黃　軍，吳開(kāi)杰，惠　珂，王　彬，王新陽(yáng)，賀大林

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科，陜西西安　710061)

?

·基礎(chǔ)研究·

miR-93真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其表達(dá)驗(yàn)證

黃軍，吳開(kāi)杰，惠珂，王彬，王新陽(yáng)，賀大林

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科，陜西西安710061)

目的構(gòu)建人miR-93真核表達(dá)載體，并驗(yàn)證其表達(dá)效果，為進(jìn)一步研究miR-93的生物學(xué)功能提供有利工具。方法用PCR方法從293T細(xì)胞基因組DNA中擴(kuò)增miR-93前體序列，引物引入酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基，產(chǎn)物用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRⅠ和BglⅡ雙酶切后插入pEZX-MR04表達(dá)載體中，構(gòu)建miR-93真核表達(dá)載體pEZX-MR04-miR-93。構(gòu)建好的載體用雙酶切、PCR和測(cè)序鑒定，同時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，用Real time PCR檢測(cè)重組pEZX-MR04-miR-93質(zhì)粒的miR-93表達(dá)效率。結(jié)果成功構(gòu)建miR-93真核表達(dá)載體pEZX-MR04-miR-93，重組pEZX-MR04-miR-93質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后miR-93表達(dá)上升約21倍。結(jié)論構(gòu)建的miR-93真核表達(dá)載體pEZX-MR04-miR-93可顯著上調(diào)細(xì)胞中miR-93水平，為進(jìn)一步研究miR-93在泌尿系腫瘤中的生物學(xué)功能提供可靠工具，奠定了堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

miR-93；表達(dá)載體；pEZX-MR04；293T

微小RNA(microRNA，miR)是一類(lèi)廣泛存在于生物體內(nèi)的長(zhǎng)度約為19～25個(gè)堿基的單鏈非編碼RNA，自被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，數(shù)以千計(jì)的microRNA相繼被報(bào)道并研究。越來(lái)越多的研究證實(shí)，microRNA可廣泛參與生物體的各項(xiàng)生物學(xué)行為，包括腫瘤的進(jìn)展、生物體的發(fā)育、心腦血管疾病、骨關(guān)節(jié)炎等。人miR-93由7號(hào)染色體編碼，自2008年被首次報(bào)道參與T細(xì)胞白血病進(jìn)展起[1]，miR-93在多種疾病如川崎病[2]、心肌缺血再灌注[3]、肥胖[4]、腫瘤、腦創(chuàng)傷[5]、糖尿病[6]等中相繼被報(bào)道。尤其在腫瘤中miR-93發(fā)揮著不同的作用。在結(jié)直腸癌患者標(biāo)本中，miR-93的表達(dá)明顯高于復(fù)發(fā)患者，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-93可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和遷移，并下調(diào)細(xì)胞周期蛋白B1(cyclin B1， CCNB1)、ERBB2、p21和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor， VEGF)等的表達(dá)[7]。而在胃癌[8]、鼻咽癌[9]、肝癌[10]、乳腺癌[11]、肺癌[12]等腫瘤中，miR-93可通過(guò)靶向調(diào)控PDCD4、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體2，(transforming growth factor beta receptor 2，TGFβR2)、PTEN、周期依賴(lài)性激酶抑制劑1A(cyclin dependent kinase inhibitor 1A，CDKN1A)、轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2， NRF2)、DAB2等進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。可見(jiàn)，miR-93在不同的疾病中扮演著不同的角色，但其在泌尿系腫瘤中的作用尚不明確。因此，進(jìn)一步的深入研究miR-93在泌尿系腫瘤發(fā)生、發(fā)展的作用及其機(jī)制顯得尤為重要。本研究旨在構(gòu)建人miR-93的真核表達(dá)載體，并驗(yàn)證其表達(dá)效率，以期為后續(xù)深入研究miR-93提供穩(wěn)定而有利的工具，奠定后續(xù)研究的基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料pEZX-MR04對(duì)照質(zhì)粒(pEZX-MR04-miR-con)購(gòu)自美國(guó)GeneCopoeia公司，DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京天根生化科技有限公司，293T細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的達(dá)爾伯克必需基本培養(yǎng)基(DMEM)中，置于37℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。X-TremeGENE HP DNA Transfection Reagent購(gòu)自Roche公司?；蚪MDNA提取試劑盒、高保真DNA聚合酶、限制性?xún)?nèi)切酶、T4 DNA連接酶均購(gòu)自TaKaRa公司，膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司，Trizol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，miScript II RT Kit和miR-93實(shí)時(shí)定量PCR引物購(gòu)自QIAGEN。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1引物合成從“miRBase”、NCBI和“Ensemble”分別獲取miR-93成熟體序列、Pre-miR-93序列及其兩側(cè)約100 nt的側(cè)翼序列，依據(jù)該序列由Primer-BLAST設(shè)計(jì)PCR引物，引入酶切位點(diǎn)EcoRⅠ、BglⅡ和保護(hù)堿基，同時(shí)合成pEZX-MR04上下游測(cè)序引物。引物由蘇州金唯智公司合成。Pri-miR-93 forward primer: 5′-GAAGATCTACCTTCACTGAGAGGGTGGT-3′，Pri-miR-93 reverse primer: 5′-CGGAATTCACCAGACCCTTTTGAACGCC-3′，測(cè)序引物序列由GeneCopoeia公司提供，pEZX-MR04 forward primer:5′-CCGACAACCACTACCTGA-3′，pEZX-MR04 reverse primer: 5′-ATTGTGGATGAATACTGCC-3′。

1.2.2重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定從293T細(xì)胞提取基因組DNA，利用Pri-miR-93 forward primer和Pri-miR-93 reverse primer引物擴(kuò)增目的基因片段，反應(yīng)條件為：98 ℃ 10 s，55 ℃ 5 s，72 ℃ 20 s；共30個(gè)循環(huán)。之后用3%瓊脂糖凝膠電泳，將含288 bp目的片段的膠回收后用EcoRⅠ和BglⅡ進(jìn)行雙酶切。pEZX-MR04對(duì)照質(zhì)粒用EcoRⅠ和BglⅡ雙酶切后回收線性化空載體。將目的片段和線性化空載體于16℃連接過(guò)夜后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含Amp的LB培養(yǎng)皿上，置于37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。隨機(jī)挑取10個(gè)菌落于LB液體培養(yