趙毓芳　董科

[摘要] 目的 探討益腎化濕顆粒在治療大鼠糖尿病腎病中的ERK表達(dá)及其意義。方法 將40只SD（Sprague-Dawley）大鼠隨機(jī)分為正常對照組（N組）、糖尿病腎病組（DN組）、益腎化濕顆粒治療組（DN+Y組）、貝那普利治療組（DN+B組）。對照組用等量檸檬酸緩沖液腹腔注射，糖尿病腎病組和各治療組制備糖尿病模型，取血檢測血糖（GLU）、血清肌酐（SCr）、血清尿素氮（BUN）、24 h尿蛋白定量，以免疫組化方法檢測各組腎組織p-ERK1/2表達(dá)及其意義。 結(jié)果 治療后8周，DN組大鼠血糖明顯升高，血清肌酐（SCr）、血清尿素氮（BUN）、24h尿蛋白定量等指標(biāo)與N組相比明顯升高，二者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；DN組腎組織內(nèi)p-ERK1/2的表達(dá)與N組相比明顯增高，二者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；其他治療組的血糖、SCr、BUN、24 h尿蛋白定量、p-ERK1/2表達(dá)等指標(biāo)與DN組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。 結(jié)論 在糖尿病腎病的產(chǎn)生、發(fā)展過程中，ERK參與其中，其表達(dá)增加可能對DN的進(jìn)一步發(fā)展造成影響；益腎化濕顆粒能夠?qū)N大鼠腎皮質(zhì)中ERK的活性予以有效限制，從而對DN腎臟起到一定的保護(hù)作用，這說明益腎化濕顆粒在糖尿病腎病的治療中表達(dá)明顯，具有較高的臨床應(yīng)用價值。

[關(guān)鍵詞] 益腎化濕顆粒；糖尿病腎病；細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶

[中圖分類號] R587.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1672-4062（2016）02（b）-0052-04

糖尿病是當(dāng)前在臨床上一種發(fā)生幾率較高的慢性代謝性疾病，影響患者的日常生活，甚至對生命健康直接造成威脅，而糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN） 則是該病諸多并發(fā)癥中最為嚴(yán)重的一種[1]。DH的臨床癥狀集中變現(xiàn)為早期水腫、高血壓，晚期腎功能損害[2]。由于目前糖尿病的發(fā)病率高居不下，且愈演愈烈之勢，針對糖尿病腎臟疾病的臨床研究與診治已經(jīng)刻不容緩，然而當(dāng)前學(xué)界關(guān)于DN的具體發(fā)病機(jī)制依然沒有達(dá)成一致共識。一般認(rèn)為，DN的發(fā)生可能與包括細(xì)胞因子、糖脂異常代謝活動、生長因子等諸多綜合因素的影響作用有關(guān)[3]。近年來的文獻(xiàn)報道顯示，胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）與DN之間存在密切關(guān)聯(lián)；同時學(xué)界也開始嘗試探討益腎化濕顆粒在DN臨床上的療效及其病理表達(dá)[4]。該次實驗通過研究益腎化濕顆粒治療大鼠糖尿病腎病中ERK表達(dá)及意義，取得了一定成效，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 動物 雄性SD大鼠 40 只，6～8周齡，體重（200±20）g。

1.1.2 試劑 p-ERK1/2 （Thr202/Tyr204）多克隆抗體。益腎化濕顆粒，廣州康臣藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號040930，國藥準(zhǔn)字Z20090250，規(guī)格： 10 g/袋×9袋。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制備與分組 40只SD大鼠飼養(yǎng)一周后，隨機(jī)抽取10只為正常對照組（N組），喂養(yǎng)普通飼料；其余30只喂養(yǎng)高糖高脂飼料，30 d后予以腹腔注射50 mg鏈脲佐菌素（STZ）造成糖尿病模型，連續(xù)兩次血糖≥16.7 mmol/L者即為造模成功。30只大鼠分為糖尿病腎病組（DN組）、益腎化濕顆粒治療組（DN+Y組）、貝那普利治療組（DN+B組）各10只。對糖尿病組和各治療組制備糖尿病模型，對照組則用等量檸檬酸緩沖液腹腔注射。成模后各治療組大鼠每天分別用益腎化濕顆粒溶液[150 mg/（kg·d）]、貝那普利水溶液（濃度為0.11%）按10 mg/（kg·d）的劑量進(jìn)行治療性灌胃，對照組和糖尿病腎病組用等量生理鹽水灌胃。所有大鼠實驗期間均食用標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由飲水，不使用胰島素和其他降糖藥物，連續(xù)觀察8周后收集標(biāo)本[5-6]。

