覃玉鳳，陳瑤生，劉志國，張英，劉海龍，何祖勇

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哺乳動物非經(jīng)典分泌信號肽介導(dǎo)重組EGFP蛋白向畢赤酵母細(xì)胞壁轉(zhuǎn)運

覃玉鳳，陳瑤生，劉志國，張英，劉海龍，何祖勇

中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院有害生物控制與資源利用國家重點實驗室，廣東廣州 510006

為探索哺乳動物非經(jīng)典分泌信號肽在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中引導(dǎo)重組蛋白分泌的作用，本研究將一段來源于小鼠同源異型框蛋白 (En2) 的分泌信號序列 (SS) 融合至EGFP蛋白的N端，在畢赤酵母中表達(dá)。實驗結(jié)果顯示SS信號肽能通過一種不同于經(jīng)典的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體分泌通路的方式將EGFP蛋白分泌至細(xì)胞膜表面，與α交配因子前導(dǎo)肽相比，顯著降低了細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力。本研究提示哺乳動物非經(jīng)典分泌信號肽可作為遞送重組蛋白至酵母膜表面的一項工具。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力，非經(jīng)典分泌，畢赤酵母，qPCR

嗜甲醇畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)作為一種廣泛應(yīng)用的高效蛋白表達(dá)系統(tǒng)，已被證明適用于多種外源重組蛋白的表達(dá)[1-3]。畢赤酵母能直接將外源重組蛋白分泌至培養(yǎng)基中，而且只分泌少量的內(nèi)源性蛋白，非常有利于后續(xù)的外源重組蛋白的純化。此外，一些胞內(nèi)過表達(dá)的特殊外源蛋白的分泌能降低其對宿主細(xì)胞的毒害作用[4-5]。目標(biāo)蛋白的分泌依賴于分泌信號肽，在畢赤酵母系統(tǒng)中，釀酒酵母交配因子α前導(dǎo)肽是被使用最為廣泛的一種分泌信號肽[6]。該信號肽由19個氨基酸的前端信號序列連接后面包含3個潛在的N端糖基化位點和1個二元的Kex2內(nèi)肽酶切位點在內(nèi)的66個氨基酸序列而組成的[2,7]。越來越多的研究表明[8]，α前導(dǎo)肽引導(dǎo)的過表達(dá)外源重組蛋白的分泌會引起細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力，尤其是在表達(dá)多拷貝外源基因的時候，這種現(xiàn)象更為明顯。Zhu等[9]報道在表達(dá)豬胰島素前體時，當(dāng)整合到酵母基因組的表達(dá)載體拷貝數(shù)大于12時，蛋白表達(dá)量明顯降低，這種現(xiàn)象被認(rèn)為是由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力引起的未折疊蛋白應(yīng)答效應(yīng)增強(qiáng)[10]。

大多數(shù)的真核細(xì)胞蛋白通過經(jīng)典的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體分泌途徑進(jìn)行分泌，但是也有一些胞質(zhì)和核蛋白因缺少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號而通過非經(jīng)典的分泌途徑分泌到細(xì)胞表面[11-12]。Engrailed 同源異型框蛋白就是其中一種核蛋白[13]，該蛋白上一段短肽(AQELSLNESQ) 已被證明具有介導(dǎo)該蛋白通過非經(jīng)典途徑進(jìn)行分泌的功能 (以下稱SS信號肽)[14-15]。在我們前期的研究中，與經(jīng)典分泌信號肽牛β酪蛋白信號肽相比較，SS信號肽能顯著提高重組蛋白在CHO細(xì)胞中的分泌表達(dá)水平[16]。本研究通過構(gòu)建SS信號肽融合EGFP蛋白酵母表達(dá)載體，以α前導(dǎo)肽作為對照，研究SS信號肽在畢赤酵母中引導(dǎo)外源重組蛋白分泌的效率和對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌 (DH5α)、畢赤酵母表達(dá)菌株X33均為本實驗室保存。pEGFP-N1及酵母表達(dá)載體pPICZA和pPICZαA均為本實驗室保存。T-A克隆所用的載體為TaKaRa公司的pMD18-T Simple Vector。

