尤忠毓，王玉潔，孫詩(shī)清，劉曉俠

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微生物發(fā)酵法生產(chǎn)靈菌紅素研究進(jìn)展

尤忠毓，王玉潔，孫詩(shī)清，劉曉俠

嘉興學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江嘉興 314001

靈菌紅素是一種微生物次級(jí)代謝產(chǎn)生的重要天然紅色素，在醫(yī)藥開(kāi)發(fā)、環(huán)境治理和染料制備等領(lǐng)域具有巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值。文中從3個(gè)方面歸納了國(guó)內(nèi)外關(guān)于靈菌紅素的研究進(jìn)展：產(chǎn)靈菌紅素微生物的發(fā)現(xiàn)與改造；靈菌紅素發(fā)酵與提取過(guò)程的控制與優(yōu)化；靈菌紅素生物合成途徑及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的解析。最后，討論了微生物發(fā)酵法生產(chǎn)靈菌紅素今后的研究方向。

靈菌紅素，發(fā)酵生產(chǎn)，菌株選育，優(yōu)化控制，合成途徑，轉(zhuǎn)錄調(diào)控

靈菌紅素類色素 (Prodigiosins，PGs) 是一類具有3個(gè)吡咯環(huán)的甲氧基吡咯骨架結(jié)構(gòu)的天然紅色素，它們是某些沙雷氏菌、放線菌及海洋細(xì)菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物[1]。因其烷基側(cè)鏈的不同分為多種結(jié)構(gòu)類似物，包括靈菌紅素 (Prodigiosin，PG)、十一烷基靈菌紅素(Undecylprodigiosin，UP)、環(huán)烷基靈菌紅素(Cycloprodigiosin)、間環(huán)丙菌素(Metacycloprodigiosin)、鏈玉紅菌素B (Streptorubin B)等[1-2]。其中靈菌紅素是該類色素的典型代表之一，其外觀為暗紅色粉末，易溶于甲醇、乙醇、丙酮等極性較大的有機(jī)溶劑，幾乎不溶于水，在不同pH條件下可以呈現(xiàn)出不同的顏色[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，靈菌紅素具有抗細(xì)菌、抗真菌、抗瘧疾、抗原生動(dòng)物、抗癌、免疫抑制等重要生物活性[1-2]，可用于特效的免疫抑制劑和抗菌、抗癌等藥物的開(kāi)發(fā)；而且靈菌紅素對(duì)藻類的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，在治理由各種藻類造成的海洋赤潮和淡水水華等方面表現(xiàn)出極佳的效果，且無(wú)二次污染[5-6]；此外，靈菌紅素作為微生物來(lái)源的天然色素，用作生態(tài)染料，具有良好的色牢度和上染率，有望推動(dòng)傳統(tǒng)染料工業(yè)乃至紡織工業(yè)的技術(shù)變革[7-8]。近來(lái)研究還發(fā)現(xiàn)由于靈菌紅素對(duì)光敏感，可作為防曬霜等化妝品的添加劑，減小紫外線對(duì)皮膚的損傷[9]。因此靈菌紅素在醫(yī)藥、環(huán)境治理、紡織染料乃至化妝品等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景和市場(chǎng)價(jià)值。

目前，靈菌紅素可以通過(guò)化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法制備[2,10]。由于化學(xué)合成法相對(duì)困難，反應(yīng)步驟多，產(chǎn)率低，因此難以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的生產(chǎn)；而微生物發(fā)酵法生產(chǎn)靈菌紅素具有環(huán)境友好、條件溫和、成本低和易于工業(yè)化等優(yōu)點(diǎn)，因此，近年來(lái)采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)靈菌紅素已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)室也從自然界篩選到了1株產(chǎn)靈菌紅素的菌株[3,11]，并開(kāi)展了菌種的誘變育種[12]、發(fā)酵及提取工藝優(yōu)化[13]、靈菌紅素的抗菌及染色性能研究[14-15]、靈菌紅素合成關(guān)鍵酶的克隆表達(dá)[16]等研究工作，取得了一定的研究成果。本文在實(shí)驗(yàn)室前期研究的基礎(chǔ)上，結(jié)合前人對(duì)靈菌紅素生物合成的研究，就產(chǎn)靈菌紅素菌株的選育、發(fā)酵及提取工藝的優(yōu)化、靈菌紅素生物合成途徑及相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控等方面進(jìn)行綜述，以促進(jìn)微生物發(fā)酵法生產(chǎn)靈菌紅素的研究進(jìn)程。

1 產(chǎn)靈菌紅素微生物的發(fā)現(xiàn)與改造

1.1 產(chǎn)靈菌紅素的天然微生物

自然界中能合成天然色素的微生物很多，但是產(chǎn)靈菌紅素的微生物種類并不多，主要包括沙雷氏菌屬[17]、河氏菌屬[18]、假單胞菌屬[19]、弧菌屬[20]等。其中研究最廣泛的是粘質(zhì)沙雷氏菌，該菌又名靈桿菌，是一種常見(jiàn)的革蘭氏陰性桿菌，靈菌紅素最早于1902年從該菌中發(fā)現(xiàn)[21]。筆者實(shí)驗(yàn)室從土壤中篩選到1株jx1，經(jīng)培養(yǎng)條件優(yōu)化后其靈菌紅素產(chǎn)量可達(dá)5.1 g/L[22]。表1中列舉了其他多種及其產(chǎn)靈菌紅素的水平。除外，還有多種海洋微生物也具有產(chǎn)靈菌紅素的能力，例如，Kim等從海洋中篩選到1株河氏菌KCTC 2396，該菌經(jīng)培養(yǎng)可得到0.028 g/L的靈菌紅素[18]。從表1中可以看出，海洋微生物的靈菌紅素產(chǎn)量普遍低于，因此，將是發(fā)酵法生產(chǎn)靈菌紅素的首選微生物。

表1 靈菌紅素產(chǎn)生菌

NR: not reported.

