白仁惠，張?jiān)撇?，王春迪，張斐洋，張喆，孫付保，張震宇

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里氏木霉Cel5A基因優(yōu)化及其在畢赤酵母中的高效表達(dá)

白仁惠1,2，張?jiān)撇?，王春迪1，張斐洋3，張喆3，孫付保1，張震宇1

1 江南大學(xué)生物工程學(xué)院工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫 214122;2 南京林業(yè)大學(xué)江蘇省生物質(zhì)綠色燃料與化學(xué)品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京 210037;3 河南天冠企業(yè)集團(tuán)有限公司車用生物燃料技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南南陽 473000

內(nèi)切纖維素酶Cel5A缺乏是限制纖維素酶制劑高效酶解天然纖維素的關(guān)鍵因素。本文嘗試構(gòu)建高效表達(dá)里氏木霉Cel5A的畢赤酵母重組菌株以彌補(bǔ)目前Cel5A的天然分泌不足，通過基因密碼子偏好性優(yōu)化里氏木霉Cel5A基因和構(gòu)建表達(dá)載體pPIC9K-，并將其電轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115以構(gòu)建重組子，利用濃度梯度平板和搖瓶發(fā)酵篩選獲得一株高產(chǎn)畢赤酵母菌株GS115-EG Ⅱ。重組酶的酶學(xué)性質(zhì)分析顯示，該酶分子量50 kDa、最適pH (pH 4.5) 略有降低及最適反應(yīng)溫度為60 ℃，專一性地作用于非結(jié)晶纖維素，與天然里氏木霉Cel5A并無明顯區(qū)別。通過搖瓶發(fā)酵的初步優(yōu)化，該菌搖瓶培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度28 ℃、起始 pH 5.0、接種量2%、每24 h添加甲醇1.5% (/)、每24 h添加山梨醇4 g/L及吐溫80添加4 g/L，發(fā)酵192 h重組酶酶活達(dá)到24.0 U/mL。進(jìn)一步上罐(5 L) 發(fā)酵180 h，該重組酶Cel5A酶活高達(dá)270.9 U/mL，蛋白含量達(dá)到4.16 g/L。重組畢赤酵母GS115-EG Ⅱ是一株適合于外源表達(dá)Cel5A的工程菌，該重組酶可替代天然分泌Cel5A適用于當(dāng)前酶基生物煉制模式下木質(zhì)纖維素基質(zhì)高效水解中。

畢赤酵母GS115-EG Ⅱ，里氏木霉Cel5A基因，AOX1啟動(dòng)子，密碼子偏好性，發(fā)酵優(yōu)化，CMC酶活

微生物酶法生物煉制工藝的關(guān)鍵步驟之一是如何經(jīng)濟(jì)高效地水解纖維素/半纖維素組分為可發(fā)酵性糖，纖維素酶成本過高仍然是阻礙該生物煉制商業(yè)化推進(jìn)的關(guān)鍵因素[1]。目前商業(yè)纖維素酶主要來源于真菌里氏木霉及其變種，酶蛋白種類多達(dá)80余種[2]，其中除了存在大量的不起作用的雜蛋白外，纖維素酶蛋白種類和比例相對(duì)較單一，難以滿足不同來源 (種屬和預(yù)處理) 基質(zhì)特異性需求，酶蛋白間協(xié)同能力相對(duì)較低，從而導(dǎo)致酶載量增加，酶解效率降低[3]。針對(duì)該問題，國(guó)內(nèi)外研究者們開展了外加酶蛋白 (復(fù)合酶) 和纖維素酶制劑重新定制的探索，取得了顯著進(jìn)展[4]。

纖維素酶核心酶組分Cel5A主要產(chǎn)自真菌里氏木霉，其含量占纖維素酶總蛋白比例不足10%[5]。Cel5A對(duì)纖維素長(zhǎng)鏈內(nèi)部β-1,4糖苷鍵進(jìn)行有效水解從而促進(jìn)纖維素糖化，所以可用于羊毛和棉織物等纖維素材料的表面處理，使其更為柔順，用于牛仔布料能產(chǎn)生良好的脫色與石磨效應(yīng)[6-8]?？梢姡绾潍@得充足的纖維素酶蛋白Cel5A具有重要的應(yīng)用價(jià)值。國(guó)內(nèi)外研究者們?cè)谖⑸锛夹g(shù)層面上進(jìn)行了廣泛研究，其中，異源表達(dá)效果引起了人們廣泛關(guān)注。就細(xì)菌方面而言，Nakazawa等將里氏木霉Cel5A基因成功在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá)，搖瓶培養(yǎng)后得到胞內(nèi)CMC比酶活3.7 U/mg[9]。但由于大腸桿菌所產(chǎn)蛋白為胞內(nèi)蛋白，后續(xù)提純工作繁雜，且Cel5A基因來源于真菌，許多研究者將其置于真菌表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行異源表達(dá)。Boonvitthya等將Cel5A基因成功在解脂耶氏酵母中實(shí)現(xiàn)異源表達(dá)，搖瓶培養(yǎng)后酶活為6 U/mL[10]。du Plessis等將Cel5A基因成功在釀酒酵母中實(shí)現(xiàn)異源表達(dá)，并利用培養(yǎng)基成分優(yōu)化以及分別與Cel7A、Cel7B基因共表達(dá)用以提高Cel5A酶活，搖瓶培養(yǎng)后得到最終酶活22.3 U/mL[11]。然而，盡管研究人員在這些真菌中實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá)，但由于宿主過度的翻譯后修飾作用 (如糖基化) 導(dǎo)致異源表達(dá)酶活處于較低水平。于是，研究者們嘗試以畢赤酵母作為宿主進(jìn)行Cel5A表達(dá)。喬宇等將天然Cel5A基因?qū)氘叧嘟湍?，搖瓶誘導(dǎo)培養(yǎng)后CMC酶活為8.7 U/mL[12]。鄭海英等對(duì)含天然Cel5A基因的重組畢赤酵母進(jìn)行搖瓶?jī)?yōu)化后CMC酶活達(dá)到23.1 U/mL[13]。Boonvitthya等進(jìn)一步將天然Cel5A基因?qū)氘叧嘟湍福瑩u瓶誘導(dǎo)培養(yǎng)后CMC酶活最高可達(dá) 70 U/mL[10]。Samanta等將天然Cel5A基因在畢赤酵母中進(jìn)行表達(dá)，搖瓶初步優(yōu)化后CMC酶活可達(dá)130 U/mL[14]。這些研究表明，畢赤酵母是異源表達(dá)Cel5A的合適宿主，但目前這些研究大多是將Cel5A天然基因?qū)氘叧嘟湍钢性趽u瓶水平上開展工作，總體產(chǎn)酶水平仍不高，尤其國(guó)內(nèi)這方面工作還很有限。

