李燕妮，曹紅光，郭琳，許維娜

（1.濱州醫(yī)學(xué)院葡萄酒學(xué)院，山東煙臺(tái)264003；2.煙臺(tái)東誠(chéng)藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，山東煙臺(tái)264006）

鯊魚軟骨多糖中硫酸角質(zhì)素分離方法研究

李燕妮1，曹紅光2，郭琳1，許維娜1

（1.濱州醫(yī)學(xué)院葡萄酒學(xué)院，山東煙臺(tái)264003；2.煙臺(tái)東誠(chéng)藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，山東煙臺(tái)264006）

探索簡(jiǎn)單有效的分離和檢測(cè)鯊魚軟骨多糖中硫酸角質(zhì)素組分的方法。使用乙醇分級(jí)沉淀法分離多糖中硫酸角質(zhì)素，使用硫酸-咔唑法測(cè)定糖醛酸含量，MonoQHPLC法測(cè)定硫酸角質(zhì)素含量。：硫酸角質(zhì)素從多糖中分離的條件：氯化鈉濃度為2.0％，乙醇濃度小于56％時(shí)；氯化鈉濃度為1.5％，乙醇濃度小于58％時(shí)；氯化鈉濃度為1.0％，乙醇濃度小于60％時(shí)。使用乙醇分級(jí)沉淀法可實(shí)現(xiàn)鯊魚軟骨多糖中硫酸角質(zhì)素組分的分離，MonoQHPLC法可簡(jiǎn)單快速檢測(cè)多糖中硫酸角質(zhì)素組分。

鯊魚軟骨多糖；硫酸角質(zhì)素；MonoQ；分離

軟骨多糖主要包括硫酸軟骨素、硫酸角質(zhì)素等成分［1-2］。鯊魚硫酸軟骨素是目前市售硫酸軟骨素的重要組成部分［3］。硫酸軟骨素（Chondroitin Sulfate，CS）為糖胺聚糖類大分子酸性多糖，由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰半乳糖胺（GlcA-GalNAc）以β-1，3糖苷鍵連接形成二糖，二糖單位之間以β-1，4糖苷鍵連接而形成多聚糖，CS在美國(guó)大量用于骨關(guān)保護(hù)類膳食補(bǔ)充劑［4-5］。

硫酸角質(zhì)素（Keratan Sulfate，KS）是硫酸軟骨素的共生物，也是屬于糖胺聚糖的一種，以半乳糖與6-硫酸-N-乙酰氨基葡萄糖通過β-1，4糖苷鍵組成二糖單位，二糖之間通過β-1，3糖苷鍵連接形成線性分子，是鯊魚軟骨多糖成分中不含糖醛酸的糖胺聚糖［1］。KS是商品硫酸軟骨素中的一種共純化雜質(zhì)，與蛋白質(zhì)等在藥典中有限量要求的雜質(zhì)不同的是，KS是主要的非限制性雜質(zhì)［6］。本文擬探索簡(jiǎn)單有效的分離鯊魚軟骨多糖中的硫酸角質(zhì)素組分的方法。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

鯊魚軟骨：煙臺(tái)大宸食品有限公司；鯊魚硫酸軟骨素標(biāo)準(zhǔn)品、硫酸角質(zhì)素標(biāo)準(zhǔn)品、硫酸軟骨素ABC酶、硫酸角質(zhì)素酶、糖醛酸：購(gòu)于sigma公司；硫酸、咔唑等其它試劑：購(gòu)于上海試劑一廠，均為分析純。Mono Q 5/50GL、Agilent-SAX強(qiáng)陰離子交換色譜柱：購(gòu)于GE公司。

Agilent1260 Infinity液相色譜儀、島津UV2550紫外分光光度計(jì)、梅特勒S20 pH計(jì)。

1.2方法

1.2.1鯊魚軟骨多糖混合物的提取方法

取1 kg鮮新鯊魚頭部軟骨，勻漿后加入6.0 L純化水，調(diào)節(jié)pH 7.5～8.0，加入8.0 g（相當(dāng)于軟骨質(zhì)量的0.8％）木瓜蛋白酶于50℃水解8 h。調(diào)節(jié)pH 6.0，85℃處理10min。將水解液離心去除不溶物后再用微孔濾膜過濾澄清。選用截留分子量10 kDa的超濾膜將料液濃縮到1/6體積。濃縮后的料液中加入4倍體積無水乙醇，離心得到鯊魚軟骨多糖混合物沉淀，烘干。

1.2.2鯊魚軟骨多糖中硫酸角質(zhì)素的分離

將鯊魚軟骨多糖混合物用純化水溶解為含量8％的溶液，分別加入氯化鈉（濃度范圍為1％～2％）和乙醇（終濃度50％～60％）。于4℃靜置8 h后所得多糖沉淀用無水乙醇脫水烘干。