1.1.2 試劑

高保真LA酶、定量PCR試劑SYBR Premix ExqPCR均購自TaKaRa公司。核酸檢測用SYBRGreen I、核酸電泳上樣緩沖液購自廣州東盛生物公司。質(zhì)粒小提中量試劑盒和凝膠回收試劑盒購自天根生化科技公司。T4 DNA連接酶，Ⅰ、R Ⅰ、Ⅰ、Ⅰ等限制性內(nèi)切酶購自NEB公司。Yeast DNA Kit和Yeast RNA Kit均購自O(shè)MEGA公司。酵母提取物 (Yeast extract)、胰蛋白胨 (Trypton) 購自O(shè)XOID公司。YNB購自廣州翔博生物科技有限公司。蛋白胨 (Peptone) 購自Sigma公司。蛋白預(yù)染Marker購自Fermentas公司。PVDF膜購自Bio-Rad公司?？?×His標(biāo)簽的鼠多克隆抗體購自美國Abcam公司。HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗購自廣州優(yōu)寧維公司。含有HRP底物ECL發(fā)光檢測試劑盒購自Thermo公司。

1.1.3 儀器

垂直電泳儀和電泳槽、轉(zhuǎn)膜儀、電轉(zhuǎn)化儀均購自Bio-Rad公司。多功能酶標(biāo)儀為美國Bio-Tek公司。流式細(xì)胞分析儀為美國BD公司。激光共聚焦顯微鏡購自德國Leica。

1.2 方法

1.2.1基因的克隆

設(shè)計帶有RⅠ、Ⅰ兩個酶切位點的引物，將EGFP序列從pEGFP-N1質(zhì)粒上擴(kuò)增。源于家鼠Engrailed2蛋白的SS信號肽序列從NCBI序列文庫中下載，帶有SS信號肽的EGFP基因序列通過設(shè)計的SS-EGFP引物經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得，相關(guān)引物序列見表1。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 2 min，38個循環(huán)；最后72 ℃ 延伸10 min。反應(yīng)產(chǎn)物連接T載體，并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆并提出質(zhì)粒，獲得α-EGFP-T和SS-EGFP-T質(zhì)粒。

1.2.2 酵母表達(dá)載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化

通過對重組α-EGFP-T質(zhì)粒和pPICZαA質(zhì)粒進(jìn)行R Ⅰ和Ⅰ的雙酶切反應(yīng)，膠回收α-EGFP片段和相同酶切的pPICZαA質(zhì)粒，按照一定比例連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆，最終質(zhì)粒提取獲得pPICZαA-EGFP表達(dá)載體。同理，通過R Ⅰ和Ⅰ的雙酶切反應(yīng)，獲得SS-EGFP片段和相同酶切的pPICZA質(zhì)粒，經(jīng)過連接轉(zhuǎn)化反應(yīng)以及質(zhì)粒提取獲得PICZA-SS-EGFP表達(dá)載體。載體構(gòu)建圖譜見 圖1，通過測序確定構(gòu)建載體的準(zhǔn)確性。

用Ⅰ對5?20 μg表達(dá)載體進(jìn)行線性化，之后2 000 V和4.9 ms電轉(zhuǎn)化至畢赤酵母X33感受態(tài)細(xì)胞，并將200 μL菌體懸液涂布于含有Zeocin抗生素的YPDS平板上，將平板置于30 ℃培養(yǎng)，3?10 d左右，直至單個菌落出現(xiàn)。挑取陽性克隆于液體YPD中擴(kuò)增，分別用Yeast DNA Kit試劑盒提取酵母基因組，用表1中引物進(jìn)行陽性克隆PCR鑒定。用Yeast RNA Kit提取陽性克隆酵母菌RNA，置于–80 ℃冰箱中保存。

表1 EGFP序列擴(kuò)增的引物序列

The underlined sequences correspond to theR Ⅰrestriction site in α-EGFP forward, theⅠ site in α-EGFP reverse, and SS sequences in SS-EGFP forward, theⅠsite in SS-EGFP reverse.