1.2 高產(chǎn)菌株的選育

野生型菌株的靈菌紅素產(chǎn)量較低，不具備大規(guī)模生產(chǎn)的能力，從而很難走出實(shí)驗(yàn)室，若要真正利用靈菌紅素，必須在高產(chǎn)菌株的選育上有所突破，表2列舉了部分靈菌紅素產(chǎn)生菌的誘變育種效果。紫外誘變是一種傳統(tǒng)而經(jīng)典的物理誘變方法，該方法操作簡(jiǎn)便，成本低，常用于微生物菌種的改良。Tao等將的細(xì)胞懸液在紫外下照射20 s，經(jīng)培養(yǎng)、篩選得到1株靈菌紅素產(chǎn)量提高2.8倍的突變株[28]。相對(duì)于紫外誘變而言，微波誘變是一種較新的且具有顯著成效的物理誘變技術(shù)，筆者實(shí)驗(yàn)室利用微波誘變技術(shù)對(duì)jx1進(jìn)行了誘變處理，使該菌的靈菌紅素產(chǎn)量從3.1 g/L提高至6.5 g/L[12]。

烷化劑是一類高效的化學(xué)誘變劑，它可引起DNA分子的部分烷化，使DNA在復(fù)制過(guò)程中發(fā)生錯(cuò)配而產(chǎn)生突變，常見(jiàn)的烷化劑有甲基磺酸乙酯 (EMS)、亞硝基胍 (NTG) 和硫酸二乙酯 (DES) 等。Kim等以EMS為誘變劑，對(duì)靈菌紅素產(chǎn)生菌KCTC 2396進(jìn)行了處理，經(jīng)平板篩選、液體培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)其靈菌紅素產(chǎn)量從0.658 g/L提高至1.628 g/L[29]。Alihosseini等利用1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍對(duì)進(jìn)行誘變育種，使其靈菌紅素產(chǎn)量提高了81%[30]。

表2 靈菌紅素產(chǎn)生菌的誘變育種

此外，多種誘變劑的復(fù)合使用也是提高突變率的有效方法，陶金莉等通過(guò)UV-LiCl復(fù)合處理，并利用高濃度的葡萄糖定向篩選抗葡萄糖分解代謝物阻遏的高產(chǎn)株，最終獲得1株產(chǎn)量提高了3倍的突變株[31]。綜上所述，從自然界篩選新菌種、菌種誘變育種是提高靈菌紅素產(chǎn)量的重要方法，結(jié)合新興的微生物育種技術(shù) (如基因工程育種等) 進(jìn)一步選育出高產(chǎn)菌株是今后育種的重要方向。

2 靈菌紅素的發(fā)酵及提取工藝

眾所周知，微生物發(fā)酵產(chǎn)品的生產(chǎn)除了良好的菌種外，優(yōu)良的發(fā)酵工藝也是必不可少的。為了進(jìn)一步提高靈菌紅素的產(chǎn)量，有必要對(duì)發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行優(yōu)化和控制研究，包括培養(yǎng)基組分、培養(yǎng)過(guò)程參數(shù)和培養(yǎng)模式等。同時(shí)，發(fā)酵過(guò)程結(jié)束后，靈菌紅素的分離純化過(guò)程是影響其質(zhì)量的關(guān)鍵因素，也是決定其生產(chǎn)成本的最主要因素。因此，國(guó)內(nèi)外研究者在靈菌紅素發(fā)酵和提取工藝方面做了大量研究工作。

2.1 培養(yǎng)基組分的優(yōu)化

培養(yǎng)基為微生物的生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物的合成提供足夠的營(yíng)養(yǎng)和能量。對(duì)于靈菌紅素的發(fā)酵生產(chǎn)，不同菌種對(duì)培養(yǎng)基組分的需求也不盡相同，研究人員常采用基于統(tǒng)計(jì)分析的方法設(shè)計(jì)理想的培養(yǎng)基配方，以獲得最大的靈菌紅素產(chǎn)量。例如：Su等利用響應(yīng)面法對(duì)的培養(yǎng)基組分進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明，該菌的最優(yōu)培養(yǎng)基組分為：0.5%蔗糖、0.454%蛋白胨、0.5%甘氨酸和1 626.3 ppm KH2PO4，在最佳培養(yǎng)條件下，該菌的靈菌紅素產(chǎn)量達(dá)2.423 g/L，比其初始產(chǎn)量提高了8.42倍[34]。Kim等利用Plackett-Burman設(shè)計(jì)和Box-Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化了KCTC 2396的培養(yǎng)基，最終使其靈菌紅素產(chǎn)量提高了3倍[35]。