1.2.3Mono QHPLC［7］測(cè)定硫酸角質(zhì)素含量

液相柱：Mono Q 5/50GL；流速：0.5mL/min；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：50μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：215 nm；洗脫：A、10 mmol/L pH 7.4 Tris-HCl洗至基線平衡；B、0～5min 0.5mol/LNaCl-10mmol/L pH 7.4 Tris-HCl；C、5min～ 65 min 0.5mol/L～3mol/LNaCl-10mmol/L pH7.4 Tris-HCl線性洗脫。

1.2.4糖醛酸含量測(cè)定

采用modifed carbazolemethod［8］。以葡萄糖醛酸作為標(biāo)準(zhǔn)品，為了消除中性糖的干擾，先測(cè)定中性糖的吸收度后，從樣品的吸收度值中減去中性糖的吸收度值，即為糖醛酸的吸收度值。

1.2.5硫酸軟骨素含量測(cè)定

酶解液相法［6］，樣品經(jīng)硫酸軟骨素ABC酶充分消化后，用SAX色譜柱分離二糖組分，對(duì)二糖組分峰面積的積分來確定硫酸軟骨素鈉含量。

2　結(jié)果與分析

圖1　M ono Q HPLC法檢測(cè)鯊魚軟骨多糖組分Fig.1 Determ ination of polysaccharose in shark cartilageby M ono Q

2.1Mono QHPLC法檢測(cè)鯊魚軟骨多糖硫酸角質(zhì)素

鯊魚軟骨多糖混合物經(jīng)Mono QHPLC色譜柱分析，結(jié)果顯示存在峰1和峰2（圖1A）。鯊魚軟骨多糖混合物經(jīng)硫酸軟骨素ABC酶處理后，再用Mono Q HPLC分析，結(jié)果顯示峰1消失，而峰2仍存在（圖1B）。硫酸軟骨素ABC酶可以降解硫酸軟骨素而對(duì)硫酸角質(zhì)素?zé)o降解作用，故圖1A中的峰1組分可以確認(rèn)為硫酸軟骨素。鯊魚軟骨多糖混合物經(jīng)硫酸角質(zhì)素酶處理后，再用Mono QHPLC分析，結(jié)果顯示峰2消失，而峰1仍存在（圖1C）。由于硫酸角質(zhì)素酶可以降解硫酸角質(zhì)素而對(duì)硫酸軟骨素?zé)o降解作用，故圖1A中的峰2組分可以確認(rèn)為硫酸角質(zhì)素，使用面積積分法（內(nèi)標(biāo)）計(jì)算含量為20.2％。

2.2硫酸角質(zhì)素的分離

硫酸角質(zhì)素在乙醇與水的混合溶液中溶解度比硫酸軟骨素大，因此在一定濃度乙醇的作用下，可實(shí)現(xiàn)選擇性地將硫酸軟骨素沉淀下來，而硫酸角質(zhì)素留在乙醇水溶液中，加入適量無機(jī)鹽有利于分級(jí)沉淀［9］。由于硫酸軟骨素中含有糖醛酸而硫酸角質(zhì)素不含有糖醛酸，因此檢測(cè)糖醛酸的含量結(jié)合Mono QHPLC法，即可直觀地表示沉淀中硫酸軟骨素與硫酸角質(zhì)素的含量，見表1。

由表1可以看出，KS出現(xiàn)與硫酸軟骨素共同沉淀的現(xiàn)象的條件為：氯化鈉濃度為2.0％，乙醇濃度大于等于56％時(shí)；氯化鈉濃度為1.5％，乙醇濃度大于等于57％時(shí)；氯化鈉濃度為1.0％，乙醇濃度大于等于60％時(shí)。而在低于上述乙醇濃度時(shí)，硫酸角質(zhì)素幾乎全部留在乙醇水溶液中，而沉淀中幾乎全部為硫酸軟骨素。

以氯化鈉濃度為2.0％，乙醇濃度為52％為例，鯊魚軟骨多糖乙醇分級(jí)沉淀后的上清液和沉淀相組分MonoQHPLC分析，見圖2。

表1　乙醇分級(jí)沉淀后鯊魚軟骨素多糖組分含量測(cè)定Table1 Determ ination the contentsof polysaccharides from shark cartilageafter ethanolprecipitation

圖2　M ono Q HPLC法檢測(cè)乙醇沉淀后鯊魚軟骨多糖組分Fig.2 M ono Q determ ination of polysaccharoseof shark cartilagebymeansof sequentialprecipitation w ith ethanol

