葛素囡，張生翾，王 芳，*，魏 歡，謝文磊，謝 建，李 馳，趙 胡*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；2.阜陽師范學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽 阜陽 236037）

外源物質(zhì)對新疆紫草毛狀根次生代謝產(chǎn)物含量的影響

葛素囡1，張生翾1，王 芳1，*，魏 歡1，謝文磊1，謝 建1，李 馳1，趙 胡2，*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；2.阜陽師范學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽 阜陽 236037）

目的：探討不同外源物質(zhì)對新疆紫草毛狀根中次生代謝產(chǎn)物含量的影響。方法：采用分光光度法測定AgNO3、L-苯丙氨酸、乙酸鈉影響下新疆紫草毛狀根提取物中次生代謝產(chǎn)物的含量。結(jié)果：AgNO3質(zhì)量濃度為5 mg/L時，毛狀根中紫草素、總多酚及總黃酮的含量分別較對照提高了5、0.3 倍和0.8 倍，而花青素的含量在AgNO3質(zhì)量濃度為3 mg/L時達峰值，較對照提高了0.4 倍。在AgNO3質(zhì)量濃度為5 mg/L前提下，L-苯丙氨酸質(zhì)量濃度為25 mg/L時，紫草素、花青素及總黃酮的含量均達峰值，分別較對照提高了0.3、1.4 倍和1.2 倍。而總多酚含量雖然并未高于對照組，但是在各個處理中仍然含量最高。在AgNO3、L-苯丙氨酸質(zhì)量濃度分別為5、25 mg/L時，總多酚和紫草素含量均在乙酸鈉質(zhì)量濃度為50 mg/L時達到最高，花青素的含量在乙酸鈉質(zhì)量濃度為200 mg/L時達到最高，而乙酸鈉不同處理的毛狀根中總黃酮含量均明顯低于對照。結(jié)論：外施一定質(zhì)量濃度的誘導(dǎo)子AgNO3及AgNO3和L-苯丙氨酸的聯(lián)合作用均能促進新疆紫草毛狀根次生代謝產(chǎn)物的積累；外施一定質(zhì)量濃度的AgNO3、L-苯丙氨酸及乙酸鈉可協(xié)同促進毛狀根中總多酚、花青素和紫草素的積累，但顯著抑制總黃酮的合成積累。

新疆紫草；毛狀根；次生代謝產(chǎn)物；誘導(dǎo)子；前體物質(zhì)

毛狀根培養(yǎng)是獲得有用次生代謝產(chǎn)物的重要途徑之一。近年來，培養(yǎng)珍貴藥用植物毛狀根以獲取次生代謝產(chǎn)物已成為研究熱點。楊世海［1］、何含杰［2］、談榮慧［3］等分別培養(yǎng)決明的蒽醌類化合物、三裂葉野葛的總異黃酮和葛根素、丹參的丹酚酸等均獲成功。但利用毛狀根生產(chǎn)藥物依然存在次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量低、生產(chǎn)成本高的問題，因此，深入研究植物細胞中次生代謝產(chǎn)物合成的高產(chǎn)調(diào)控機理具有重要的理論和實際意義。

誘導(dǎo)子被認為是提高植物細胞和組織培養(yǎng)中次生代謝產(chǎn)物最有效的途徑之一。茉莉酸可促進長春花毛狀根中吲哚生物堿的生物合成［4］。真菌誘導(dǎo)子可提高黃芩毛狀根中黃芩苷的含量［5］，也可影響人參毛狀根中人參皂苷的生物合成［6］。同時，隨著植物次生代謝產(chǎn)物合成途徑的深入研究，添加前體物質(zhì)也成為提高目的產(chǎn)物的有效手段。苯丙氨酸是一個代謝中間體，它是合成類黃酮、苯丙素類、香豆素類、木質(zhì)素類、萘醌類等多種次生代謝物質(zhì)的前體［7］。Fettneto等［8］在紅豆杉細胞培養(yǎng)中加入前體物質(zhì)苯丙氨酸能使紫杉醇含量提高5 倍。乙酸鈉是黃酮類化合物合成的前體物質(zhì)之一，1 mmol/L乙酸鈉能夠促進紅豆杉細胞中紫杉烷的合成［9］。培養(yǎng)基中添加硝酸銀和酵母提取物對不定根中雷公藤甲素的合成具有明顯的促進作用［10］。表明多個誘導(dǎo)子或誘導(dǎo)子與前體物質(zhì)共同作用，可大大提高毛狀根次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。