1.2.3 陽性克隆酵母的誘導(dǎo)表達(dá)

挑取SS-EGFP與α-EGFP陽性轉(zhuǎn)化菌株各3個，分別置于裝有25 mL BMGY培養(yǎng)基的 100 mL搖瓶中，于28–30 ℃、275 r/min培養(yǎng)至600=2?6。室溫下2 000×離心5 min，收集菌體，用BMMY重懸菌體至600=1.0左右，并置于1 L的搖瓶中，用四層紗布封口，放置于28–30 ℃、275 r/min的搖床上繼續(xù)生長。每24 h向培養(yǎng)基中添加過濾過的100%甲醇至終濃度為1%。每隔24 h取一次菌液樣品，取樣量為 1 mL，置于1.5 mL EP管中，并置于–80 ℃保存。取樣時間點為：24、48、72、96和120 h，每次取樣取3批，以用于后期的流式分析、Western blotting等檢測。

1.2.4 蛋白提取

將收集的不同時間點的菌液1 500×離心 5 min，分別收集上清并保存作為胞外蛋白樣品。酵母菌則用PBS漂洗3次，1 500×離心5 min，棄上清，用含有0.1 mol/L K3PO4和1 mol/L山梨醇的酵母等滲緩沖液懸浮細(xì)胞，加入 2.5 mg/mL的破壁酶溶液至終濃度1 mg/mL，37 ℃孵育1 h裂解細(xì)胞壁，700×離心1 min，分別收集不同時間點的上清和球形原生質(zhì)體，收集到的上清將用于細(xì)胞壁蛋白的檢測。收集到的球形原生質(zhì)體，用酵母蛋白提取試劑盒提取獲得細(xì)胞內(nèi)蛋白。

1.2.5 蛋白檢測

通過SDS-PAGE蛋白電泳及考馬斯亮藍(lán)染液檢測不同時間點上清重組EGFP蛋白分泌情況。將收集的不同時間點的上清、細(xì)胞壁和細(xì)胞內(nèi)蛋白SDS-PAGE蛋白電泳凝膠在蛋白電轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡5 min，15 V恒壓電轉(zhuǎn)移50 min至PDVF膜，用3% BSA封閉過夜，稀釋比為 1∶1 000的6×His一抗孵育2 h，TBST漂洗 3次，稀釋比為1∶3 000的HRP二抗孵育1 h，TBST漂洗3次后ECL顯色和拍照。

另外，收集到的5個時間點的培養(yǎng)基蛋白各吸取100 μL樣品加入96孔色酶標(biāo)板中，用多功能酶標(biāo)儀(Bio-Tek公司) 在485 nm/528 nm (激發(fā)光/發(fā)射光) 處檢測。收集到的酵母細(xì)胞則用流式分析儀進(jìn)行分析，熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡等觀察。

1.2.6 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力相關(guān)因子表達(dá)量的定量分析

將前面提取的酵母RNA通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以基因為內(nèi)參基因?qū)?nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力Marker基因和基因進(jìn)行qPCR檢測。用羅氏LightCycler 480 qPCR儀上進(jìn)行實時定量信號檢測，用Roche LightCycler 480分析軟件分析SS-EGFP和α-EGFP酵母轉(zhuǎn)化子的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能相關(guān)因子的表達(dá)差異。相關(guān)引物序列見表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 載體表達(dá)構(gòu)建

