脂乳及脫脂乳粉中乳清蛋白成分的定性和定量提供可靠的測量方法。

由于常用的高效液相色譜柱填料的直徑為5 μm，導(dǎo)致需要花費較長時間來分離目標(biāo)產(chǎn)物，因此超高效液相色譜技術(shù)（UHPLC）得以應(yīng)用。UHPLC色譜柱填料的直徑降低為1.7～5.0 μm，固定相的粒徑越小，理論塔板高度越小，柱效也就越高[21]。

高效液相色譜法通常是通過紫外吸收來定量的。而蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，容易發(fā)生結(jié)構(gòu)變性以及造成分離柱吸附。因此采用高效液相色譜法經(jīng)常會出現(xiàn)實驗結(jié)果的回收率低和分離度差等問題，仍需要對實驗條件不斷地優(yōu)化來降低誤差。

4　液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS）

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)是近10 年來興起的新技術(shù)，相比于其它色譜方法，其具有更高的選擇性和靈敏度。近年來的一些研究也證明LC-MS技術(shù)在蛋白質(zhì)分析領(lǐng)域具有較高的應(yīng)用價值。Christoph C等[15]采用LC-MS聯(lián)用方法測定牛奶和乳制品中β-乳球蛋白的含量。而對于α-乳白蛋白，Ren Yiping等[16]采用UHPLC-MS聯(lián)用方法進行了測定，同時也可以測出β-乳球蛋白的含量。采用直徑1.7 μm的C18色譜柱，而流動相仍然采用0.1%的三氟乙酸水溶液和0.1%的三氟乙酸乙腈溶液[11]。

在此基礎(chǔ)上，張京順[17]應(yīng)用UHPLC-MS聯(lián)用技術(shù)檢測出非變性α-乳白蛋白和β-乳球蛋白，為了降低基質(zhì)干擾，采用人乳α-乳白蛋白作為內(nèi)標(biāo)和空白基質(zhì)。采用三氟乙酸、乙腈溶液作流動相。在質(zhì)譜中定量檢測時采用選擇區(qū)間掃描方式，之后對所建立的方法分別進行室內(nèi)方法學(xué)驗證，并且對收集到的相關(guān)產(chǎn)品進行了分析檢測，均獲得了較好的結(jié)果。

5　毛細(xì)管電泳法

毛細(xì)管電泳（CE）又稱高效毛細(xì)管電泳（HPCE），通常采用毛細(xì)管作為分離通道在高壓電場中進行分離。唐萍等[18]利用毛細(xì)管電泳法研究了乳制品中蛋白成分的分離與測定。利用檸檬酸緩沖體系，對牛奶中的α-乳白蛋白（α-La）、β-乳球蛋白（β-Lg）、α-酪蛋白（α-CN）、β-酪蛋白（β-CN）、κ-酪蛋白（κ-CN）5 種蛋白進行了很好的分離。楊媛媛等[19]建立了高效毛細(xì)管電泳分離乳清蛋白中 α-La、β-LgA和β-LgB的方法，并且加入羥丙基-β-環(huán)糊精和聚氧化乙烯（PEO）為分離緩沖溶液來降低內(nèi)壁吸附。張毅杰[20]采用硼酸鹽緩沖體系和自制的聚丙烯酰胺涂層毛細(xì)管，在紫外檢測波長214 nm，分離電壓20 kV條件下，很好地分離了牛奶中α-乳白蛋白（α-La）和β-乳球蛋白（β-Lg）。

對于毛細(xì)管電泳法，由于受到進樣量和電壓的限制，該方法的檢測靈敏度較低，從而導(dǎo)致實驗的準(zhǔn)確性會相對較差一些。同時，毛細(xì)管內(nèi)壁容易吸附堿性蛋白等生物大分子，會導(dǎo)致峰拖尾和展寬，甚至形成不可逆吸附使分離無法進行[19]。

6　其它方法

凝膠色譜（GC）是一種物理性分離方法。其原理是被分離的混合物在通過具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠顆粒時，比凝膠孔徑大的分子不能進入凝膠而從凝膠顆粒之間的空隙間流動，所以被最先洗脫出來；而比凝膠孔徑小的分子能不同程度地自由出入凝膠內(nèi)外空隙，因而遷移的路徑變長且速率變慢，最后被洗脫出來[21]。但凝膠色譜分辨率較低，對于分子量差別比較小的蛋白質(zhì)無法進行有效的分離，例如β-乳球蛋白的2 個遺傳變異體β-乳球蛋白A和β-乳球蛋白B，兩者之間僅有90 Da的分子量差異，故無法進行有效分離[16]。

毛細(xì)管電色譜技術(shù)（CEC）是以電滲流為驅(qū)動力，同時在毛細(xì)管內(nèi)填充或在內(nèi)壁涂覆、鍵合或交聯(lián)色譜固定相的一種微柱液相色譜技術(shù)[21]，近年在多肽和蛋白質(zhì)的分離和分析上具有較好的表現(xiàn)。但是該技術(shù)在乳清蛋白的檢測和分析上報道不多，技術(shù)也相對不是很成熟。未來在乳清蛋白的分析檢測中，可以利用其極佳的分離特性對乳清蛋白各組分進行更好的分離分析?？傊?，該方法具有非常好的應(yīng)用前景。

7　總結(jié)

綜上所述，SDS-PAGE法僅能分離出α-乳白蛋白（α-La）和β-乳球蛋白（β-Lg），并不能對β-乳球蛋白的2 種遺傳變異體——β-乳球蛋白A和β-乳球蛋白B進行有效分離。而很多方法對于經(jīng)過一定加熱處理后的樣品，由于蛋白質(zhì)變性，其測定結(jié)果與實際含量存在一定的誤差。每個方法也都存在一些系統(tǒng)性的缺點，導(dǎo)致實驗結(jié)果不理想。因此需要在特定的情況下應(yīng)用相應(yīng)的方法，例如僅需測定2 種主要乳清蛋白時采用聚丙烯酰胺凝膠電泳法，又或者在測定乳基嬰幼兒配方乳粉的乳清蛋白酪蛋白比例時采用氨基酸折算法。高效液相色譜法中反相高效液相色譜法應(yīng)用較多，尤其是在對非極性和弱極性物質(zhì)的分離中。而想要讓分離時間更短，可采用超高效液相色譜技術(shù)。通過采用質(zhì)譜作為檢測系統(tǒng)，可獲得相對分子質(zhì)量以及結(jié)構(gòu)信息。毛細(xì)管電泳法較適合少量的樣品測定，而對于內(nèi)壁吸附問題可加入聚氧化乙烯（PEO）以及羥丙基-β-環(huán)糊精來獲得較好效果。未來仍需不斷改良當(dāng)前的方法，并對毛細(xì)管電色譜等新技術(shù)掌握越來越成熟，以達到最好的檢測效果。C

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國家自然科學(xué)基金（31271904）]

賽音呼格吉樂（1989-），男，在讀碩士研究生，研究方向為乳品科學(xué)與工程。

?于景華（1966-），男，教授，博士研究生，研究方向為乳品科學(xué)與工程。

（2016-05-05）