汪三存，丁美滿，魏曉林，姚斐，張濤

（1.嘉興市公安局刑偵支隊DNA實驗室，浙江嘉興　314001；2.嘉興市公安局南湖區(qū)分局刑偵大隊，浙江嘉興　314001）

碎尸案中腐敗肌肉、牙齒的STR分型

汪三存1，丁美滿1，魏曉林1，姚斐1，張濤2

（1.嘉興市公安局刑偵支隊DNA實驗室，浙江嘉興314001；2.嘉興市公安局南湖區(qū)分局刑偵大隊，浙江嘉興314001）

法醫(yī)遺傳學(xué)；短串聯(lián)重復(fù)序列；試劑盒；疑難檢材

碎尸和腐敗尸體案件的檢材以腐敗肌肉組織、骨骼和牙齒為主，成功獲得這類腐敗、降解檢材的STR分型對案件的偵辦至關(guān)重要。本研究通過聯(lián)合應(yīng)用QIAcube全自動核酸純化儀和REPLI-g?Single Cell試劑盒的方法提取、純化高度腐敗降解組織DNA，以提高嚴重降解等疑難檢材的STR分型成功率。

1　材料與方法

1.1材料

13份檢材均來自實驗室的檢案。其中烹煮尸塊的高壓鍋排氣閥濾網(wǎng)內(nèi)、外側(cè)和絞肉機進料管T形口內(nèi)側(cè)壁疑似組織擦拭棉簽各1份，共3份，塑料PV管內(nèi)封裝19個月的肌肉組織9份，尖牙1顆。

1.2檢驗過程

1.2.1主要試劑及儀器

REPLI-g?Single Cell試劑盒（德國QIAGEN公司）、QIAamp DNA Investigator試劑盒（德國QIAGEN公司）、Investigator Lyse&Spin Baske試劑盒（德國QIAGEN公司）、QIAcube全自動核酸純化儀（德國QIAGEN公司）、TissueLyserⅡ骨頭粉碎儀（德國QIAGEN公司）、GlobalFiler?PCR擴增試劑盒（美國AB公司）、9700型基因擴增儀（美國AB公司）、3500xl型遺傳分析儀和GeneMapper?ID-X1.4分析軟件（美國AB公司）。

1.2.2 DNA提取和純化

組織的DNA提取：剪取肌肉組織塊中間部分黃豆大小一塊，剪取疑似組織擦拭棉簽頭部斑跡，置于Investigator Lyse&Spin Baske試劑盒套管中。按照QIAamp DNA Investigator試劑盒推薦的方法裂解2h，按照QIAcube的洗脫體系20μL進行DNA提取。

牙齒的DNA提?。河肨issueLyserⅡ骨頭粉碎儀低頻（10/s，5 s）去掉牙齒表面腐敗質(zhì)后，置于2 mL離心管（Investigator Lyse&Spin Baske試劑盒附帶）內(nèi)，加入去離子水1.5 mL浸泡1 h，去水晾干，再用TissueLyserⅡ骨頭粉碎儀高頻（25/s，3 s）進行粉碎。牙粉置于另一潔凈的2mL離心管內(nèi)，加入500mL的EDTA脫鈣8 h，按照QIAamp DNA Investigator試劑盒推薦的方法加入ATL和PK裂解2h，離心，上清液用QIAcube的洗脫體系20 μL進行DNA提取，獲得20 μL DNA模板；沉淀部分為余下的牙粉，再加入500mL的EDTA脫鈣8h，按前述方法重復(fù)進行ATL和PK裂解，QIAcube洗脫、提取，第二次獲得20 μL DNA模板。將兩次獲得的共計40μL DNA模板，用micro-100柱濃縮至10μL DNA模板備用。

DNA模板的純化參照REPLI-g?Single Cell試劑盒推薦的方法進行。

1.2.3 STR多態(tài)性檢驗

取6μL上述未經(jīng)純化的模板DNA按照Global-Filer?PCR擴增試劑盒推薦的方法，經(jīng)9700基因擴增儀進行PCR復(fù)合擴增，擴增產(chǎn)物應(yīng)用3500xl型遺傳分析儀進行檢測，結(jié)果GeneMapper?ID-X1.4軟件進行數(shù)據(jù)分析。按照STR分型判讀要求［1］進行判讀。

未獲得良好分型結(jié)果的檢材模板DNA經(jīng)純化后取1μL按上述方法再進行PCR復(fù)合擴增及數(shù)據(jù)分析。

2　結(jié)果

13份未經(jīng)純化的模板DNA只有3份檢材在全部基因座獲得良好分型，其余10份檢材未在全部基因座獲得良好分型（表1）。將未在全部基因座獲得良好分型數(shù)據(jù)的10份檢材的余下模板DNA按REPLI-g?Single Cell試劑盒的方法進行純化，結(jié)果9份檢材全部獲得良好分型數(shù)據(jù)，僅1份PV管內(nèi)肌肉組織仍然未獲得STR分型數(shù)據(jù)。