1.2.2 標(biāo)本留取 觀察8周后稱體重，留24 h尿，24 h 尿蛋白（mg） = 24 h尿量（mL）×尿蛋白含量（g/L）。經(jīng)乙醚麻醉后，采血，抗凝分離血漿，留待檢測。迅速打開腹腔，游離并摘除雙腎，稱取腎重，左腎去包膜后，切取10 mm3組織塊，放入4%多聚甲醛中固定，4 ℃保存；常規(guī)石蠟包埋，4 μm切片，予以HE染色、PAS染色；切取1 mm3組織塊，放入0.25%戊二醛溶液中，4 ℃保存[7]。

1.2.3 觀察指標(biāo) P-ERK1/2表達(dá)、腎功能指標(biāo)（包括血糖GLU、血清肌酐SCr、血清尿素氮BUN、24 h尿蛋白定量）。

1.3 統(tǒng)計方法

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示計量資料，兩組均數(shù)比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 對血糖（GLU）的影響

治療8周后，DN組大鼠的血糖（22.17±1.03）mmol/L與N組（4.88±0.26）mmol/L相比明顯升高，二者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；各治療組大鼠血糖在數(shù)值上與DN組相比較低，但組組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表 1。

2.2 對SCr、BUN、24 h尿蛋白定量的影響

治療8周后，DN組大鼠的SCr（132.41±7.42）μmol/L、BUN（126.24±3.78）mmol/L、24 h尿蛋白定量（25.57±2.13）mg/24 h與N組相比明顯升高，二者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；各治療組大鼠SCr、BUN、24 h尿蛋白定量與N組相比明顯降低，分組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；DN+Y組與 DN+B組相關(guān)指標(biāo)對比分析，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

2.3 大鼠腎組織p-ERK1/2的免疫組織化學(xué)分析

治療8周后，腎組織中p-ERK1/2陽性表達(dá)部位呈現(xiàn)明顯的棕褐色或棕黃色顆粒，p-ERK1/2在各組大鼠腎小球和腎小管均有明顯表達(dá)，p-ERK1/2 陽性表達(dá)主要位于腎實質(zhì)細(xì)胞胞核及胞漿內(nèi)，與N組相比，DN組4周（41.36±3.13）及8周（46.17±4.26）的pERK1/2 表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01） ，其中8周表達(dá)較4周明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05） 。其他治療組在第4、8周的p-ERK1/2與DN組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表1。

3 討論

糖尿病是當(dāng)前在臨床上一種發(fā)生幾率較高的慢性代謝性疾病，糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN） 則是糖尿病中一種最為嚴(yán)重的并發(fā)癥。當(dāng)前學(xué)界關(guān)于DN的具體發(fā)病機(jī)制依然沒有達(dá)成一致共識，這是由于DN的病因較為復(fù)雜。一般認(rèn)為，DN的發(fā)生是多種因素綜合作用的結(jié)果，包括腎臟血流動力學(xué)的變化、血管活性物質(zhì)、細(xì)胞因子、糖脂異常代謝活動等，在多種因素的影響作用下，腎小球細(xì)胞中的信號轉(zhuǎn)錄通路會隨之產(chǎn)生一定的變化[8-9]。目前學(xué)界已經(jīng)逐漸認(rèn)識到，在DN的發(fā)生與發(fā)展過程中，胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）通路的激活發(fā)揮著重要作用，國外已有學(xué)者證實了在糖尿病腎病腎纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中，ERK1/2 的表達(dá)及其活化參與了整個過程。這說明，ERK在研究DN的發(fā)病機(jī)制方面具有重要的理論價值與參考意義。此外，近年來學(xué)界在DN的臨床診治研究進(jìn)程中逐漸發(fā)現(xiàn)中藥復(fù)方在治療該病癥上所具有的較高價值[10-11]，其中益腎化濕顆粒，經(jīng)相關(guān)文獻(xiàn)報道已經(jīng)證實該藥物治療方式能夠有效緩解DN患者的臨床癥狀，通過對炎癥予以及時抑制，進(jìn)而幫助患者早日康復(fù)。然而，目前學(xué)界對于益腎化濕顆粒在治療大鼠糖尿病腎病中的ERK表達(dá)及其意義相關(guān)問題依然缺乏深入、有效的研究分析。