基于此，本文首先對(duì)里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶Cel5A基因?qū)崿F(xiàn)基因優(yōu)化處理 (密碼子偏好性優(yōu)化，GC含量調(diào)整以及mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)優(yōu)化)，然后將優(yōu)化后的基因在AOX1啟動(dòng)子調(diào)控下在畢赤酵母中實(shí)現(xiàn)異源表達(dá)，通過多拷貝篩選獲得目的菌株。檢驗(yàn)其酶學(xué)性質(zhì)后對(duì)其主要培養(yǎng)條件進(jìn)行搖瓶?jī)?yōu)化以獲得較高酶活，最后對(duì)重組菌株實(shí)現(xiàn)上罐發(fā)酵。

1 材料與方法

1.1 材料

畢赤酵母GS115 ()、大腸桿菌DH5α和大腸桿菌JM109等菌株為本實(shí)驗(yàn)室保存。質(zhì)粒pPIC9K購(gòu)自Invitrogen公司。限制性內(nèi)切酶、連接酶和聚合酶購(gòu)自TaKaRa-寶生物工程(大連) 有限公司。細(xì)菌/真菌培養(yǎng)基成分與遺傳霉素G-418等抗生素購(gòu)自生工生物工程上海 (股份) 有限公司。

1.2 菌株培養(yǎng)

大腸桿菌培養(yǎng)基為L(zhǎng)B，配制平板時(shí)加入1.8%瓊脂。畢赤酵母采用YPD培養(yǎng)，其重組菌篩選采用MD平板，搖瓶發(fā)酵采用BMMY (www.invitrogen.com/content/sfs/manuals/easyselecte man.pdf)。大腸桿菌平板培養(yǎng)時(shí)于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行，搖瓶培養(yǎng)于旋轉(zhuǎn)式搖床(37 ℃、220 r/min)上進(jìn)行。

大腸桿菌培養(yǎng)：將大腸桿菌接入LB培養(yǎng)基中于37 ℃、220 r/min培養(yǎng)過夜，用于質(zhì)粒提取。

畢赤酵母培養(yǎng)：將重組菌單菌落接入30 mL體積YPD中于30 ℃、250 r/min培養(yǎng)過夜至600=5，然后以1% (/) 接種量轉(zhuǎn)接至50 mL (500 mL三角瓶) BMMY中發(fā)酵產(chǎn)酶，每24 h添加甲醇至終濃度為1.5% (/) 以誘導(dǎo)產(chǎn)酶。

1.3 目的基因優(yōu)化

利用軟件Gene Designer (DNA2.0，Menlo Park，CA，USA) 對(duì)來源于里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶Ⅱ (Cel5A) 基因(GenBank Accession No. DQ178347.1) 進(jìn)行密碼子優(yōu)化。然后用軟件RNAstructure預(yù)測(cè)經(jīng)密碼子優(yōu)化后目的基因二級(jí)結(jié)構(gòu)，通過少數(shù)密碼子同義替換將起始密碼子端堿基呈現(xiàn)開環(huán)結(jié)構(gòu)，并調(diào)整目的基因GC含量在40%–50%。最后在優(yōu)化的目的基因5′端添加R Ⅰ酶切位點(diǎn)，在3′端添加Ⅰ酶切位點(diǎn)，送至上海旭冠生物技術(shù)發(fā)展有限公司進(jìn)行全基因合成。

1.4 表達(dá)載體構(gòu)建及其電轉(zhuǎn)化

將合成的目的基因通過R Ⅰ與Ⅰ酶切位點(diǎn)克隆在穿梭質(zhì)粒pPIC9K上，以Ⅰ作為線性化位點(diǎn)酶切后進(jìn)行濃縮，用大約2 μg線性化質(zhì)粒與畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞混合，在2 mm電擊杯中冰浴15 min，電擊參數(shù)設(shè)置為2.5 kV與5 ms。電擊后將1 mL冰浴后的1 mol/L山梨醇加入電擊杯混勻，涂MD平板篩選轉(zhuǎn)化子。