PCR反應(yīng)從pEGFP-N1載體上擴(kuò)增出RⅠ- SS-EGFP-Ⅰ片段和RⅠ-EGFP-Ⅰ片段，并與T載體連接。通過雙酶切反應(yīng)回收的SS-EGFP片段并直接連接到pPICZA載體上的AOX Ⅰ啟動子后面，構(gòu)成畢赤酵母X33的載體pPICZA-SS-EGFP，圖1A。而T載體上的RⅠ- EGFP-Ⅰ片段則連接到pPICZαA載體的α信號肽后面，構(gòu)成pPICZαA-EGFP載體 (圖1B)。測序結(jié)果表示，所構(gòu)建的這兩個載體序列正確無誤。

表2 定量PCR引物序列

2.2 陽性轉(zhuǎn)化子鑒定

將pPICZαA-EGFP和pPICZA-SS-EGFP表達(dá)質(zhì)粒分別電轉(zhuǎn)化畢赤酵母X33菌株，待單克隆轉(zhuǎn)化子長起來后，分別挑取SS-EGFP和α-EGFP單克隆菌落，提取基因組。通過對基因組AOXⅠ基因的PCR來鑒定陽性轉(zhuǎn)化子 (圖2)。

圖1 pPICZA-SS-EGFP酵母表達(dá)質(zhì)粒 (A) 和pPICZαA-EGFP (B) 酵母表達(dá)質(zhì)粒示意圖

圖2 酵母陽性轉(zhuǎn)化子基因組PCR鑒定

2.3 胞外蛋白檢測

通過SDS-PAGE (圖3A)、Western blotting (圖3B) 和熒光值檢測(圖3C) 等方法分別對3個α-EGFP轉(zhuǎn)化子和3個SS-EGFP轉(zhuǎn)化子誘導(dǎo)表達(dá)的培養(yǎng)基分泌蛋白進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，α-EGFP轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)基中含有大量重組EGFP蛋白，且重組EGFP蛋白分泌量隨誘導(dǎo)表達(dá)時間增長而不斷累積。而SS-EGFP轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)基中檢測不到重組EGFP蛋白 (圖3)。說明α信號肽引導(dǎo)重組外源蛋白大量分泌至胞外，而SS信號肽則不能引導(dǎo)外源蛋白分泌至胞外。

圖3 通過SDS-PAGE (A)、Western blotting (B) 和熒光值 (C) 等方法對分泌至胞外的EGFP蛋白進(jìn)行分析

2.4 細(xì)胞壁蛋白檢測

通過破壁酶對酵母細(xì)胞壁進(jìn)行酶解獲得細(xì)胞壁蛋白。分別對兩種轉(zhuǎn)化子各3個陽性單克隆誘導(dǎo)表達(dá)96 h和120 h的酵母細(xì)胞壁酶解產(chǎn)物進(jìn)行Western blotting檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SS-EGFP轉(zhuǎn)化子的細(xì)胞壁上都檢測到重組EGFP蛋白的存在，而α-EGFP轉(zhuǎn)化子細(xì)胞壁上沒有檢測到重組蛋白 (圖4)。說明SS信號肽能引導(dǎo)重組EGFP蛋白穿過酵母細(xì)胞膜到達(dá)細(xì)胞壁上，但未穿過細(xì)胞壁。

2.5 細(xì)胞內(nèi)蛋白檢測

對去掉細(xì)胞壁的酵母細(xì)胞中提取的細(xì)胞內(nèi)蛋白進(jìn)行Western blotting 檢測表明，α-EGFP轉(zhuǎn)化株的細(xì)胞內(nèi)外源蛋白含量很少，而SS-EGFP轉(zhuǎn)化株酵母細(xì)胞中，由于重組EGFP蛋白不能分泌到細(xì)胞外而大量累積在細(xì)胞內(nèi) (圖5A)。對5個時間點酵母細(xì)胞流式分析的結(jié)果與Western blot結(jié)果一致 (圖5B、5C)。

