劉洪林，童華榮*

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.重慶第二師范學院旅游與服務管理系，重慶 400065）

高效液相色譜法同時測定工夫紅茶中10 種內(nèi)含物成分

劉洪林1，2，童華榮1，*

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.重慶第二師范學院旅游與服務管理系，重慶 400065）

建立高效液相色譜法同時測定工夫紅茶中咖啡堿、兒茶素、表兒茶素、表沒食子兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、茶黃素、茶黃素-3-沒食子酸酯、茶黃素-3’-沒食子酸酯、茶黃素雙沒食子酸酯10 種內(nèi)含物成分含量的方法。通過色譜條件優(yōu)化，確定出工夫紅茶中10 種內(nèi)含物成分含量測定的最佳色譜條件為：色譜柱為Whatman Partisphere C18液相色譜柱（4.6 mm×125 mm，5 μm）、柱溫32 ℃、流動相為0.035%三氟乙酸-5%乙腈溶液和0.025%三氟乙酸-50%乙腈溶液、流速1 mL/min、進量量10 μL、檢測波長205 nm。在此條件下，上述10 種內(nèi)含物成分得到很好的分離和測定。各種內(nèi)含物的線性范圍為0.05～500 μg/mL，標準曲線相關(guān)系數(shù)均在0.999 8以上，精密度檢測相對標準偏差為0.72%～3.32%（n=5），重復性檢測相對標準偏差為1.87%～4.43%（n=5），回收率在94.73%～102.38%之間。該方法簡單、快捷、準確、重復性好，可應用于工夫紅茶中10 種內(nèi)含物質(zhì)的同時快速測定。

工夫紅茶；高效液相色譜法；內(nèi)含物；測定

劉洪林， 童華榮. 高效液相色譜法同時測定工夫紅茶中10 種內(nèi)含物成分［J］. 食品科學， 2016， 37（8）: 97-101.

工夫紅茶是一種全發(fā)酵茶類，經(jīng)萎凋、揉捻、發(fā)酵、干燥一系列工藝加工而成［1］。工夫紅茶是我國特有的紅茶品種，富含茶多酚、氨基酸、咖啡堿、兒茶素（catechin，C）、茶黃素（theaflavin，TF1）等多種內(nèi)含營養(yǎng)成分［2］，因此具有抗氧化［3］、抗癌［4］、降血壓［5］、降血糖［6］、降血脂［7］等保健功能而深受人們喜愛。我國的工夫紅茶主要有祁紅工夫［8］、川紅工夫［9］、滇紅工夫［10］、閩紅工夫［11］、湖紅工夫［12］、寧紅工夫［13］、宜紅工夫［14］等，國外主要有印度的大吉嶺紅茶［15］和阿薩姆紅茶［16］、斯里蘭卡的烏沃茶［17］知名。

內(nèi)含物質(zhì)的測定方法常有分光光度法、氣相色譜法、比色法等［18-20］，然而這些方法都存在步驟多、時間長、精密度差、準確度低等的局限性。近年來，高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法因其分離效率高、準確度和精密度好等優(yōu)點被越來越多地用于快速檢測領(lǐng)域。目前，國內(nèi)外采用HPLC法在同一液相色譜條件下對茶葉的研究主要集中在黃酮類物質(zhì)成分［21］，黃烷醇、3-鄰-沒食子?？崴?、沒食子酸以及咖啡堿成分［22］，兒茶素、咖啡堿和沒食子酸成分［23］，草甘膦、氨甲基膦酸及草銨膦成分［24］等方面，而在同一液相條件下測定咖啡堿、C、表兒茶素（epicatechin，EC）、表沒食子兒茶素（epigallocatechin，EGC）、表兒茶素沒食子酸酯（epicatechin gallate，ECG）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、TF1、茶黃素-3-沒食子酸酯（theaflavin-3-gallate，TF2A）、茶黃素-3’-沒食子酸酯（theaflavin-3’-gallate，TF2B）、茶黃素雙沒食子酸酯（theaflavin-3，3’-digallate，TF3）10 種內(nèi)含物質(zhì)成分含量還鮮有研究。因此，本實驗量建立HPLC同時測定工夫紅茶中咖啡堿10 種內(nèi)含物成分的分析方法，并對含量進行測定，以期為茶葉品質(zhì)成分分析提供有益參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