1.5 高產(chǎn)菌株篩選

首先利用抗性濃度梯度篩選轉(zhuǎn)化子，將含有重組質(zhì)粒pPIC9K-轉(zhuǎn)化子點(diǎn)在遺傳霉素G-418抗性濃度分別為0、2和4 mg/mL的YPD平板上實(shí)現(xiàn)篩選。然后將能在高濃度抗性平板上正常生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化子接入發(fā)酵培養(yǎng)基中實(shí)現(xiàn)產(chǎn)酶，用以進(jìn)行高產(chǎn)菌株篩選。其中搖瓶培養(yǎng)做3個(gè)平行，標(biāo)準(zhǔn)差在圖中以誤差線標(biāo)示。

1.6 分析測(cè)定

實(shí)驗(yàn)中按照先前報(bào)道方法對(duì)重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析[15]。以羧甲基纖維素作為底物測(cè)定Cel5A酶活，方法如下：測(cè)定樣為200 μL 1% (/) CMC底物(pH 4.8) 與100 μL發(fā)酵液上清混合，空白對(duì)照為200 μL檸檬酸緩沖液 (50 mmol/L，pH 4.8) 與100 μL發(fā)酵液上清混合?；旌弦涸?0 ℃反應(yīng)30 min后加入300 μL 3,5-二硝基水楊酸溶液沸水浴5 min，加入 3.9 mL H2O，混合均勻后在540 nm測(cè)定吸光值。酶活單位(U) 定義：1個(gè)酶活力單位是指在50 ℃與pH 4.8的條件下，每分鐘產(chǎn)生1微摩爾葡萄糖所對(duì)應(yīng)的酶量。以微晶纖維素和水楊苷分別作為底物測(cè)定Cel5A相應(yīng)酶活時(shí)，分別以微晶纖維素和水楊苷替代CMC，用上述相同步驟進(jìn)行測(cè)定，其中微晶纖維素水解反應(yīng)時(shí)間為 1 h。以濾紙(Whatman Filter Paper No. 1) 作底物測(cè)定Cel5A酶活時(shí)，將50 mg濾紙條置于 200 μL檸檬酸緩沖液(50 mmol/L，pH 4.8) 作為反應(yīng)底物，除混合物反應(yīng)時(shí)間為1 h外其他測(cè)定方法與CMC酶活測(cè)定方法相同。

蛋白含量測(cè)定方法采用考馬斯亮藍(lán)法(Bradford)，測(cè)定管為0.8 mL NaCl溶液 (0.15 mol/L) 與0.2 mL酶液混合，混勻后加入5 mL考馬斯亮藍(lán)試劑，對(duì)照為1 mL NaCl溶液(0.15 mol/L) 與5 mL考馬斯亮藍(lán)混合物，測(cè)定混合液595值。

1.7 酶學(xué)性質(zhì)分析

外源表達(dá)Cel5A最適反應(yīng)pH：測(cè)定不同pH (pH 3.0–8.0) 檸檬酸緩沖液 (50 ℃、反應(yīng) 30 min) 對(duì)應(yīng)CMC酶活。考察最適反應(yīng)溫度：測(cè)定不同反應(yīng)溫度40–80 ℃下檸檬酸緩沖液 (pH 4.8、反應(yīng)30 min) 對(duì)應(yīng)CMC酶活。酶蛋白熱穩(wěn)定性：不同溫度(40–80 ℃) 時(shí)每隔10 min取樣測(cè)定CMC酶活。重組蛋白底物特異性：按CMC酶活測(cè)定方法，以不同底物 (Avicel，D-(-)-Salicin與Filter paper) 替代CMC測(cè)定相對(duì)應(yīng)酶活。測(cè)定重組蛋白反應(yīng)動(dòng)力學(xué)時(shí)底物濃度為0.1%–2.5% (/)，反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)m和max利用軟件GraphPad Prism 5進(jìn)行計(jì)算。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)值均做3個(gè)平行，標(biāo)準(zhǔn)差在圖中以誤差線標(biāo)示。

1.8 單因素?fù)u瓶?jī)?yōu)化

基于上述畢赤酵母培養(yǎng)方法，保持其他條件不變，優(yōu)化接種量時(shí)考察接種量為1%、2%、3%和4%時(shí)重組菌產(chǎn)酶能力；優(yōu)化培養(yǎng)基pH時(shí)考察培養(yǎng)基pH 4、pH 5、pH 6和pH 7時(shí)重組菌產(chǎn)酶能力；優(yōu)化培養(yǎng)溫度時(shí)考察溫度為24 ℃、26 ℃、28 ℃和30 ℃時(shí)重組菌產(chǎn)酶能力；優(yōu)化甲醇添加量時(shí)考察每24 h添加甲醇至終濃度0.5%、1%、1.5%、2%和2.5%時(shí)重組菌產(chǎn)酶能力，它們分別培養(yǎng)144 h后對(duì)其菌濃度與酶活進(jìn)行測(cè)定；優(yōu)化碳源時(shí)，在每24 h添加甲醇至終濃度為1.5%時(shí)考察每24 h添加碳源 (山梨醇、甘露醇、葡萄糖及甘油) 至終濃度4 g/L，培養(yǎng) 72 h，測(cè)定其酶活與生物量；考察非離子表面活性劑時(shí)，在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加4 g/L吐溫20、4 g/L吐溫80、0.5 g/L Triton X-100、2 g/L PEG2000、2 g/L PEG4000、2 g/L PEG6000、2 g/L PEG10000和2 g/L PEG20000，培養(yǎng)192 h，測(cè)定酶活。所有優(yōu)化均采用單因素優(yōu)化，均在 500 mL三角瓶?jī)?nèi)完成，裝液量為50 mL。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)值均做3個(gè)平行，標(biāo)準(zhǔn)差在圖中以誤差線標(biāo)示。