表1　常規(guī)擴增所獲分型情況

3　討論

黃婭琳［2］針對新鮮肌肉組織的研究表明，高溫烹飪不影響肌肉組織的DNA可檢測性，但沒有對腐敗組織的DNA檢測進行研究。腐敗組織DNA提取的關(guān)鍵在于充分裂解組織，盡可能去除肌腱筋膜等有形物質(zhì)和脂肪組織裂解后在液面形成的油脂層影響，確保獲得高純度的模板DNA。

本研究中高壓鍋排氣閥濾網(wǎng)內(nèi)外側(cè)提取的疑似組織，雜質(zhì)較多，塑料PV管內(nèi)的肌肉組織經(jīng)歷了1年半左右的時間，上述檢材DNA均高度腐敗，嚴重降解。本研究在DNA提取時，將檢材置于Investigator Lyse&Spin Baske試劑盒套管中，加入高效價的PK進行裂解，經(jīng)過兩次套管離心，肌腱、筋膜等不完全消化的有形物質(zhì)被徹底過濾，也消除了脂肪等形成的油脂液層對后續(xù)反應(yīng)的影響。

QIAcube進行DNA提取的原理屬于硅膠膜吸附法，其回收的DNA在純度和片段大小上都有優(yōu)勢［3］，而且自動化程度高，減少了損失和污染的風(fēng)險。本研究采用QIAcube進行DNA提取，盡可能提高了DNA的回收率，但由于DNA降解的影響，因此大部分檢材的大片段基因座分型效果差，小片段基因座相對較好。

REPLI-g?Single Cell試劑盒說明書介紹，該試劑盒中Phi29聚合酶在DNA復(fù)制過程中，其核酸外切酶的活性比Taq酶效價高出1000倍，經(jīng)該試劑盒純化或全基因組擴增后，產(chǎn)物DNA片段長度范圍在2～100kb，一般超過10kb，產(chǎn)物適合后續(xù)測序、STR檢測等各種領(lǐng)域。將未獲得良好分型的10份檢材模板用REPLI-g?Single Cell試劑盒純化后擴增，9份檢材在全部基因座上均獲得良好分型，且未出現(xiàn)明顯的優(yōu)勢擴增現(xiàn)象。只有1份從骨頭上刮取的組織，檢材量較少，以肌腱為主，常規(guī)擴增檢驗和用REPLI-g? Single Cell試劑盒純化后擴增，均未獲得任何STR數(shù)據(jù)，考慮未回收到DNA。

牙齒中DNA含量相對較少，加之時間、環(huán)境等因素的影響，牙齒的DNA提取是DNA檢驗的難點，檢材選擇上首選用磨牙，次選尖牙［3-4］。牙齒的DNA提取關(guān)鍵在于徹底清除牙齒表面、牙粉的充分脫鈣和選擇高回收率的DNA提取方法。本研究中的牙齒是一顆較小的尖牙，按常規(guī)擴增檢驗即獲得了較好的STR分型效果，分析原因可能為：（1）用TissueLyserⅡ低頻清潔牙齒表面比人工乙醇溶液清洗和刀片刮更干凈、更方便；（2）TissueLyserⅡ高頻破碎牙齒，破碎程度高且易控制污染；（3）經(jīng)TissueLyserⅡ高頻破碎獲得的牙粉非常細，在經(jīng)過兩次重復(fù)的EDTA脫鈣、ATL和PK裂解、QIAcube抽提過程，將兩次抽提的牙粉DNA模板合并再濃縮，提高了DNA回收率和DNA的模板濃度。

綜上，高度腐敗組織裂解后用Investigator Lyse& Spin Baske試劑盒套管兩次離心，可以極大限度地去除肌腱筋膜等有形物質(zhì)和脂肪組織形成的油脂液層影響，提高模板DNA的純度。降解、低拷貝的DNA模板用REPLI-g?Single Cell試劑盒純化后擴增，可以提高STR分型成功率。對破碎程度高的極細牙粉提取DNA時，可重復(fù)脫鈣、裂解、DNA提取等步驟，合并重復(fù)抽提收集的模板DNA后再濃縮，以提高DNA回收率。

［1］中華人民共和國公安部.人類DNA熒光標(biāo)記STR分型結(jié)果的分析及應(yīng)用：GA/T 1163—2014［S］.北京：中國標(biāo)準出版社，2014.

［2］黃婭琳.高溫烹飪對動物肌肉組織DNA降解的影響［J］.四川動物，2012，31（2）：222-225.

［3］凃政，劉志芳，陳松，等.牙齒的DNA提取及STR分型研究［J］.刑事技術(shù)，2007，（5）：9-11.

［4］駱繼懷，孫紅兵，楊鑫，等.人骨骼及牙齒DNA提取方法的比較和優(yōu)化［J］.中國法醫(yī)學(xué)雜志，2014，29（5）：467-469，476.

（本文編輯：柳燕）

DF795.2

B

10.3969/j.issn.1004-5619.2016.05.014

1004-5619（2016）05-0378-02

汪三存（1976—），男，主檢法醫(yī)師，主要從事法醫(yī)

DNA研究；E-mail：wsc1976@sina.com

（2015-10-13）