在培養(yǎng)基組分優(yōu)化過(guò)程中，研究人員發(fā)現(xiàn)某些特殊物質(zhì)的添加可以增加靈菌紅素的產(chǎn)量。如：含脂肪酸類的物質(zhì)在靈菌紅素發(fā)酵生產(chǎn)中發(fā)揮著重要的作用，其中作用最為明顯的是花生粉。Giri等以花生粉培養(yǎng)基代替營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基時(shí)，產(chǎn)靈菌紅素的水平從0.52 g/L迅速上升至38.75 g/L，該產(chǎn)量提升的關(guān)鍵因素是花生粉中含有大量的飽和脂肪酸，而飽和脂肪酸有助于合成靈菌紅素[36]。有研究表明，脯氨酸、色氨酸和組氨酸等含有吡咯結(jié)構(gòu)的氨基酸可以作為前體物質(zhì)加入培養(yǎng)基中，有利于促進(jìn)靈菌紅素的合成。Siva等的研究顯示，脯氨酸單獨(dú)或與甲硫氨酸組合使用，可以讓的靈菌紅素產(chǎn)量提高數(shù)倍[26]。此外，筆者實(shí)驗(yàn)室在優(yōu)化發(fā)酵過(guò)程時(shí)發(fā)現(xiàn)當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.1 g/L的二甲基亞砜時(shí)，靈菌紅素的產(chǎn)量可以提高近1倍，分析其原因可能是二甲基亞砜增加了細(xì)胞膜的通透性，使其從細(xì)胞內(nèi)分泌至細(xì)胞外，減少了靈菌紅素在細(xì)胞內(nèi)積累，從而解除了反饋調(diào)節(jié)，提高了靈菌紅素的產(chǎn)量[37]。

為了進(jìn)一步降低生產(chǎn)成本，有效利用各類資源，研究人員還不斷致力于尋找更廉價(jià)高效的培養(yǎng)基。de Araujo等考察了木薯廢水和玉米浸出液對(duì)UCP 1549產(chǎn)靈菌紅素的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)利用6%木薯廢水和2%甘露醇為培養(yǎng)基時(shí)，該菌的靈菌紅素產(chǎn)量可達(dá)49.5 g/L，這是目前文獻(xiàn)報(bào)道中靈菌紅素的最高產(chǎn)量[38]。Sumathi等從以制革廠產(chǎn)生的廢肉為食的魚類腸道中篩選到1株，該菌可以在制革廢肉培養(yǎng)基中生長(zhǎng)并合成靈菌紅素，在最佳培養(yǎng)條件下，其靈菌紅素的產(chǎn)量可達(dá)約48 g/L[39]。筆者實(shí)驗(yàn)室也探索了利用硫酸軟骨素生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的廢蛋白代替蛋白胨來(lái)培養(yǎng)，在適當(dāng)濃度下有利于靈菌紅素產(chǎn)量的提高 (結(jié)果待發(fā)表)。由此可以看出，利用工農(nóng)業(yè)廢棄物作為培養(yǎng)基原料發(fā)酵生產(chǎn)靈菌紅素是有效降低成本、合理利用資源的理想途徑。

2.2 發(fā)酵參數(shù)與發(fā)酵模式的優(yōu)化

發(fā)酵參數(shù) (如溫度、pH等) 對(duì)微生物合成靈菌紅素有著重要的影響，其中溫度對(duì)沙雷氏菌屬產(chǎn)靈菌紅素的影響最為顯著。該菌屬產(chǎn)靈菌紅素的過(guò)程屬于溫度敏感型，當(dāng)溫度低于30 ℃時(shí)，其產(chǎn)靈菌紅素的能力較強(qiáng)，溫度高于37 ℃，其基本不產(chǎn)色素。多數(shù)研究表明，產(chǎn)靈菌紅素的最佳溫度為28 ℃[26,36,38]。為了探究溫度對(duì)靈菌紅素合成的影響機(jī)理，徐虹等分析了JNB5-1在不同溫度下的蛋白表達(dá)差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在高溫 (37 ℃)培養(yǎng)下，參與靈菌紅素合成的相關(guān)蛋白 (酶) 表達(dá)量顯著下降，從而降低了靈菌紅素的產(chǎn)量[40]。還有研究指出，TKU011 PG的最適生長(zhǎng)溫度和最適產(chǎn)色素溫度有一定差別，作者將菌體生長(zhǎng)溫度設(shè)為30 ℃，靈菌紅素合成溫度設(shè)為25 ℃，其靈菌紅素產(chǎn)量比恒定30 ℃條件下有明顯提高[41]。該研究還考察了溶氧對(duì)靈菌紅素發(fā)酵的影響，當(dāng)采用含擋板的錐形瓶代替普通錐形瓶進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，靈菌紅素的產(chǎn)量從0.84 g/L提高至2.48 g/L[41]，由此可以看出，在其他條件確定的情況下，適當(dāng)提高溶氧可以增加靈菌紅素的產(chǎn)量。因此對(duì)氧傳遞的進(jìn)一步研究對(duì)靈菌紅素的發(fā)酵具有促進(jìn)作用，特別是在發(fā)酵規(guī)模放大過(guò)程中對(duì)溶氧的控制具有指導(dǎo)意義。