1.9 上罐發(fā)酵

該培養(yǎng)在5 L發(fā)酵罐 (上海萬木春生物工程有限公司，型號(hào)WMC-9005A/T) 里進(jìn)行，采用無機(jī)鹽培養(yǎng)基 (工作體積1.5 L)，配方參考(http:// tools. thermofisher. com/content/ sfs/manuals/ pichiaferm_prot.pdf)。YPD培養(yǎng)基上種子培養(yǎng)24 h后，按7.5%接種量接入發(fā)酵罐。在生長(zhǎng)階段，控制發(fā)酵罐溫度為30 ℃和轉(zhuǎn)速180 r/min培養(yǎng)16 h (600=30左右)，補(bǔ)加400 mL 50%甘油溶液 (含有12% PTM1) 作為碳源。繼續(xù)培養(yǎng) (大約在36 h) 至600=300時(shí)流加甲醇 (含12% PTM1) 進(jìn)入誘導(dǎo)階段，此時(shí)轉(zhuǎn)速提升至500 r/min，溫度降為28 ℃，此時(shí)起流速與DO相關(guān)聯(lián)，維持DO在25%左右誘導(dǎo)培養(yǎng)144 h。期間每12 h取樣測(cè)定600、發(fā)酵上清液酶活及蛋白含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)以畢赤酵母作為宿主菌株進(jìn)行研究，由于存在外源基因密碼子偏好性，導(dǎo)致外源基因天然密碼子在宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄和翻譯效率常受到不利影響，所以目的基因異源表達(dá)前常要進(jìn)行外源目的基因的優(yōu)化處理[16]。本文通過優(yōu)化密碼子偏好性、優(yōu)化mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)及調(diào)整GC含量等對(duì)里氏木霉葡聚糖內(nèi)切酶Ⅱ基因進(jìn)行優(yōu)化處理，以使目的基因更適合在畢赤酵母中異源表達(dá)。

在優(yōu)化密碼子偏好性時(shí)，利用軟件Gene Designer對(duì)里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶Ⅱ (Cel5A) 基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化。其中，目的基因含有自身信號(hào)肽，同樣也實(shí)現(xiàn)了密碼子偏好性優(yōu)化，并在優(yōu)化后基因5′端添加R Ⅰ酶切位點(diǎn)，在3′端添加Ⅰ酶切位點(diǎn)。優(yōu)化后基因密碼子與未優(yōu)化的相比較，結(jié)果如表1所示。針對(duì)畢赤酵母偏好性表，天然Cel5A基因序列中使用頻率低于20%的密碼子均進(jìn)行同義替換，以提高其異源表達(dá)效率。優(yōu)化后目的基因密碼子得到大幅度調(diào)整，其中284個(gè)堿基發(fā)生變化。

表1 Cel5A基因優(yōu)化前后密碼子使用頻率表

Kazusa: cited online http://www.kazusa.or.jp/ codon; Opt.: optimized; Wd.: native.

在轉(zhuǎn)錄與翻譯過程中基因在起始密碼子端二級(jí)結(jié)構(gòu)若呈現(xiàn)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，將會(huì)對(duì)30S核糖體有排斥作用，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄和翻譯效率降低[17]。因此，實(shí)驗(yàn)接著通過RNAstructure對(duì)目的基因mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè)和優(yōu)化。通過對(duì)起始密碼子端堿基進(jìn)行調(diào)整，并嚴(yán)格執(zhí)行密碼子同義替換，最終破壞基因起始密碼子端環(huán)狀結(jié)構(gòu)，使優(yōu)化后基因mRNA起始密碼子端二級(jí)結(jié)構(gòu)10個(gè)堿基呈開環(huán)結(jié)構(gòu)，有助于提高宿主對(duì)目的基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯效率，結(jié)果如圖1所示。

圖1 Cel5A基因mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

本實(shí)驗(yàn)在優(yōu)化密碼子偏好性的同時(shí)，通過手動(dòng)調(diào)整堿基對(duì)密碼子也進(jìn)行了同義替換，最終使目的基因GC含量從52.9%降至46.2%。一些研究認(rèn)為，基因序列中GC含量同樣影響基因轉(zhuǎn)錄和翻譯，GC含量控制在40%–50%有助于提高外源基因在畢赤酵母中表達(dá)效率[16]。本實(shí)驗(yàn)中目的基因優(yōu)化后GC含量為46.2%，與相關(guān)報(bào)道一致，這為提高后面的異源表達(dá)效率提供了可能。