新疆紫草毛狀根中添加真菌誘導(dǎo)子［11］、茉莉酸甲酯［12］、乙烯［13-14］及Ag+［15］均可促進紫草素及其衍生物的合成，L-苯丙氨酸對紫草細胞中紫草素的積累也有明顯促進作用［16］，但未見誘導(dǎo)子及前體物質(zhì)的聯(lián)合作用對新疆紫草毛狀根次生代謝產(chǎn)物含量影響的研究報道。本研究探討AgNO3、L-苯丙氨酸及乙酸鈉協(xié)同作用對新疆紫草毛狀根次生代謝產(chǎn)物含量的影響，為深入研究紫草素合成的代謝調(diào)控以及相關(guān)分子機制及運用細胞工程技術(shù)大量生產(chǎn)紫草素及其衍生物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新疆紫草毛狀根為1號根系［17］，由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院王芳課題組提供。

蘆丁標準品 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇 新疆烏市化學(xué)試劑廠；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、磷酸氫二鈉、硝酸銀、L-苯丙氨酸、乙酸鈉（均為分析純） 北京化工廠。

1.2 儀器與設(shè)備

循環(huán)水式真空泵、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；721型紫外分光光度計 上海隆拓儀器設(shè)備有限公司；恒溫水浴鍋 南京科爾儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 毛狀根的生長

稱取0.5 g生長狀況良好的毛狀根接種于裝有50 mL SH培養(yǎng)基［18］的250 mL錐形瓶中，溫度25 ℃、轉(zhuǎn)速（100±10） r/min條件下暗培養(yǎng)30 d后，待用。

1.3.2 AgNO3處理新疆紫草毛狀根

稱取來自SH培養(yǎng)基中培養(yǎng)的毛狀根5 g，接于M9培養(yǎng)基［18］中，附加AgNO30、1、3、5、7 mg/L，培養(yǎng)30 d后，進行成分測定。

1.3.3 AgNO3及L-苯丙氨酸聯(lián)合處理新疆紫草毛狀根

在1.3.2節(jié)最佳條件（5 mg/L Ag+）基礎(chǔ)上，將毛狀根接于M9培養(yǎng)基附加L-苯丙氨酸0、25、50、75、100 mg/L的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)30 d后進行成分測定。

1.3.4 AgNO3、L-苯丙氨酸及乙酸鈉聯(lián)合處理新疆紫草毛狀根

在1.3.3節(jié)最佳條件（5 mg/L Ag++25 mg/L L-苯丙氨酸）基礎(chǔ)上，將毛狀根接于M9培養(yǎng)基附加乙酸鈉0、25、50、75、100 mg/L的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)30d后進行成分測定。

1.3.5 總黃酮的提取及含量測定

1.3.5.1 蘆丁標準對照品溶液的制備及其標準曲線回歸方程的建立

參照張桂等［19］方法。以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標，波長為510 nm的吸光度（A）為縱坐標，繪制標準曲線，并計算回歸方程。蘆丁質(zhì)量濃度與吸光度的回歸方程式為y=11.227 0x+0.005 8（R2=0.995 6）。結(jié)果表明，蘆丁質(zhì)量濃度在0～0.05 mg/mL范圍內(nèi)，與吸光度成良好的線性關(guān)系。