滇紅 云南滇紅集團股份有限公司；川紅 四川宜賓川紅茶葉集團有限公司；祁紅 安徽國潤茶葉有限公司；斯里蘭卡工夫紅茶 斯里蘭卡Mackwoods茶莊。

C、EC、EGC、ECG、EGCG、咖啡堿、TF1、TF2A、TF2B、TF3標準品、乙腈、甲醇、三氟乙酸（均為色譜純） 美國Sigma公司；乙酸乙酯、正丁醇、碳酸氫鈉、草酸（均為分析純） 重慶博藝化學試劑有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

HH-8型數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市富華儀器有限公司；C18高效液相色譜儀 美國Agilent公司；Partisphere C18液相色譜柱（4.6 mm×125 mm，5 μm） 美國Whatman公司；DFT-200型200 g手提式粉碎機 溫嶺市林大機械有限公司；FA2004A型分析天平 海津天電子儀器有限公司；Mili-Q超純水儀 美國密理博公司；Centrifuge5810高速離心機 德國Eppendorf公司。

1.3方法

1.3.1色譜條件

Whatman Partisphere C18色譜柱（4.6 mm×125 mm，5 μm）；檢測器：二極管陣列檢測，器柱溫32℃，流動相A相為0.035%三氟乙酸-5%乙腈（V/V）溶液、B相為0.025%三氟乙酸-50%乙腈（V/V）溶液，梯度洗脫，30 min內(nèi)完成，梯度洗脫程序見表1，流速1 mL/min，進量量為10 μL，檢測波長為205 nm。

表1　HPLC洗脫梯度Table 1 Elution gradient program for HPLC separation

1.3.2量品處理

準確稱取每個茶量0.5 g，分別粉碎后轉(zhuǎn)入100 mL棕色錐形瓶中，加入50 mL沸超純水，于90 ℃水浴鍋中恒溫水浴30 min，期間順時針搖動30 s，使內(nèi)含物質(zhì)充分浸出。冷卻后將上清液充分過濾到100 mL棕色離心管中，加入2 mL體積分數(shù)20%乙腈溶液，在15 000×g條件下離心2 min。待測液用0.22 μm濾膜過濾，將濾液置于2 mL的棕色進量瓶中待色譜測定。

1.3.3標準曲線繪制

分別精密稱取C、EC、EGC、ECG、EGCG、咖啡堿、TF1、TF2A、TF2B、TF3標準品各20 mg，用乙醇溶解并定容至10 mL棕色容量瓶中，搖勻，得2 mg/mL的混合內(nèi)含物質(zhì)標準母液。分別吸取各標準混合母液，用乙醇稀釋至500、50、5、0.5、0.05 μg/mL系列混合標準溶液。將系列混合標準溶液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾至2 mL進量瓶中，進量，以質(zhì)量濃度（X）對峰面積（Y），求回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.3.4量品測定