2.2 含目的基因表達(dá)載體的構(gòu)建

本實(shí)驗(yàn)中選擇由甲醇嚴(yán)格調(diào)控的AOX1強(qiáng)啟動(dòng)子，為實(shí)現(xiàn)Cel5A基因在畢赤酵母中的異源表達(dá)，將目的基因插入穿梭質(zhì)粒pPIC9K上，插入位點(diǎn)在釀酒酵母α-因子信號(hào)肽下游，酶切位點(diǎn)為R Ⅰ與Ⅰ，并置于AOX1啟動(dòng)子下游。將構(gòu)建好的含目的基因的表達(dá)載體進(jìn)行單雙酶切驗(yàn)證，結(jié)果表明表達(dá)載體pPIC9K-構(gòu)建成功。

2.3 電轉(zhuǎn)化與平板篩選

為了將上述表達(dá)載體pPIC9K-導(dǎo)入畢赤酵母細(xì)胞以實(shí)現(xiàn)異源表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)中以Ⅰ作為線性化位點(diǎn)進(jìn)行酶切并濃縮，利用電轉(zhuǎn)化手段導(dǎo)入畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞，將優(yōu)化后目的基因整合至畢赤酵母染色體上，以獲得含目的基因的轉(zhuǎn)化子。最后將電擊后菌液涂布在不含組氨酸的篩選平板(MD) 上，在30 ℃下培養(yǎng)72 h共獲得80株轉(zhuǎn)化子。

平板篩選時(shí)將上述轉(zhuǎn)化子點(diǎn)到不同濃度的遺傳霉素G-418抗性梯度平板上，結(jié)果如圖2所示。所有轉(zhuǎn)化子在無遺傳霉素G-418抗性的YPD平板上均能生長(zhǎng)，當(dāng)濃度升至2 mg/mL時(shí)絕大部分轉(zhuǎn)化子可以生長(zhǎng)，當(dāng)濃度升至4 mg/mL時(shí)，僅剩12株具有生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。因此，以這12株菌株作為后續(xù)搖瓶篩選實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

2.4 搖瓶篩選及產(chǎn)酶驗(yàn)證

為獲得高產(chǎn)菌株，將上述平板篩選到的12株轉(zhuǎn)化子接至搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基上，培養(yǎng)192 h后進(jìn)行酶活與生物量測(cè)定 (圖3)。這12株重組菌均能在發(fā)酵培養(yǎng)基中生長(zhǎng)和產(chǎn)酶，其中66號(hào)菌株生長(zhǎng)較好，發(fā)酵192 h時(shí)菌濃最高，達(dá)到600=30；而且發(fā)酵液中酶活相對(duì)較高，CMC酶活近20 U/mL。這樣，本實(shí)驗(yàn)中選擇66號(hào)重組菌株作為后續(xù)研究對(duì)象，暫命名為GS115-EG Ⅱ表示。

圖2 高產(chǎn)Cel5A菌株的抗性平板篩選 (30 ℃培養(yǎng)48 h)

圖3 轉(zhuǎn)化子的搖瓶發(fā)酵篩選 (30 ℃培養(yǎng)192 h)

為了驗(yàn)證重組Cel5A已經(jīng)實(shí)現(xiàn)異源表達(dá)并且分泌在胞外，實(shí)驗(yàn)接著利用SDS-PAGE對(duì)GS115-EG Ⅱ發(fā)酵上清液進(jìn)行分析，結(jié)果表明轉(zhuǎn)化子.GS115-EG Ⅱ在搖瓶培養(yǎng)168 h的不同階段均分泌出一種蛋白，隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，該蛋白濃度越大。該蛋白分子量約50 kDa，這與先前一些關(guān)于里氏木霉天然Cel5A蛋白的報(bào)道是一致的[18]。另外，一些研究的畢赤酵母中表達(dá)的重組Cel5A蛋白大小與本文結(jié)果一致[10,19]。因此，結(jié)合前面所測(cè)酶活，我們認(rèn)為該蛋白是目標(biāo)酶蛋白Cel5A。

另外，由SDS-PAGE分析可知該重組菌目前分泌的重組蛋白是接近電泳純水平的，其發(fā)酵上清液可直接用于重組里氏木霉Cel5A酶酶學(xué)性質(zhì)分析，不需要繁瑣的蛋白純化手段。這與先前相關(guān)報(bào)道相一致，畢赤酵母本身無內(nèi)源性纖維素酶產(chǎn)生，產(chǎn)酶背景簡(jiǎn)單，可以直接獲得較純的目的蛋白酶液[20]。

2.5 重組蛋白酶學(xué)性質(zhì)分析

本實(shí)驗(yàn)接著以搖瓶發(fā)酵上清液中重組里氏木霉Cel5A酶直接進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)分析，包括重組Cel5A酶水解底物的最適溫度與pH、酶蛋白熱穩(wěn)定性、底物特異性以及酶學(xué)動(dòng)力學(xué)參數(shù)等。結(jié)果如圖4和表2所示，重組酶Cel5A最適反應(yīng)pH值為4.5，最適反應(yīng)溫度為60 ℃，耐熱性分析顯示溫度60 ℃時(shí)對(duì)該酶酶活無明顯影響，但溫度高于70 ℃時(shí)酶活下降非常明顯。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與其他天然Cel5A外源表達(dá)的相關(guān)報(bào)道基本一致[10,12,14]。酶學(xué)性質(zhì)表明，本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)里氏木霉Cel5A基因優(yōu)化后在畢赤酵母中表達(dá)的Cel5A與天然酶蛋白非常接近，可適用于當(dāng)前纖維素酶基生物煉制工業(yè)的天然纖維基質(zhì)酶解。

圖4 重組Cel5A酶學(xué)性質(zhì)

表2 重組Cel5A酶學(xué)性質(zhì)分析

Mw: molecular weight; T: optimum reaction temperature; stability (%): residual activity (%) after the incubation at 70 ℃ for 30 min.