1.3.5.2 供試品提取溶液的制備及樣品含量測定

參照楊春霞等［20］的方法。在波長510 nm處，以空白溶液校正基線，測定供試液的吸光度，代入回歸方程，計算樣品溶液中總黃酮的含量。

1.3.6 花青素的提取及相對含量的測定

參照Weiss等［21］的方法。以A校表示樣品中花青素的相對含量/（mg/g），樣品質(zhì)量為干質(zhì)量。

1.3.7 總多酚的提取及含量測定

總多酚的提取采用水浴提取法?？偠喾雍繙y定采用酒石酸亞鐵分光光度法，在540 nm波長處測定吸光度（A）。

式中：A為樣液的吸光度；V總為供試液總量/mL；V為吸取的供試液體積/mL；m為樣品干質(zhì)量/g；7.826為吸光度為1.00時的茶多酚含量的經(jīng)驗值/（mg/mL）。

1.3.8 紫草素的提取及含量測定

采用中國藥典中記載的測定羥基萘醌總色素的方法測定紫草素含量［18］。具體方法：取培養(yǎng)一定時間的愈傷組織適量，于50 ℃烘箱中干燥3 h，粉碎，精密稱取0.5 g，置100 mL容量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，4 h內(nèi)不斷振搖，過濾，精密吸取濾液5 mL于25 mL容量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻。采用分光光度法在516 nm波長處測定吸光度，按左旋紫草素（C16H16O5）的吸收系數(shù)為242計算。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每份樣品各重復(fù)3 次提取測定。采用Microsoft Excel和SPSS 16.0統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 AgNO3對毛狀根次生代謝產(chǎn)物含量的影響

將毛狀根接種于M9培養(yǎng)基中，圖1、2結(jié)果顯示，毛狀根中次生代謝產(chǎn)物的含量均隨AgNO3質(zhì)量濃度的增加呈先升后降趨勢，其中紫草素、總多酚及總黃酮的含量均在AgNO3質(zhì)量濃度為5 mg/L時達峰值，分別較對照提高了5、0.3 倍和0.8 倍，而花青素的含量在AgNO3質(zhì)量濃度為3 mg/L時達峰值，較對照提高了0.4倍。當AgNO3質(zhì)量濃度過高時，毛狀根中紫草素、總多酚、總黃酮及花青素的含量均大幅降低，表明AgNO3對毛狀根次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)出有一定的影響，其中AgNO3質(zhì)量濃度為5 mg/L時呈現(xiàn)較高的促進作用。

2.2 AgNO3及L-苯丙氨酸聯(lián)合作用對毛狀根次生代謝產(chǎn)物含量的影響

在2.1節(jié)實驗結(jié)果基礎(chǔ)上，考察L-苯丙氨酸對毛狀根次生代謝產(chǎn)物含量的影響，圖3、4結(jié)果表明，毛狀根次生代謝產(chǎn)物的含量均隨L-苯丙氨酸質(zhì)量濃度的增加呈先升高后降低趨勢，當L-苯丙氨酸質(zhì)量濃度為25 mg/L時，紫草素、花青素及總黃酮的含量均達峰值，均顯著高于對照（P＜0.05），分別較對照提高了0.3、1.4 倍和1.2 倍。而總多酚含量雖然并未高于對照組，但是在各個處理中仍然含量最高。說明在AgNO3質(zhì)量濃度為5 mg/L前提下，L-苯丙氨酸為25 mg/L時，對毛狀根次生代謝產(chǎn)物的積累有明顯促進作用，高質(zhì)量濃度起抑制作用。說明添加一定量的AgNO3及L-苯丙氨酸可協(xié)同促進毛狀根中次生代謝產(chǎn)物的積累。