圖4 Western blotting檢測96 h (A)和120 h (B) 細(xì)胞壁上重組EGFP蛋白含量

2.6 顯微觀察

圖6A和6B顯示了在熒光顯微鏡下直接觀察兩種轉(zhuǎn)化株菌液的結(jié)果，進(jìn)一步證明了α-EGFP轉(zhuǎn)化株重組EGFP被大量分泌到培養(yǎng)基中，導(dǎo)致其培養(yǎng)基熒光高于SS-EGFP轉(zhuǎn)化株，但是酵母細(xì)胞個體熒光亮度低于SS-EGFP轉(zhuǎn)化株細(xì)胞。

激光共聚焦顯微鏡為能清晰觀察兩種轉(zhuǎn)化子酵母細(xì)胞內(nèi)的熒光分布，對兩種轉(zhuǎn)化子細(xì)胞采用不同的電壓強(qiáng)度進(jìn)行觀察。發(fā)現(xiàn)在α-EGFP轉(zhuǎn)化子細(xì)胞中的熒光集中分布在大的熒光斑點中 (圖6C)，這種現(xiàn)象與裂殖酵母中觀察到的現(xiàn)象一致[17]。但是SS-EGFP轉(zhuǎn)化株細(xì)胞中 (圖6D)，熒光均勻分布在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜周邊，而非集中在細(xì)胞核周邊，說明SS信號肽能在酵母細(xì)胞中通過非高爾基體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)依賴的蛋白分泌途徑引導(dǎo)外源蛋白分泌。

圖5 Western blotting (A) 檢測和流式分析(B、C)細(xì)胞內(nèi)重組EGFP蛋白含量

圖6 熒光顯微鏡 (A、B) 和激光共聚焦顯微鏡(C、D) 觀察

2.7 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力相關(guān)基因表達(dá)檢測

未折疊蛋白應(yīng)答是由于外源蛋白表達(dá)過多而大量累積在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力而引起的蛋白錯誤折疊，最終降低蛋白表達(dá)的現(xiàn) 象[8-9]?；蚓幋a蛋白折疊相關(guān)的重要分子伴侶，基因編碼二硫化物異構(gòu)酶，二者被認(rèn)為是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力Maker基因。我們前期的實驗表明在酵母基因組中整合一至多個α-EGFP表達(dá)質(zhì)粒，都可以使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力顯著提高[18]。圖7比較了在酵母基因組整合α-EGFP表達(dá)載體和SS-EGFP表達(dá)載體后引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力Marker基因表達(dá)變化。結(jié)果表明整合SS-EGFP轉(zhuǎn)化子引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力顯著低于α-EGFP轉(zhuǎn)化子。同時進(jìn)一步說明SS信號肽介導(dǎo)外源蛋白通過非高爾基體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑進(jìn)行分泌，因而產(chǎn)生較低的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力。

圖7 定量PCR分析內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力相關(guān)基因表達(dá)

3 討論

在之前的研究中，SS信號肽通過非高爾基體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分泌途徑介導(dǎo)外源蛋白分泌至哺乳動物細(xì)胞表面，與經(jīng)典的N端分泌信號肽不同，SS信號肽不會被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的蛋白酶所切割[16]。本研究中，SS信號肽介導(dǎo)分泌的細(xì)胞內(nèi)重組EGFP蛋白稍微大于商品化的EGFP蛋白 (圖4和圖5)，可能是由于SS信號肽融合在重組蛋白N端導(dǎo)致的。SS信號肽能在酵母細(xì)胞過表達(dá)外源蛋白時產(chǎn)生較少的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力 (圖7)，但是不能引導(dǎo)外源蛋白穿過酵母細(xì)胞壁到達(dá)培養(yǎng)基中 (圖3)。