另外，對(duì)重組酶底物特異性進(jìn)行分析可知重組酶對(duì)CMC有較強(qiáng)水解作用 (比酶活為58.82 U/mg)，但對(duì)微晶纖維素 (比酶活為 0.02 U/mg)、水楊苷 (無法檢測(cè)到酶活) 及濾紙水解力 (比酶活為0.05 U/mg) 較弱?？梢?，該重組酶蛋白與天然Cel5A相似，對(duì)無定型纖維素長(zhǎng)鏈有較強(qiáng)的水解作用，但對(duì)纖維素短鏈以及纖維素結(jié)晶區(qū)作用較弱[14]。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步以0.1%–2.5%濃度CMC為底物對(duì)重組Cel5A酶動(dòng)力學(xué)關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行測(cè)定，并利用曲線擬合軟件GraphPad Prism 5進(jìn)行計(jì)算，獲得該重組酶的m值為4.93 mg/mL，max值為275.9 μmol/(min·mg)。與先前報(bào)道相比[10,14]，本實(shí)驗(yàn)中所得Cel5A的最大反應(yīng)速度max與相關(guān)報(bào)道基本一致，但m值明顯大于相關(guān)報(bào)道的，初步推斷可能是目的基因經(jīng)過優(yōu)化后表達(dá)的Cel5A酶蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化，具體信息有待深入研究。

2.6 重組畢赤酵母搖瓶?jī)?yōu)化

發(fā)酵條件優(yōu)化是增加重組畢赤酵母菌產(chǎn)酶水平的重要手段[13]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)畢赤酵母GS115-EG Ⅱ發(fā)酵的培養(yǎng)基 (碳源、甲醇誘導(dǎo)物和添加劑) 和培養(yǎng)條件 (接種量、初始pH和培養(yǎng)溫度) 一些關(guān)鍵性參數(shù)進(jìn)行初步考察 (圖5)。如圖5A所示，當(dāng)接種量為2%時(shí)，該菌生物量最高(600=27.7)，相應(yīng)的CMC酶活也最高，達(dá)到19.8 U/mL。在培養(yǎng)基初始pH方面 (圖5B)，在pH 5時(shí)其生物量和酶活最高，分別為29.1及18.1 U/mL。培養(yǎng)溫度如圖5C所示，當(dāng)培養(yǎng)溫度為28 ℃時(shí)，其生物量600與酶活最高，分別為32.4與20.8 U/mL。

另外，誘導(dǎo)型系統(tǒng)中表達(dá)載體含有AOX1啟動(dòng)子，添加合適甲醇濃度能有效促進(jìn)重組菌產(chǎn)酶能力[21]。實(shí)驗(yàn)接著對(duì)培養(yǎng)基關(guān)鍵成分進(jìn)行考察。如圖5D所示，重組畢赤酵母生物量與酶活隨著甲醇濃度增加而增加，當(dāng)甲醇添加量為1.5% (/) 時(shí)，生物量與酶活達(dá)到最高水平，分別為28和20 U/mL。對(duì)碳源考察如圖5E所示，每24 h添加碳源均能促進(jìn)菌株生長(zhǎng)繁殖，其中葡萄糖效果最好，但添加葡萄糖未能提高酶活，而添加山梨醇和甘油在促進(jìn)菌體生長(zhǎng)繁殖同時(shí)也顯著增加了重組畢赤酵母菌產(chǎn)酶能力，且山梨醇相對(duì)于甘油在促進(jìn)酶活方面更有優(yōu)勢(shì)。該結(jié)果與早先的報(bào)道相符，Thorpe等[22]在比較混合碳源甘油/甲醇和山梨醇/甲醇對(duì)畢赤酵母外源表達(dá)重組蛋白影響時(shí)發(fā)現(xiàn)：相對(duì)于甘油，添加山梨醇導(dǎo)致畢赤酵母生物量稍低些，但其重組蛋白的產(chǎn)率提高明顯。于是，本實(shí)驗(yàn)接著對(duì)山梨醇添加量進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)當(dāng)山梨醇添加量為4 g/L時(shí)酶活提升最為明顯，達(dá)到 11.4 U/mL，比對(duì)照提高了28%。

圖5 重組畢赤酵母發(fā)酵產(chǎn)酶水平的初步搖瓶?jī)?yōu)化

此外，非離子表面活性劑能夠提高真菌細(xì)胞壁滲透性，從而提高目的蛋白的表達(dá)量[23]。實(shí)驗(yàn)也考察非離子表面活性劑對(duì)菌株GS115-EG Ⅱ產(chǎn)重組酶的影響，如圖5F所示。不同種類表面活性劑均對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)酶有積極作用，其中吐溫80作用效果最為明顯，使所表達(dá)酶活增加10%以上。進(jìn)一步對(duì)吐溫80添加量進(jìn)行選擇，發(fā)現(xiàn)在吐溫80添加量為4 g/L時(shí)重組菌株GS115-EG Ⅱ表達(dá)酶活最高，高達(dá)24.0 U/mL。