2.3 AgNO3、L-苯丙氨酸及乙酸鈉聯(lián)合作用對毛狀根次生代謝產(chǎn)物含量的影響

在2.2節(jié)實驗結(jié)果基礎(chǔ)上，考察乙酸鈉對毛狀根次生代謝產(chǎn)物含量的影響，圖5、6結(jié)果表明，在乙酸鈉不同質(zhì)量濃度處理下，毛狀根中總多酚和花青素的含量均高于對照組，其中總多酚含量隨著乙酸鈉質(zhì)量濃度增高而增大，在乙酸鈉質(zhì)量濃度為50 mg/L時達到最高；花青素的含量在乙酸鈉質(zhì)量濃度為200 mg/L時達到最高，且各個質(zhì)量濃度處理間存在顯著差異（P＜0.01）。當乙酸鈉質(zhì)量濃度為50 mg/L時紫草素含量較對照提高1 倍（P＜0.05）。乙酸鈉不同處理的毛狀根中總黃酮含量均明顯低于對照（P＜0.01），說明乙酸鈉抑制毛狀根中總黃酮的積累。綜上所述，同時添加一定量的AgNO3、L-苯丙氨酸及乙酸鈉可協(xié)同促進新疆紫草毛狀根中總多酚、花青素和紫草素的積累，但顯著抑制總黃酮的合成積累。

3 討 論

由于紫草素及其衍生物的合成呈非偶聯(lián)型，即紫草素及其衍生物在毛狀根生長停止后才進行合成的，故新疆紫草毛狀根的培養(yǎng)采用二階段培養(yǎng)法：第一階段為生長階段，主要目的是為了提高或增加毛狀根的生物學(xué)產(chǎn)量，其適宜的培養(yǎng)基為SH［18］，第二階段為生產(chǎn)階段，主要目的是為了促進毛狀根積累紫草素及其衍生物，其適宜的培養(yǎng)基為M9［18］。本研究著重考察了第二階段即毛狀根生產(chǎn)階段，AgNO3、L-苯丙氨酸、乙酸鈉影響下新疆紫草毛狀根提取物中次生代謝產(chǎn)物的含量。

許多研究表明真菌菌絲體等或其他金屬離子等誘導(dǎo)劑可促進植物毛狀根合成和積累次生代謝物［22-24］。尹雅樂等［25］研究發(fā)現(xiàn)5 μmol/L Ag+處理能夠顯著促進紫草素的合成。本研究結(jié)果表明，5 mg/L的Ag+使得新疆紫草毛狀根的紫草素及其衍生物含量提高了5 倍，結(jié)果與前人一致。

前人研究發(fā)現(xiàn)，L-苯丙氨酸可促進葡萄細胞中花青素的積累［26］，苯丙氨酸前體與茉莉酸甲酯的聯(lián)合作用也可顯著提高葡萄細胞中花青素含量［27］。本研究結(jié)果表明，添加一定量的AgNO3及L-苯丙氨酸可協(xié)同促進毛狀根中紫草素及其衍生物、總黃酮及花青素含量的提高，進一步闡明了誘導(dǎo)子與前體物質(zhì)的聯(lián)合作用的效應(yīng)。

研究表明乙酸鈉作為黃酮類化合物合成的前體物質(zhì)之一可促進甘草細胞中總黃酮的合成積累［28］，但也有研究認為L-苯丙氨酸和乙酸鈉共同使用對銀杏細胞中黃酮的合成無明顯促進作用［29］。本研究中，當AgNO3質(zhì)量濃度為0 mg/L時，總黃酮含量為0.2 mg/g，當AgNO3質(zhì)量濃度為5 mg/L時，總黃酮含量為0.329 mg/g，當5 mg/L AgNO3+25 mg/L L-苯丙氨酸時，總黃酮含量為0.731 mg/g，由此可見，單獨添加5 mg/L AgNO3及AgNO3與L-苯丙氨酸共同作用均有利于總黃酮的積累。但是，同時添加一定量的AgNO3、L-苯丙氨酸及乙酸鈉卻顯著抑制總黃酮的合成積累，是否與本實驗選用乙酸鈉質(zhì)量濃度過高有關(guān)，有待進一步研究。

本研究明確了一定質(zhì)量濃度的誘導(dǎo)子AgNO3及AgNO3和前體物質(zhì)L-苯丙氨酸的聯(lián)合作用均能夠促進新疆紫草毛狀根次生代謝產(chǎn)物的積累；添加一定質(zhì)量濃度的AgNO3、L-苯丙氨酸及乙酸鈉可協(xié)同促進毛狀根中總多酚、花青素和紫草素的積累。本結(jié)果為進一步深入研究誘導(dǎo)子及前體物質(zhì)對新疆紫草毛狀根有效成分及次生代謝物的影響以及相關(guān)分子機制提供了理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)，對工廠化生產(chǎn)新疆紫草毛狀根有價值的藥用成分具有重要意義。