液體分批培養(yǎng)是微生物發(fā)酵最常用的培養(yǎng)策略之一，也是實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵靈菌紅素所采用的基本培養(yǎng)模式。但是，靈菌紅素的生產(chǎn)也可采用固體發(fā)酵的模式，如：Miao等比較了657的液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)過(guò)程，發(fā)現(xiàn)兩者的靈菌紅素產(chǎn)量分別為0.07 g/L和0.18 g/L[42]。此外，在微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物生產(chǎn)過(guò)程中，分批補(bǔ)料發(fā)酵策略也常用于提高產(chǎn)物的產(chǎn)量。Tao等將該策略應(yīng)用于靈菌紅素的發(fā)酵，使菌體的生長(zhǎng)和色素的合成分成兩個(gè)階段：第一階段，以葡萄糖為主要碳源，有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)；第二階段，通過(guò)補(bǔ)料的方式向培養(yǎng)基中添加甘油，促進(jìn)靈菌紅素的合成。在該策略的作用下，靈菌紅素的產(chǎn)量比初始產(chǎn)量提高了7.8倍[28]。另外還有一些不同的細(xì)胞培養(yǎng)模式用于靈菌紅素的發(fā)酵，例如：固定化細(xì)胞培養(yǎng)等。Chen等首先將C3在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至600=10，離心收集菌體后包埋于海藻酸鈣凝膠小球中繼續(xù)發(fā)酵，最終色素的產(chǎn)量比對(duì)照組提高了近2倍，達(dá)15.6 g/L[43]。Bae等開(kāi)發(fā)了一套新的一體式生物反應(yīng)器，該反應(yīng)器不僅提高了靈菌紅素的產(chǎn)量，而且還簡(jiǎn)化了色素的分離步驟。其主要特點(diǎn)是：反應(yīng)器內(nèi)部包含1個(gè)由不銹鋼濾網(wǎng)制成的平臺(tái)，平臺(tái)內(nèi)填充聚合樹(shù)脂用于吸附發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的色素，結(jié)果該反應(yīng)器中靈菌紅素的產(chǎn)量達(dá)13.1 g/L，比普通反應(yīng)器提高了2.6倍[44]。

2.3 靈菌紅素的分離純化

在微生物發(fā)酵過(guò)程中靈菌紅素主要存在于細(xì)胞內(nèi)，特別是附著在細(xì)胞膜上，因此需要經(jīng)過(guò)一系列的分離純化過(guò)程才能得到高質(zhì)量的產(chǎn)品。目前，靈菌紅素的分離方法主要包括有機(jī)溶劑提取法和樹(shù)脂吸附法。有機(jī)溶劑提取法常用的試劑包括甲醇、丙酮、乙酸乙酯和氯仿等。Chen等將發(fā)酵液與甲醇混合振蕩，離心收集上清，濃縮后經(jīng)氯仿萃取得到靈菌紅素粗品[43]。如此直接抽提發(fā)酵液會(huì)使液體的處理量增大，Juang等開(kāi)發(fā)了一種以截留分子量為1 kDa的再生纖維素膜為材料，對(duì)甲醇抽提液進(jìn)行超濾濃縮的方法，該方法可以使抽提液濃縮4倍，回收率為81%[45]。為了減少液體處理量，也可將發(fā)酵液離心后直接從細(xì)胞中抽提靈菌紅素。筆者實(shí)驗(yàn)室對(duì)利用超聲輔助提取jx1細(xì)胞中靈菌紅素的條件進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以酸性丙酮為溶劑 (用量為27.2 mL/g細(xì)胞)，在23.4 ℃條件下提取17.5 min可以獲得最好的提取效果[13]。

樹(shù)脂吸附法主要利用樹(shù)脂對(duì)靈菌紅素的物理吸附作用，從發(fā)酵液中分離靈菌紅素。但靈菌紅素的水溶性差，在樹(shù)脂吸附過(guò)程中仍需有機(jī)溶劑或表面活性劑的參與。Juang等利用明礬和甲醇對(duì)SMDR的發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)處理，去除菌體后的清液用大孔樹(shù)脂HP-20進(jìn)行吸附，最后用含90%甲醇和10% 0.2 mol/L HCl的混合液進(jìn)行洗脫得到靈菌紅素樣品，該研究還發(fā)現(xiàn)樹(shù)脂HP-20對(duì)靈菌紅素的吸附過(guò)程是自發(fā)的放熱過(guò)程 (?H=–1.78 kJ/mol)，僅受疏水作用的影響[46]。Wang等利用樹(shù)脂X-5建立了靈菌紅素發(fā)酵與分離相耦聯(lián)的系統(tǒng)，該系統(tǒng)主要由發(fā)酵罐、泵和吸附柱組成，當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行20 h后，發(fā)酵液經(jīng)泵在吸附柱和發(fā)酵罐間循環(huán)，直至發(fā)酵結(jié)束，從吸附柱上洗脫得到靈菌紅素，該耦聯(lián)系統(tǒng)不僅免去了細(xì)胞分離的步驟，而且直接獲得一定純度的靈菌紅素，該過(guò)程的總收率達(dá)83%[47]。