將處理后的量品提取液進行HPLC分析，進量量為10 μL。

1.4數(shù)據(jù)處理

各實驗至少重復3 次以上，使用DPS7.05、Excel等軟件進行圖表的繪制和相關(guān)數(shù)據(jù)的處理。

2　結(jié)果與分析

2.1色譜條件的優(yōu)化

2.1.1流動相的選擇

設(shè)置流動相A相中酸體積分數(shù)0.035%、B相中酸體積分數(shù)0.025%，流速1 mL/min，柱溫32 ℃，流動相以乙腈-水（A相0∶100、2∶98、5∶95、8∶92、10∶90，V/V）溶液；B相（40∶60、45∶55、50∶50、55∶45、60∶40，V/V）不同比例相互搭配測定10 種內(nèi)含物混合標準品和工夫紅茶茶量提取液中各內(nèi)含物成分含量和分離情況。結(jié)果表明兩流動相中水的比例升高可以加快分離過程，但也會造成TF1、TF2A、TF2B、TF3色譜峰的相互重疊；而隨著乙腈所占體積比例增加，內(nèi)含物質(zhì)分離程度提高，當乙腈-水體積比例A相為10∶90，B相為60∶40時，分離時間最佳，但保留時間太長。當流動相中乙腈-水體積比例A相為5∶95，B相為50∶50時分離效果也很好，相鄰峰的分離度很好，且保留時間較短，10 種內(nèi)含物30 min內(nèi)出峰完畢。因此，在兼顧分離速度和分離效果的基礎(chǔ)上，本實驗采用流動相為乙腈-水體積比例為A相5∶95，B相50∶50。

2.1.2流動相酸體積分數(shù)選擇

參照Lee等［25］方法，本實驗選擇三氟乙酸調(diào)節(jié)酸體積分數(shù)。設(shè)置流速1 mL/min，柱溫32 ℃，以流動相A相體積分數(shù)5%乙腈溶液、B相體積分數(shù)50%乙腈溶液為流動相，用三氟乙酸調(diào)節(jié)酸體積分數(shù)，考察不同酸體積分數(shù)（A相0.030%、0.032%、0.035%、0.038%、0.040%；B相0.020%、0.022%、0.025%、0.028%、0.030%）10 種內(nèi)含物質(zhì)分離情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，流動相A相和B相三氟乙酸體積分數(shù)相互搭配，三氟乙酸體積分數(shù)越低，10 種內(nèi)含物質(zhì)出峰時間縮短，但分離效果越差，出現(xiàn)多峰重疊現(xiàn)象；隨著三氟乙酸體積分數(shù)升高，分離效果越好，然而出峰時間較長，且三氟乙酸體積分數(shù)過高易對色譜柱造成影響。綜合考慮，當三氟乙酸體積分數(shù)流動相A 0.035%、B相0.025%時，分離效果好，且出峰時間適中，達到定量要求。該實驗結(jié)果與Lee等［25］電泳法-HPLC法測定茶葉中內(nèi)含物質(zhì)最佳優(yōu)化條件吻合。

2.1.3流速的選擇

設(shè)置柱溫32 ℃，以流動相A相為0.035%三氟乙酸-5%乙腈溶液、B相為含0.025%三氟乙酸-50%乙腈溶液為流動相，考察流速分別為0.8、0.9、1.0、1.1、1.2 mL/min時的分離情況，結(jié)果得知，流速越低，分析時間越長，分離結(jié)果影響不顯著；隨著流速升高，分析時間縮短，但分離程度逐漸變差，咖啡堿與C，TF1與TF2A、TF2B、TF3出現(xiàn)峰重疊現(xiàn)象，柱壓升高。綜合考慮分析時間、效果和柱壓因素，最終確定1 mL/min的流速進行實驗，此時分離結(jié)果最佳。

2.1.4柱溫的選擇

以流動相A相為0.035%三氟乙酸-5%乙腈溶液、B相為0.025%三氟乙酸-50%乙腈溶液為流動相，1 mL/min為流速不變，在20、24、28、32、36 ℃ 5 個柱溫條件下分別進行測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，柱溫對工夫紅茶10 種內(nèi)含物分離結(jié)果影響較大，隨著溫度升高，隨著柱溫升高，各內(nèi)含物出峰時間均提前，分離程度也越來越高，但到達36 ℃時，C、咖啡堿2 種物質(zhì)的出峰面積增大。因此綜合考慮，選擇柱溫32 ℃，分離效果最好。

2.2線性范圍

將質(zhì)量濃度在0.05～500 μg/mL范圍內(nèi)的一系列混標溶液進行HPLC分析，對測得各值進行相關(guān)系數(shù)分析和線性回歸分析，結(jié)果見表2。圖1為標量HPLC圖。

表2　10 種內(nèi)含物測定的線性相關(guān)性Table 2 Linear equations for determination of 10 of components