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Effects of Exogenous Substances on the Content of Secondary Metabolites in Arnebia euchroma Johnst Hairy Roots

GE Sunan1， ZHANG Shengxuan1， WANG Fang1，*， WEI Huan1， XIE Wenlei1， XIE Jian1， LI Chi1， ZHAO Hu2，*
（1. College of Agronomy， Xinjiang Agricultural University， ürümqi 830052， China；2. School of Biotechnology and Food Engineering， Fuyang Normal College， Fuyang 236037， China）

Objective： To investigate the effects of different exogenous substances on the content of secondary metabolites in Arnebia euchroma Johnst hairy roots and consequently provide a theoretical basis for further development and utilization of Arnebia euchroma Johnst hairy roots. Methods： The contents of secondary metabolites were measured by spectrophotometry from Arnebia euchroma Johnst hairy roots cultured in the presence of AgNO3alone and in combination with L-phenylalanine or L-phenylalanine plus sodium acetate. Results： The contents of shikonin， total polyphenols and total flavonoids in hairy roots cultured for 30 days at an AgNO3concentration of 5 mg/L respectively increased by 6， 1.3， 1.8 times compared with the control （CK）. In addition， when AgNO3concentration was 3 mg/L， the anthocyanin content reached its peak， a 1.4-fold increase over the control. Peak contents of shikonin， anthocyanins and total flavonoids were observed after culture in the presence of both 25 mg/L L-phenylalanine and 5 mg/L AgNO3， which were increased by 1.3， 2.4 and 2.2 times， respectively，compared with the CK. The content of total polyphenols was not higher than that in the CK， but it was still the highest among three treatment groups. The contents of shikonin and total polyphenols reached their highest levels at 50 mg/L among different sodium acetate concentrations combined with 5 mg/L AgNO3and 25 mg/L L-phenylalanine， whereas the highest content of anthocyanin was observed when the sodium acetate concentration was 200 mg/L. The content of total flavonoids in hairy roots with sodium acetate treatments at various concentrations was significantly lower than that of the control. Conclusion：The addition of AgNO3and L-phenylalanine can cooperatively promote the accumulation of secondary metabolites in Arnebia euchroma Johnst hairy roots. Meanwhile， AgNO3， L-phenylalanine and sodium acetate can cooperatively promote the accumulation of shikonin， polyphenol and anthocyanin， but significantly inhibit the accumulation of total flavonoids.

Arnebia euchroma （Royle） Johnst； hairy roots； secondary metabolites； elicitor； precursor

10.7506/spkx1002-6630-201609030

Q943.1

A

1002-6630（2016）09-0160-05

葛素囡， 張生翾， 王芳， 等. 外源物質(zhì)對新疆紫草毛狀根次生代謝產(chǎn)物含量的影響［J］. 食品科學(xué)， 2016， 37（9）： 160-164. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201609030. http：//www.spkx.net.cn

GE Sunan， ZHANG Shengxuan， WANG Fang， et al. Effects of exogenous substances on the content of secondary metabolites in Arnebia euchroma Johnst hairy roots［J］. Food Science， 2016， 37（9）： 160-164. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/spkx1002-6630-201609030. http：//www.spkx.net.cn

2015-05-18

國家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金項目（31060205）；阜陽師范學(xué)院自然科學(xué)研究項目（2013FSKJ04ZD）

葛素囡（1989—），女，碩士研究生，研究方向為植物細胞工程。E-mail：940747841@qq.com

*通信作者：王芳（1962—），女，教授，碩士，研究方向為植物細胞工程。E-mail：Wangfang1hao@126.com趙胡（1977—），男，講師，博士，研究方向為植物次生代謝調(diào)控。E-mail：zhaohu8196@sina.com