ERK是細(xì)胞信號中對絲裂原信號進(jìn)行傳遞作用中所需要的關(guān)鍵性激酶，當(dāng)ERK被激活之后，通過轉(zhuǎn)位到胞核的作用，ERK能夠?qū)崿F(xiàn)對于轉(zhuǎn)錄因子活性的有效調(diào)節(jié)，進(jìn)而產(chǎn)生一系列的細(xì)胞效應(yīng)。最新研究成果顯示，ERK將系膜細(xì)胞激活之后，將會直接造成ECM分泌顯著增加、細(xì)胞肥大，進(jìn)而參與DN細(xì)胞的基質(zhì)積聚活動。從中醫(yī)的角度看來，糖尿病腎病的病因在于“腎氣虛衰，消渴日久，氣化失?！?，因此采用中藥復(fù)方的藥物治療方式，能夠?qū)δI組織ERK信號通路起到積極影響作用，通過影響腎臟MCP-1、 TNF-α mRNA水平達(dá)到對早期DN予以有效防止的效果[12]。

該次研究結(jié)果顯示，DN組大鼠血糖（GLU）、血清肌酐（SCr）、血清尿素氮（BUN）、24 h尿蛋白定量等指標(biāo)與N組相比明顯升高，二者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；其他治療組的相關(guān)指標(biāo)與DN組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。這說明，益腎化濕顆粒在治療大鼠糖尿病腎病中具有ERK高表達(dá)，益腎化濕顆粒對于TGF-β1mRNA和PDGF-BmRNA的過度表達(dá)、腎臟肥大、細(xì)胞外基質(zhì)極具等情況可能存在一定的下調(diào)影響，由于P-ERK1/2可能參與了早期DN的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程，因此益腎化濕顆粒可能是通過對ERK的活性予以抑制來實現(xiàn)對于腎臟的保護(hù)作用。

綜上所述，在糖尿病腎病的產(chǎn)生、發(fā)展過程中，ERK參與其中，其表達(dá)增加可能對DN的進(jìn)一步發(fā)展造成影響；益腎化濕顆粒能夠?qū)N大鼠腎皮質(zhì)中ERK的活性予以有效限制，從而對DN腎臟起到一定的保護(hù)作用，這說明益腎化濕顆粒在糖尿病腎病的治療中表達(dá)明顯，具有較高的臨床應(yīng)用價值。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Deng L，Imamoto A，Rosner MR，et al.Raf kinase inhibitory protein （RKIP） ： a physiological regulator and future therapeutic target[J].Expert Opin Ther Targets，2008，12（10）：1275-1287.

[2] Rath O，Park S，Tang HH，et al.The RKIP（Raf-1 Kinase Inhibitor Protein） conserved pocket binds to the phosphorylated N-region of Raf-1 and inhibits the Raf-1-mediated activated phosphorylation of MEK[J].Cell Signal，2008，20（5）：935-941.

[3] 常巨平，祝勝郎，余學(xué)清，等.ERK1/2信號蛋白在糖尿病小鼠腎組織中的表達(dá)[J].中國病理生理雜志，2007，23（9）：1804-1807.

[4] Toblli JE，F(xiàn)errini Mg，CAO G，et al.Anti-fibrotic effects of pioglitazone on the kidney in a rat model of type 2 diabetes mellitus[J].Nephrol Dial Transplant，2009，24（8）：2384-2391.

[5] Wang L，Hu G Y，Shen H，et al.Fluorofenidone inhibits TGF-beta1 induced CTGF via MAPK pathways in mouse mesangial cells[J].Pharmazie，2009，64：680-684.

[6] Esioufis C，Bafakis I，Kasiakogias A，et al.The role of matrix metallo-proteinases in diabetes mellitus[J].Curr ToPMed Chem，2012，12（10）：1159-1165.

[7] 張江華，陳志強(qiáng)，趙雯紅，等.益氣養(yǎng)陰消癥通絡(luò)對高糖聯(lián)合AngⅡ培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細(xì)胞分泌轉(zhuǎn)化生長因子β1和結(jié)締組織生長因子的影響[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2012， 35（3）：174-177.

[8] 付曉.益氣解毒活絡(luò)法對早期糖尿病腎病大鼠TGF-SmadsUPP通路的影響[J].沈陽：遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，2012：33-64.

[9] 張小卿，田國偉，李佳，等.益氣解毒活絡(luò)中藥對早期糖尿病腎病大鼠單核細(xì)胞趨化蛋白-1和腫瘤壞死因子-αmRNA的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志，2012，27（8）：2203-2206.

[10] 沈建明，鄧妍妍，田少江，等.大黃減輕維持性血液透析患者靜脈鐵劑誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和微炎癥反應(yīng)[J].安徽醫(yī)藥，2010，12（2）：1465-1467.

[11] 李娜，孫匯，王拓，等.糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展[J].北華大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2012，2（1）：68-72.

[12] 余姣，周霞，李琪，等.大鼠肝星狀細(xì)胞TGF-β3/TGF-β1mRNA 比值與TGF-β1 ，MMP-9，TIMP-1表達(dá)的關(guān)系[J].中華肝膽外科雜志，2009，15（8）：608.

（收稿日期：2015-11-06）