圖1　混標溶液HPLC圖Fig.1 HPLC chromatogram of mixed standards

由表1可知，除了C和EC的相關(guān)系數(shù)為0.999 8外，其他8 種內(nèi)含物質(zhì)的相關(guān)系數(shù)均為0.999 9，說明10 種內(nèi)含物質(zhì)組分的峰面積和組分質(zhì)量濃度的線性相關(guān)性好，以此條件可以很好地測定10 種內(nèi)含物的含量。

2.3精密度考察

將5 μg/mL的混標連續(xù)進量5 次，根據(jù)所得峰面積分別計算精密度，結(jié)果見表3。

表3　方法的精密度實驗結(jié)果（n=5）Table 3 Results of precision experiments （n= 5）

由表3可知，10 種內(nèi)含物質(zhì)C、EC、EGC、ECG、EGCG、咖啡堿、TF1、TF2A、TF2B、TF3的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）范圍在0.72%～3.32%之間，均小于5%，表明該方法精密度良好。

2.4重復性考察

精密稱取同一工夫紅茶量品5 份（川紅），按1.3.2節(jié)方法制備供試品提取溶液，按上述色譜條件進量10 μL，結(jié)果見表4。

表4　方法的重復性實驗結(jié)果（n=5）Table 4 Results of repeatability experiments （n= 5）

由表4可知，測得咖啡堿、C、EC、EGC、ECG、EGCG、TF1、TF2A、TF2B、TF3的平均含量為21.75、2.52、2.23、5.84、4.46、2.81、0.86、0.73、2.07、0.10 mg/g，RSD分別為3.78%、3.01%、3.77%、1.87%、3.81%、3.26%、4.43%、3.17%、4.39%、3.10%，均在5%以內(nèi)，表明該方法的重復性均達到分析的要求。

2.5回收率考察

精確稱取磨碎的工夫紅茶茶量1 g，按1.3.2節(jié)方法制備量品提取液，準備同一量品提取液6 份（咖啡堿、C、EC、EGC、ECG、EGCG、TF1、TF2A、TF2B、TF3的質(zhì)量濃度分別為0.435 0、0.050 5、0.044 6、0.116 9、0.089 2、0.056 3、0.017 2、0.014 5、0.041 4、0.002 1 mg/mL），將不同質(zhì)量濃度的各種內(nèi)含物質(zhì)標量加入至每份提取液中，充分混勻后，使10 種內(nèi)含物添加的質(zhì)量濃度分別為0.500、0.100、0.100、0.200、0.200、0.100、0.050、0.050、0.050、0.005 mg/mL，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后進量檢測，平行測定6 次，根據(jù)加入的標準量品質(zhì)量濃度和檢出的質(zhì)量濃度計算回收率，結(jié)果見表5。

由表5可知，10 種工夫紅茶內(nèi)含物組分的回收率為94.73%～102.38%，各種內(nèi)含物RSD為0.98%～3.58%，均符合分析方法的要求。

表5　10 種內(nèi)含物質(zhì)測定的回收率實驗（n=6）Table 5 Recovery rates of 10 components in spiked samples （n= 6）

2.6工夫紅茶量品測定結(jié)果

按照1.3.2節(jié)方法制備量品提取液，依優(yōu)化的色譜條件下進行分析，測定滇紅、川紅、祁紅和斯里蘭卡紅茶（HYSON）10 種內(nèi)含物成分含量，結(jié)果見表6，量品色譜圖見圖2。

表6　工夫紅茶中10 種內(nèi)含物質(zhì)組分含量（n=6）Table 6 Contents of 10 components in Congou black tea （n= 6）mg/g

圖2　工夫紅茶樣品色譜圖Fig.2 Chromatogram of Congou tea sample

由表6可知，各種工夫紅茶組分中咖啡堿含量是所有組分中最高，TF3含量最低。斯里蘭卡紅茶中各組分含量在所有茶類中均最高，咖啡堿、C、EC、EGC、ECG、EGCG、TF1、TF2A、TF2B、TF3含量依次為23.61、4.18、2.58、13.83、9.01、5.78、2.40、2.11、5.20、0.16 mg/g。其余3 個紅茶品種中，咖啡堿、EC、EGC、TF2B含量：川紅＞滇紅＞祁紅；C含量：滇紅＞川紅＞祁紅；ECG、TF1、TF2A含量：祁紅＞川紅＞滇紅；EGCG、TF3含量：川紅＞祁紅＞滇紅，其中滇紅的TF3未檢測出。這一結(jié)果表明，在本實驗建立的HPLC方法下，能準確檢測出工夫紅茶的10 種內(nèi)含物。且本實驗建立的HPLC方法具有能同時測定工夫紅茶量品中10 種內(nèi)含物、測定時間短等優(yōu)點，是一種能夠運用于茶葉中內(nèi)含物質(zhì)測定的快速檢測方法。