總之，本實(shí)驗(yàn)通過搖瓶?jī)?yōu)化，明顯提高了重組菌GS115-EG Ⅱ產(chǎn)酶能力，使酶活提高10%以上，達(dá)到24.0 U/mL。然而，目前搖瓶發(fā)酵獲得的CMC酶活不高。Samanta等將在畢赤酵母GS115中進(jìn)行表達(dá)和誘導(dǎo)培養(yǎng)48 h時(shí)達(dá)到最高酶活(75 U/mL)；進(jìn)一步在BMMH中誘導(dǎo)培養(yǎng)72 h的CMC酶活可達(dá)130 U/mL[14]。最近，Akbarzadeh等優(yōu)化Cel5A基因并在畢赤酵母GS115進(jìn)行表達(dá)，以1%甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)72 h，其重組Cel5A蛋白CMC酶活高達(dá) 2 358.8 U/mL，這是迄今為止公開報(bào)道的最高酶活[24]。

2.7 上罐發(fā)酵

鑒于搖瓶發(fā)酵時(shí)溶氧局限性，實(shí)驗(yàn)接著嘗試在發(fā)酵罐水平通過加強(qiáng)溶氧來提高重組菌GS115-EG Ⅱ的Cel5A表達(dá)水平，控制條件如圖6A所示。在上罐發(fā)酵過程中溶氧(DO) 反映甲醇消耗量，當(dāng)甲醇流加速率過高時(shí)DO值會(huì)過低，而甲醇添加速率過低時(shí)DO值會(huì)偏高[25]。本實(shí)驗(yàn)通過控制DO值來準(zhǔn)確地控制甲醇添加量以高效誘導(dǎo)重組畢赤酵母產(chǎn)酶，同時(shí)又不至于對(duì)菌體產(chǎn)生毒害作用。本文在誘導(dǎo)過程中維持DO值在25%上下，發(fā)酵pH值與溫度維持基本恒定。

如圖6B所示，在5 L發(fā)酵罐中重組菌在甘油補(bǔ)料階段(0–36 h) 生長(zhǎng)速度最快，當(dāng)甘油耗盡時(shí)(36 h) 生物量已達(dá)600=300；此時(shí)添加甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖放緩，但菌體量仍持續(xù)增加，直至發(fā)酵將近結(jié)束時(shí)生物量達(dá)到最高水平 (600接近700)。隨著甲醇添加量增加，CMC酶活不斷提升，180 h時(shí)酶活達(dá)到270.9 U/mL。同時(shí)，發(fā)酵上清液蛋白總量也在增加，在180 h達(dá)到4.16 g/L。另外，不同時(shí)間點(diǎn)的發(fā)酵上清液也進(jìn)行了SDS-PAGE電泳 (圖6B)，各上清液在大約50 kDa處均有一條清晰條帶，該條帶隨發(fā)酵進(jìn)行更加濃重清晰。這也表明，在發(fā)酵過程中目的蛋白表達(dá)量的確隨著發(fā)酵時(shí)間增加而顯著提高，與酶活增長(zhǎng)趨勢(shì)相一致。總之，本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)發(fā)酵罐參數(shù)的精確控制獲得了較高的菌體濃度及良好的菌體活性，從而為重組Cel5A蛋白的高效表達(dá)提供了可能。

3 討論

本文鑒于基因密碼子偏向性，通過密碼子偏向性優(yōu)化、二級(jí)結(jié)構(gòu)優(yōu)化與GC含量調(diào)整等手段實(shí)現(xiàn)目的基因優(yōu)化以期里氏木霉Cel5A在畢赤酵母中高效表達(dá)。既然國(guó)內(nèi)外研究人員已開展了原始Cel5A基因直接在畢赤酵母里外源表達(dá)的研究，本文就將密碼子優(yōu)化基因在畢赤酵母里表達(dá)后與已報(bào)到結(jié)果進(jìn)行比較。相對(duì)于天然基因直接表達(dá)，目的基因優(yōu)化后外源表達(dá)存在著高效表達(dá)潛力；從本文結(jié)果和已報(bào)道文獻(xiàn)看，目的基因優(yōu)化后表達(dá)比天然基因直接表達(dá)的酶活相對(duì)高一些[12-13]。因此，目的基因序列的合理優(yōu)化和轉(zhuǎn)化子的有效篩選是獲得高效表達(dá)重組菌的關(guān)鍵。

圖6 畢赤酵母GS115-EG Ⅱ上罐發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

畢赤酵母具有特殊的整合方式，通過電轉(zhuǎn)化合成大量轉(zhuǎn)化子的目的基因拷貝數(shù)是不同的，能在高濃度抗性平板上正常生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化子所含目的基因拷貝數(shù)通常較高[14]。文獻(xiàn)[26]表明，重組畢赤酵母菌株中所含目的基因拷貝數(shù)能夠影響其產(chǎn)酶能力，目的基因拷貝數(shù)增多時(shí)表達(dá)量能顯著提升，但過多的拷貝數(shù)也無助于酶蛋白高效表達(dá)。本文中以Ⅰ作為線性化位點(diǎn)使線性化質(zhì)粒載體中的AOX1基因與畢赤酵母染色體上AOX1基因進(jìn)行替換與整合，有可能獲得多拷貝轉(zhuǎn)化子，進(jìn)一步通過高濃度抗性平板篩選獲得高產(chǎn)轉(zhuǎn)化子可能性較大。本文在4 mg/mL抗性平板上完成重組畢赤酵母GS115-EG Ⅱ篩選，該菌株有可能是高拷貝重組菌。