3 靈菌紅素的合成途徑及基因調(diào)控

關(guān)于靈菌紅素在微生物細(xì)胞內(nèi)的合成途徑、相關(guān)基因及代謝調(diào)控一直是科研人員努力研究的方向，以期為靈菌紅素的工業(yè)生產(chǎn)提供足夠的理論依據(jù)。目前普遍認(rèn)為靈菌紅素的合成主要是由基因簇控制，通過(guò)兩個(gè)分支途徑共同完成，這兩個(gè)分支途徑分別合成靈菌紅素的兩個(gè)前體物質(zhì) (2-甲基-3-戊基吡咯(MAP) 和4-甲氧基-2,2-二吡咯-5-羧甲基乙醛(MBC))，兩者再經(jīng)一步縮合反應(yīng)生成靈菌紅素[17]。下面將對(duì)靈菌紅素的合成基因簇、合成途徑及相關(guān)基因調(diào)控機(jī)制進(jìn)行詳細(xì)討論。

3.1 合成基因簇

到目前為止，已有多個(gè)微生物的靈菌紅素合成基因簇被克隆、表達(dá)并測(cè)序，包括sp. ATCC 39006 (S39006)、ATCC 274 (Sma274)、KCTC 2396 (Hch2396) 和詹森桿菌strain BR01 (JliBR01) 等[17,48-49]。其中Hch2396的基因簇命名為基因簇，其他3種微生物的基因簇均命名為基因簇。此外，F(xiàn)S14和WW4的基因簇也被測(cè)序鑒定，其結(jié)構(gòu)與Sma274的基因簇非常相似[50]?；虼睾突虼鼐?3?15個(gè)與靈菌紅素合成密切相關(guān)的基因 (如S39006的A-O)，如圖1所示。通過(guò)對(duì)這些基因的序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，盡管來(lái)自不同的微生物，但它們之間仍保持一定的序列相似性，其中，S39006和Sma274的基因簇相似性高達(dá)56.0%，相似性最低的是S39006和Hch2396的基因簇，僅為28.4%，其余的相似性均在30%?40%之間。

圖1 靈菌紅素合成基因簇[17,48-49]

在基因的構(gòu)成上，各個(gè)基因簇存在一定的差異，S39006的基因簇在3′端比其他基因簇多一個(gè)O基因，而且在其他基因簇中未發(fā)現(xiàn)同源基因，Harris等研究發(fā)現(xiàn)，O并不直接參與靈菌紅素的合成，而是起到一定的調(diào)控作用[17]。此外，S39006基因簇兩端的基因Y和Z也是該基因簇獨(dú)有的，其中Y編碼的蛋白包含吡啶核苷酸二硫鍵氧化還原酶結(jié)構(gòu)域，它與NADH氧化酶有較高的序列相似性，而Z的功能仍然未知[17]。Sma274的基因簇兩端則是R和A基因，Williamson等研究發(fā)現(xiàn)，R和A與細(xì)胞內(nèi)銅穩(wěn)態(tài)平衡有關(guān)，當(dāng)A發(fā)生突變時(shí)，突變菌株對(duì)銅離子更加敏感，而且靈菌紅素的產(chǎn)量得到提升，因此可以看出A對(duì)靈菌紅素的合成具有調(diào)節(jié)作用[51]。在Hch2396的基因簇的3′末端存在兩個(gè)轉(zhuǎn)錄方向與基因簇相反的基因 (9和10)，它們與的組氨酸激酶和應(yīng)答調(diào)控子具有較高的同源性，因此，認(rèn)為這兩個(gè)基因可以調(diào)控Hch2396合成靈菌紅素[48]。JliBR01的基因簇與其他基因簇最大的區(qū)別是，B與C及J與K以融合基因的形式存在，且在該基因簇中缺少N基因[49]。

在獲得靈菌紅素合成基因簇序列的基礎(chǔ)上，研究人員對(duì)基因簇中各基因所編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行了序列分析及功能研究。Williamson等對(duì)S39006基因簇中各基因進(jìn)行基因敲除或片段插入以構(gòu)建相應(yīng)的突變體，再通過(guò)液質(zhì)聯(lián)用 (LC-MS)、營(yíng)養(yǎng)共生 (Cross-feeding) 及遺傳互補(bǔ) (Genetic complementation) 的方法分析各突變體發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的中間產(chǎn)物，從而確定各基因編碼的蛋白在靈菌紅素合成過(guò)程中的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PigB、PigD和PigE參與了MAP的合成，PigA、PigF、PigG、PigH、PigI、PigJ、PigM和PigN參與了MBC的合成，而MBC和MAP的縮合反應(yīng)則由PigC催化實(shí)現(xiàn)，其中各蛋白的功能見(jiàn)表3[52]。在上述蛋白中不包括PigK和PigL，因?yàn)閮烧卟⑽粗苯訁⑴c靈菌紅素的合成，其中PigK的作用是充當(dāng)分子伴侶，協(xié)助一種或多種參與合成MBC的Pig蛋白進(jìn)行正確折疊；PigL的序列同源性分析顯示該蛋白是一種4’-磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶，而在MBC合成過(guò)程中存在磷酸泛酰巰基乙胺基的轉(zhuǎn)移，在MAP合成時(shí)則不存在該轉(zhuǎn)移過(guò)程，因此將PigK和PigL歸屬于MBC的合成途徑[52]。Sma274、Hch2396和JliBR01的基因簇所編碼的蛋白與S39006的相應(yīng)Pig蛋白相比，其序列的一致性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于核酸序列的一致性 (表3)，因此，它們與S39006的Pig蛋白具有較高的同源性，在蛋白的功能上也與S39006的Pig蛋白保持一致[17,48-49]。