據(jù)報道SS信號肽能通過胞外體來源的運輸小泡將外源蛋白轉(zhuǎn)運至哺乳動物細(xì)胞外[13,19]。這種現(xiàn)象與在網(wǎng)柄菌屬酵母中非經(jīng)典分泌的Acb1蛋白相似，Acb1先與自噬體相作用，再融合不斷循環(huán)再生的胞內(nèi)體，最后與細(xì)胞膜融合并釋放到細(xì)胞外[19]。與哺乳動物細(xì)胞不同，在酵母細(xì)胞中，外源蛋白的分泌不僅需要穿過細(xì)胞膜還要穿過細(xì)胞壁[20-21]。研究認(rèn)為，外源蛋白通過經(jīng)典或非經(jīng)典分泌途徑運輸?shù)郊?xì)胞膜上后，細(xì)胞膜通過出芽形成運輸小泡，這些小泡具有水解細(xì)胞壁的酶組分以便形成通道穿過細(xì)胞壁[22-24]。在α-EGFP轉(zhuǎn)化子中EGFP蛋白大量地分泌到了細(xì)胞外 (圖3)。但是在α-EGFP轉(zhuǎn)化子酵母細(xì)胞壁酶解產(chǎn)物中并未檢測到重組EGFP蛋白 (圖4)，而SS-EGFP轉(zhuǎn)化子細(xì)胞壁中不僅能檢測到重組EGFP蛋白，且重組EGFP蛋白會隨著誘導(dǎo)表達(dá)時間增加而得到累積 (圖6)。表明α-EGFP轉(zhuǎn)化子酵母細(xì)胞中重組EGFP的運輸小泡能十分高效地將EGFP蛋白轉(zhuǎn)運至胞外，不會明顯地在細(xì)胞周質(zhì)外殘留，相反SS-EGFP轉(zhuǎn)化子細(xì)胞中的運輸小泡被細(xì)胞壁阻擋而不能釋放到細(xì)胞外 (圖3和圖4)。可能的機(jī)制是SS-EGFP轉(zhuǎn)化子細(xì)胞形成的運輸小泡缺失水解酵母細(xì)胞壁的酶的組分，也可能是與酵母細(xì)胞外表面的某些膜蛋白相似，因缺失經(jīng)典分泌信號肽，SS-EGFP融合蛋白運輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)外周后仍然松散地結(jié)合在細(xì)胞壁上[25]。詳細(xì)的機(jī)制尚未明確。

總結(jié)全文，哺乳動物非經(jīng)典分泌信號肽可介導(dǎo)外源蛋白分泌到畢赤酵母細(xì)胞外周隙中，但不能分泌到培養(yǎng)基中，同時產(chǎn)生較低的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力。暗示了此信號肽可作為一項用于研究穿過酵母細(xì)胞壁必需組分的工具，且可作為遞送重組蛋白至酵母外源蛋白分泌機(jī)制膜表面的一種工具。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Delivery of recombinant enhanced green fluorescent protein tocell wall directed by a mammalian nonclassical secretion signal peptide

Yufeng Qin, Yaosheng Chen, Zhiguo Liu, Ying Zhang, Hailong Liu, and Zuyong He

State Key Laboratory of Biocontrol, School of Life Sciences, Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510006, Guangdong, China

A mammalian nonclassical secretion sequence derived from mouse Engrailed2 homeoprotein (En2) was used to direct the secretion of the enhanced green fluorescent protein from. This signal peptide conferred the transport of enhanced green fluorescent protein into periplasm through an endoplasmic reticulum-golgi independent pathway, without inducing severe unfolded protein response as compared withα-factor preprosequence. This study implies that this mammalian nonclassical signal peptide could be developed as a useful tool for delivering cargoes to the cell surface of yeast.

ER stress, nonclassical secretion,, qPCR

January 6, 2016; Accepted: March 9, 2016

Zuyong He. Tel/Fax: +86-20-39332940; E-mail: zuyonghe@foxmail.com

Supported by:National Transgenic Major Program (No. 2016ZX08006003-006), Natural Science Foundation of Guangdong Province (No. 2016A030313310).

國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項 (No. 2016ZX08006003-006)，廣東省自然科學(xué)基金 (No. 2016A030313310) 資助。