2.3酶解液相分析

為了進(jìn)一步確定乙醇分級(jí)沉淀分離硫酸角質(zhì)素的有效性，將樣品經(jīng)酶解高效液相方法分析，結(jié)果顯示去除硫酸角質(zhì)素前后鯊魚軟骨多糖中硫酸軟骨素二糖組成沒有明顯的變化，可見去除硫酸角質(zhì)素未影響硫酸軟骨素的結(jié)構(gòu)。氯化鈉濃度為2.0％，乙醇濃度為52％時(shí)沉淀多糖中硫酸軟骨素的含量見表2。

表2　硫酸軟骨素含量測(cè)定Table2 Determ ination the contentof CS ％

由于硫酸軟骨素ABC酶的專一性，不會(huì)降解硫酸角質(zhì)素，所以使用現(xiàn)行藥典中的酶解液相方法檢測(cè)硫酸軟骨素含量，可避免KS的干擾。

從酶解液相的結(jié)果看，鯊魚軟骨多糖混合物中含有大約20％的非硫酸軟骨素成分，這個(gè)結(jié)果與Mono QHPLC分析方法所測(cè)得的硫酸角質(zhì)素含量20.2％相吻合。去除硫酸角質(zhì)素后，鯊魚軟骨多糖中硫酸軟骨素含量顯著提高，接近標(biāo)準(zhǔn)品中硫酸軟骨素的含量。

3　結(jié)論

利用水溶液中硫酸軟骨素和硫酸角質(zhì)素受乙醇和氯化鈉濃度影響的細(xì)微差別，使用乙醇分級(jí)沉淀的方法快速簡(jiǎn)便的分離鯊魚軟骨多糖中的硫酸角質(zhì)素，對(duì)其中的硫酸軟骨素結(jié)構(gòu)沒有產(chǎn)生影響，可得到產(chǎn)品純度高于99％的鯊魚硫酸軟骨素，同時(shí)初步給出Mono Q色譜柱測(cè)定多糖中硫酸皮膚素的含量的實(shí)驗(yàn)條件，此檢測(cè)方法有待進(jìn)一步優(yōu)化。

［1］田志強(qiáng).鯊魚軟骨多糖的分離純化及其抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎作用機(jī)制研究［D］.濟(jì)南：山東大學(xué)，2006：1-124

［2］王延鵬.鯊魚軟骨硫酸角質(zhì)素的制備及其殼聚糖納米粒抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎作用的研究［D］.濟(jì)南：山東大學(xué)，2008：1-83

［3］何兆雄，金艷，張?zhí)烀?硫酸軟骨素的結(jié)構(gòu)及其在骨關(guān)節(jié)炎治療中的應(yīng)用［J］.中國(guó)藥學(xué)雜志，2012，47（5）：387-389

［4］Nicola Volpi.Analytical Aspects of Pharmaceutical Grade Chondroitin Sulfates［J］.Pharmaceutical Sciences，2007，96（12）：3168-3180

［5］Shuhei Yamada，Kazuyuki Sugahara.Potential Therapeutic ApplicationofChondroitin Sulfate/Dermatan Sulfate［J］.CurrentDrug Discovery Technologies，2008（5）：289-301

［6］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典第二部［M］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：1340-1341

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［8］Bitter T，Muir H.A modified uronic acid and carbazole reaction［J］. AnalBiochem，1962，4（4）：330-334

［9］T Nakano，M Betti，Z Pietrasik.Extraction，Iisolation and analysis of chondroitin sulfate glycosaminoglycans［J］.Recent Patents on Food，2010，2（1）：61-74

Study on the Seperation of Keratan Sulfate from Polysaccharose of Shark Cartilage

LI Yan-ni1，CAO Hong-guang2，GUO Lin1，XU Wei-na1
（1.School of Enology，Binzhou Medical University，Yantai 264003，Shandong，China；2.YantaiDongcheng BiochemicalsCo.，Ltd.，Yantai 264006，Shandong，China）

The arm of this researchwas toexplorea simple and effectivemethod for the separation and detection ofkeratan sulfate（KS）in shark cartilage.Themethod to seperate KS from polysaccharidewasethanolprecipitation，the uronic acid contentwasmeasured by sulfuric acid-carbazole，the KScontentwasmeasured byMonoQ HPLC.The precipitation condition was：the salt concentration was2.0％，ethanol concentration was lower than 56％；the saltconcentrationwas1.5％，ethanol concentrationwas lower than 58％；the saltconcentrationwas 1.0％，ethanol concentrationwas lower than 60％.The ethanolprecipitationwasa reliable industrialmethod to seperate KS from polysaccharide，Mono QHPLCmethod wasa simple and effectivemethod to detectKS.

polysaccharoseofsharkcartilage；keratansulfate；MonoQ；seperation

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.18.010

山東省高等學(xué)校科技計(jì)劃（J16LC57）

李燕妮（1980—），女（漢），講師，碩士，研究方向：海洋產(chǎn)物分離提取。

2016-06-29