除了對(duì)/基因簇所編碼的蛋白進(jìn)行系統(tǒng)性研究外，研究人員也對(duì)其中的某些蛋白進(jìn)行了深入的研究。例如，PigC作為最終合成靈菌紅素的關(guān)鍵酶，通過(guò)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)其包含ATP結(jié)合域和磷酸轉(zhuǎn)移域，Chawrai等對(duì)39006的PigC和的HapC進(jìn)行了克隆表達(dá)，并利用定點(diǎn)突變技術(shù)證實(shí)在PigC中，Glu-281、Arg295和His-840是該酶結(jié)合ATP及催化磷酸轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵氨基酸殘基；底物特異性研究發(fā)現(xiàn)PigC除能夠催化MAP和MBC的縮合反應(yīng)外，還可以催化兩者的結(jié)構(gòu)類似物之間的縮合反應(yīng)，最終生成靈菌紅素結(jié)構(gòu)類似物，為合成新的靈菌紅素類色素提供了理論基礎(chǔ)[53-54]。此外，包括PigE、PigF、PigI和HapK在內(nèi)的多個(gè)蛋白的晶體結(jié)構(gòu)得到解析[55-58]，從而能夠更好地理解該蛋白在靈菌紅素合成過(guò)程中的作用。

表3 靈菌紅素合成基因簇編碼蛋白的功能

*It was putative function from sequence homology. **Percentage of identity was obtained by aligning the deduced amino acid sequences using CLUSTALW (http://www.genome.jp/tools/clustalw/).

3.2 生物合成途徑

3.2.1 MAP的合成

MAP的合成途徑如圖2所示。該途徑以脂肪酸合成或不飽和脂肪酸自氧化過(guò)程中產(chǎn)生的2-辛烯醛為起始前體，在PigD的作用下與丙酮酸反應(yīng)，其中，PigD與乙酰乳酸合成酶同源，可以催化丙酮酸脫羧，并將脫羧后的2C單元與2-辛烯醛結(jié)合生成3-Acetyloctanal；再由具有氨基轉(zhuǎn)移活性的PigE催化合成氨基酮，氨基酮自環(huán)化形成環(huán)亞胺H2MAP；最后，H2MAP在PigB的催化下氧化脫氫形成MAP。

3.2.2 MBC的合成

MBC的合成以L-脯氨酸為起始底物，在PigI的作用下，L-脯氨?；cPigG中的巰基結(jié)合形成復(fù)合物L(fēng)-脯氨酰-S-PigG，再經(jīng)PigA的催化下氧化脫氫得到吡咯-2-羧基-S-PigG，然后吡咯-2-羧基單元從PigG轉(zhuǎn)移至PigJ活性中心的半胱氨酸得到吡咯-2-羧基-S-PigJ，同時(shí)PigH從一分子丙二酰輔酶A中奪取了丙二?；?，形成了復(fù)合物丙二酰基-S-PigH，該復(fù)合物脫羧后進(jìn)攻吡咯-2-羧基-S-PigJ的硫酯鍵，生成了一種與PigH相連接的吡咯-β-酮基硫酯復(fù)合物，在PigH的作用下吡咯-β-酮基硫酯與絲氨酸反應(yīng)生成4-羥基-2,2′-二吡咯-5-甲醇 (HBM)，HBM在PigM的催化下羥基被氧化成醛基得到4-羥基-2,2′-二吡咯-5-甲醛 (HBC)，最后，HBC的羥基在PigF和PigN的作用下被甲基化生成MBC，合成途徑如圖2所示。

3.2.3 MAP與MBC的縮合

靈菌紅素合成的最后一步即為MAP和MBC的縮合，催化該反應(yīng)的酶是PigC，反應(yīng)過(guò)程如圖2所示[10,52]。Chawrai等對(duì)該過(guò)程的反應(yīng)機(jī)理進(jìn)行了解析：MBC和ATP首先與PigC相結(jié)合，分別進(jìn)入該酶的催化中心及ATP結(jié)合域，然后PigC的磷酸轉(zhuǎn)移域奪取ATP的磷酸基團(tuán)，結(jié)合了磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移域進(jìn)攻MBC的醛基，使醛基活化后，MAP進(jìn)入催化中心與MBC發(fā)生縮合反應(yīng)，最終生成靈菌紅素并釋放出磷酸基團(tuán)[54]。

圖2 靈菌紅素的合成途徑[10,17,48,52]

3.3 合成基因簇的轉(zhuǎn)錄調(diào)控

靈菌紅素合成基因簇的轉(zhuǎn)錄受多種因素聯(lián)合調(diào)控，包括微生物本身的多個(gè)基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)：群體感應(yīng)系統(tǒng)和雙組分系統(tǒng)，此外還包括多種調(diào)控蛋白。各調(diào)控系統(tǒng)和調(diào)控蛋白的作用及相互之間的聯(lián)系如圖3所示。

3.3.1 群體感應(yīng)系統(tǒng)