3　結(jié) 論

本實驗建立了一種快速、簡便、準確、重復性好等優(yōu)點的測定工夫紅茶中咖啡堿、C、EC、EGC、ECG、EGCG、TF1、TF2A、TF2B、TF3 10 種內(nèi)含物成分的方法——HPLC法。利用Whatman Partisphere C18液相色譜柱（4.6 mm×125 mm，5 μm），通過色譜條件的優(yōu)化，流動相A相為0.035%三氟乙酸-5%乙腈溶液、B相為0.025%三氟乙酸-50%乙腈溶液，流速1 mL/min，柱溫32 ℃，檢測波長為205 nm，并經(jīng)過精密度、重復性、回收率等方法的考察，在30 min內(nèi)成功分離和定量分析了工夫紅茶中10 種內(nèi)含物成分。應用此方法成功測定出了滇紅、川紅、祁紅和斯里蘭卡工夫紅茶品種中10 種內(nèi)含物成分含量，為茶葉內(nèi)含物成分分析提供有益參考。

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Determination of Ten Components in Congou Black Tea by HPLC

LIU Honglin1，2， TONG Huarong1，*
（1. College of Food Science， Southwest University， Chongqing 400715， China；2. Department of Tourism and Service Management， Chongqing University of Education， Chongqing 400065， China）

A high performance liquid chromatographic （HPLC） method was established for the simultaneous determination of ten components including caffeine， catechin （C）， epicatechin （EC）， epigallocatechin （EGC）， epicatechin gallate （ECG），epigallocatechin gallate （EGCG）， theaflavin （TF1）， theaflavin-3-gallate （TF2A）， theaflavin-3’-gallate （TF2B）， theaflavin-3，3’-digallate （TF3）， in Congou black tea. The chromatographic conditions were optimized. A Whatman Partisphere C18column （4.6 mm × 125 mm， 5 μm） was used to separate the ten compounds. The mobile phase was a mixture of 0.035% trifluoroacetic acid containing 5% acetonitrile （A） and 50% acetonitrile solution containing 0.025% trifluoroacetic acid and methanol solution （B） at a flow rate of 1 mL/min. The column temperature and UV detection wavelength were set as 32 ℃and 205 nm， respectively. The ten components were successfully separated and detected under the chosen experimental conditions. The calibration curves for all these components displayed a good linear relationship with correlation coefficients above 0.999 8 and precision relative standard deviations （RSDs） of 0.72%-3.32% （n = 5） and repeatability RSD of 1.87%-4.43% （n = 5）. The recovery rates of the ten compounds were in the range of 94.73%-102.38%. The method is convenient，rapid， accurate， reproducible and applicable to simultaneously determine these ten components in Congou black tea.

Congou black tea； high performance liquid chromatographic （HPLC）； components； determination

10.7506/spkx1002-6630-201608017

TS207.3

A

1002-6630（2016）08-0097-05

10.7506/spkx1002-6630-201608017. http://www.spkx.net.cn LIU Honglin， TONG Huarong. Determination of ten components in Congou black tea by HPLC［J］. Food Science， 2016，37（8）: 97-101. （in Chinese with English abstract）

10.7506/spkx1002-6630-201608017. http://www.spkx.net.cn

2015-09-01

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAF07B05-4）

劉洪林（1991—），男，助教，碩士，研究方向為茶學。E-mail：475844900@qq.com

童華榮（1963—），男，教授，博士，研究方向為茶學。E-mail：491214217@qq.com

引文格式：