重組畢赤酵母GS115-EG Ⅱ分泌表達(dá)的重組酶與天然里氏木霉分泌Cel5A酶蛋白在酶學(xué)性質(zhì)上沒有明顯差異，表明重組畢赤酵母GS115-EG Ⅱ是適合外源表達(dá)Cel5A的工程菌，該重組酶適用于彌補(bǔ)里氏木霉菌株天然分泌Cel5A不足，可用于當(dāng)前酶基生物煉制模式下的木質(zhì)纖維素基質(zhì)高效水解中。

重組畢赤酵母GS115-EG Ⅱ搖瓶發(fā)酵優(yōu)化后Cel5A酶表達(dá)量增加并不理想(< 15%)，通過上罐發(fā)酵實(shí)現(xiàn)了重組畢赤酵母菌株GS115-EG Ⅱ高效分泌，其CMC酶活達(dá)到270.9 U/mL，蛋白含量達(dá)到4.16 g/L。與天然里氏木霉發(fā)酵液相比，其酶活分別是Culbertson等[27]與Ahamed等[28]報(bào)道里氏木霉發(fā)酵液CMC酶活的150倍和64.5倍，表明畢赤酵母是異源表達(dá)里氏木霉內(nèi)切酶基因Cel5A的合適宿主。李紅等[29]在5 L罐水平里進(jìn)行過含原始Cel5A基因重組畢赤酵母的外源表達(dá)，甲醇誘導(dǎo)48 h后CMC酶活為15.6 U/mL，遠(yuǎn)低于本文所獲得的結(jié)果。然而國(guó)外新近報(bào)道(Akbarzadeh等[24]) Cel5A基因優(yōu)化后導(dǎo)入畢赤酵母GS115構(gòu)建的重組菌，以1%甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)72 h，其重組Cel5A蛋白CMC酶活高達(dá)2 358.8 U/mL，這是迄今為止公開報(bào)道的最高酶活。如若屬實(shí)，將使畢赤酵母外源表達(dá)Cel5A商業(yè)化成為可能。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Gene optimization and efficient expression ofCel5A in

Renhui Bai1,2, Yunbo Zhang1, Chundi Wang1, Feiyang Zhang3, Zhe Zhang3, Fubao Sun1, and Zhenyu Zhang1

1 Laboratory of Industrial Biotechnology of Department of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China;2 Jiangsu Key Laboratory of Biomass-based Green Fuels and Chemicals, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, Jiangsu, China;3 State Key Laboratory of Motor Vehicle Biofuel Technology, Henan Tianguan Group Co., Ltd, Nanyang 473000, Henan, China

Deficient activity of endo-1,4-beta-glucanaseII (Cel5A) secreted byis one of the challenges involved in effective cellulase saccharification of cellulosic substrates. Therefore, we expressed Cel5A inby constructing a recombinant strain. With the gene optimization based on codon bias, and the construction of expression vector pPIC9K-, the optimized gene was electro-transformed intoGS115 to form transformants. Then, a high Cel5A activity producing recombinant, namelyGS115-EG Ⅱ, was selected on G-418 resistant plates, followed by shake-flask cultivation. Enzyme characterization showed that the recombinant Cel5A reacted optimally at pH 4.5 and 60 ℃, with 50 kDa of molecular weight, preferentially degrading amorphous cellulose. Recombinant Cel5A was not significantly different from the nativeCel5A. Moreover, a shake-flask fermentation of the recombinant strain was optimized as below: incubation temperature 28 ℃, initial pH 5.0, inoculum volume 2%, methanol addition (per 24 h) 1.5% (/), sorbitol addition (per 24 h) 4 g/L and Tween 80 4 g/L. Under above optimized condition, the recombinant produced 24.0 U/mL of the Cel5A after 192 h fermentation. When incubated in a 5 L fermentation, Cel5A enzyme activity reached 270.9 U/mL at 180 h, with 4.16 g/L of the total protein. The study indicates that the recombinant strainGS115-EG Ⅱ is extremely suitable for heterologous expression ofcellulase Cel5A. And the recombinant Cel5A can be used as an alternative to the nativeCel5A in development of a commercially relevant enzyme based biorefinery process.

GS115-EG Ⅱ,Cel5A gene, AOX1 promoters, codon bias, fermentation optimization, CMC enzyme activity

January 9, 2016; Accepted: March 4, 2016

Fubao Sun. Tel/Fax: +86-510-85327026; E-mail: fubaosun@jiangnan.edu.cn

Supported by:National Natural Science Foundation of China (No. 21176106), State Key Laboratory of Motor Vehicle Biofuel Technology (No. KFKT2013010), China Postdoctoral Science Foundation (No. 2015M571666), Jiangsu Key Lab of Biomass-based Green Fuels and Chemicals (No. JSBGFC14006).

國(guó)家自然科學(xué)基金(No. 21176106)，車用生物燃料技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金(No. KFKT2013010)，中國(guó)博士后科學(xué)基金(No. 2015M571666)，江蘇省生物質(zhì)綠色燃料與化學(xué)品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室課題(No. JSBGFC14006) 資助。