群體感應(yīng) (Quorum sensing) 是細(xì)菌根據(jù)自身的細(xì)胞密度變化進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控的系統(tǒng)，其基本原理是細(xì)菌通過(guò)感受自身在繁殖過(guò)程中分泌的某種信號(hào)分子，當(dāng)該信號(hào)分子達(dá)到一定閾值時(shí)，細(xì)菌會(huì)啟動(dòng)某些基因的表達(dá)[59]。研究表明，S39006合成靈菌紅素的過(guò)程受群體感應(yīng)系統(tǒng)的調(diào)控，該系統(tǒng)主要由I和R兩個(gè)基因組成，其中SmaI的作用是合成信號(hào)分子N-?；?高絲氨酸內(nèi)酯類(AHLs) 化合物，當(dāng)細(xì)胞密度較小時(shí)，AHLs濃度較低，SmaR與基因簇相結(jié)合，從而抑制該基因簇的轉(zhuǎn)錄；隨著細(xì)胞的生長(zhǎng)，AHLs的濃度不斷增大，當(dāng)AHLs濃度達(dá)到一定值時(shí)可以抑制SmaR結(jié)合DNA的活性，使基因簇得到轉(zhuǎn)錄表達(dá)，細(xì)胞開(kāi)始合成靈菌紅素[60-62]。在SS-1合成靈菌紅素的過(guò)程中SpnI和SpnR構(gòu)成了其群體感應(yīng)系統(tǒng)[63]。

圖3 靈菌紅素合成基因簇的轉(zhuǎn)錄調(diào)控

3.3.2 雙組分系統(tǒng)

雙組分系統(tǒng)(Two-component regulatory systems) 是微生物為適應(yīng)不同的環(huán)境變化而建立的基因表達(dá)調(diào)控體系，該系統(tǒng)主要由傳感器激酶蛋白和應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白組成[64]。研究發(fā)現(xiàn)，靈菌紅素的合成至少受4個(gè)雙組分系統(tǒng)的調(diào)控：PigQ/PigW、PhoB/PhoR、RssB/RssA和EepR/EepS。Fineran等研究表明，在PigQ/PigW雙組分系統(tǒng)中，PigW作為傳感器激酶蛋白，PigQ作為應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白，當(dāng)PigW感應(yīng)到某一生理信號(hào)時(shí)促使PigQ磷酸化，磷酸化的PigQ促進(jìn)基因簇的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)靈菌紅素的合成。當(dāng)Q和W發(fā)生突變時(shí)，基因簇的轉(zhuǎn)錄水平和靈菌紅素的產(chǎn)量都有所下降，因此，認(rèn)為PigQ/W雙組分系統(tǒng)對(duì)靈菌紅素的合成具有正調(diào)控作用[62]。PhoB/ PhoR是S39006合成靈菌紅素的另一個(gè)正調(diào)控雙組分系統(tǒng)，該系統(tǒng)與細(xì)胞內(nèi)磷酸鹽 (Pi) 含量有關(guān)[65]。EepR/EepS是最新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)具有正調(diào)控作用的雙組分系統(tǒng)，其中EepR可以促進(jìn)基因簇的轉(zhuǎn)錄，但是EepR的表達(dá)受環(huán)腺苷酸受體蛋白 (cAMP receptor protein，CRP) 的抑制，因此，對(duì)靈菌紅素合成基因簇而言，CRP是一種間接負(fù)調(diào)控蛋白[66]。在4個(gè)雙組分系統(tǒng)中，RssB/RssA是唯一一個(gè)具有負(fù)調(diào)控作用的系統(tǒng)，其中的應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白R(shí)ssB磷酸化后會(huì)阻礙基因簇的轉(zhuǎn)錄[67]。

3.3.3 其他調(diào)控機(jī)制

除了上述的調(diào)控系統(tǒng)外，靈菌紅素合成基因簇的轉(zhuǎn)錄還受到多種蛋白的調(diào)節(jié)，主要包括PigP、PigT、PigX、HexS、PigS、PigR和PigV等，其中PigP是1個(gè)多功能轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，它不僅直接調(diào)節(jié)靈菌紅素合成基因簇的轉(zhuǎn)錄，還對(duì)其他多種調(diào)控蛋白的轉(zhuǎn)錄具有調(diào)節(jié)作用[62](圖3)。PigT是一種GntR家族轉(zhuǎn)錄因子，可以促進(jìn)基因簇的轉(zhuǎn)錄，但是當(dāng)環(huán)境 (培養(yǎng)基) 中存在葡萄糖酸鹽 (Gluconate) 時(shí)，PigT的DNA結(jié)合活力會(huì)被抑制，從而削弱其對(duì)基因簇轉(zhuǎn)錄的激活作用[68]。PigX是一種環(huán)二鳥(niǎo)苷酸(c-di-GMP) 磷酸二酯酶，包含一個(gè)GGDEF/ EAL結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞合成c-di-GMP有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)X發(fā)生突變時(shí)，細(xì)胞內(nèi)PigA和PigF的表達(dá)水平顯著提高，靈菌紅素產(chǎn)量比野生型菌株提高350%，因此，PigX是一種靈菌紅素合成基因簇轉(zhuǎn)錄抑制因子[69]。HexS是LysR家族轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)基因簇的轉(zhuǎn)錄起負(fù)調(diào)控作用，其主要調(diào)控機(jī)理是與A上游序列相結(jié)合，抑制基因簇的轉(zhuǎn)錄[70]。PigS屬于SmtB/ArsR家族的轉(zhuǎn)錄抑制因子，Gristwood等研究發(fā)現(xiàn)S基因兩端含有兩個(gè)獨(dú)立的操縱子 (A-Y和ABC)，該操縱子的表達(dá)產(chǎn)物會(huì)抑制靈菌紅素的合成，而PigS可以抑制這兩個(gè)操縱子的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，因此，對(duì)于靈菌紅素合成而言，PigS是一種間接正調(diào)控因子，同時(shí)，PigP對(duì)S的轉(zhuǎn)錄具有促進(jìn)作用[71]。此外，還包括PigR和PigV兩種調(diào)控蛋白對(duì)靈菌紅素的合成具有調(diào)節(jié)作用，其中PigR是一種腺苷酸環(huán)化酶，PigV是一種內(nèi)膜蛋白，兩者都可以促進(jìn)靈菌紅素的合成，但其作用機(jī)制尚未得到解析[62]。

4 結(jié)論與展望

靈菌紅素作為一種重要的天然色素，近年來(lái)隨著靈菌紅素的應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大，其巨大的市場(chǎng)潛力也不斷顯現(xiàn)，只有實(shí)現(xiàn)靈菌紅素的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)才能滿足人們對(duì)其的需求。目前靈菌紅素的合成研究主要集中在微生物發(fā)酵方面，以上關(guān)于靈菌紅素高產(chǎn)菌株選育、發(fā)酵及提取工藝優(yōu)化和生物合成途徑及基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制解析等方面的研究為靈菌紅素的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。然而，發(fā)酵法生產(chǎn)靈菌紅素工業(yè)化進(jìn)程的關(guān)鍵瓶頸在于較低的產(chǎn)量和產(chǎn)率，為進(jìn)一步加快微生物發(fā)酵法生產(chǎn)靈菌紅素的進(jìn)程，今后的研究應(yīng)該從以下幾個(gè)方面展開(kāi)：1) 繼續(xù)選育高產(chǎn)菌株：目前靈菌紅素的發(fā)酵研究主要集中在沙雷氏菌屬，自然界這個(gè)微生物多樣性巨大寶庫(kù)尚未完全打開(kāi)，從自然界中篩選穩(wěn)定高產(chǎn)的靈菌紅素產(chǎn)生菌仍然是提高靈菌紅素產(chǎn)量的有效方法；2) 繼續(xù)深入研究靈菌紅素合成途徑中的關(guān)鍵酶：靈菌紅素的生物合成涉及10多個(gè)酶的催化，各個(gè)酶的催化機(jī)制及其在靈菌紅素合成過(guò)程中的重要性并未完全揭示，利用基因工程技術(shù)提高關(guān)鍵酶的活性有利于靈菌紅素的產(chǎn)量；3) 代謝工程改造：目前，代謝工程技術(shù)應(yīng)用在微生物生產(chǎn)靈菌紅素的研究鮮見(jiàn)報(bào)道，通過(guò)代謝工程改造可以增強(qiáng)靈菌紅素合成基因簇及其正調(diào)控因子的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，抑制或削弱負(fù)調(diào)控因子的表達(dá)，從而有效提高微生物的靈菌紅素產(chǎn)量；4) 發(fā)酵和提取工藝優(yōu)化：繼續(xù)優(yōu)化靈菌紅素發(fā)酵條件，采用原位分離發(fā)酵技術(shù)提高靈菌紅素的產(chǎn)率。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Progress in microbial production of prodigiosin

Zhongyu You, Yujie Wang, Shiqing Sun, and Xiaoxia Liu

,,,314001,,

Prodigiosin is an important natural red pigment that is produced as a secondary metabolite by microorganisms, and has great potential applications in the field of pharmaceutical development, environmental management and dye preparation. This paper reviews recent research progress in the production of prodigiosin by microbial fermentation, including discovery and modification of the prodigiosin-producing microorganisms, regulation and optimization of prodigiosin fermentation and extraction process, and resolution of biosynthetic pathway of prodigiosin and related transcriptional regulation. Finally, we discussed the future research directions in microbial production of prodigiosin.

prodigiosin, fermentation, strain breeding, optimization and regulation, synthesis pathway, transcriptional regulation

January 19, 2016; Accepted: April 18, 2016

Xiaoxia Liu. Tel: +86-573-83646246; E-mail: sunliuxx@163.com

Supported by:National Natural Science Foundation of China (No.31100053), Natural Science Foundation of Zhejiang Province (No.LQ14C050002), Public Welfare Technology Applied Research Projects of Zhejiang Province (No.2014C31046), Open Project of Key Laboratory of Yarn Material Molding and Composite Processing Technology of Zhejiang Province (No. MTC2014-007), Project of Jiaxing Science and Technology (No. 2014BY15001).

國(guó)家自然科學(xué)基金 (No.31100053)，浙江省自然科學(xué)基金 (No.LQ14C050002)，浙江省公益性技術(shù)應(yīng)用研究計(jì)劃項(xiàng)目 (No.2014C31046)，浙江省紗線材料成型與復(fù)合加工技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放項(xiàng)目 (No.MTC2014-007)，嘉興市科技項(xiàng)目 (No. 2014BY15001) 資助。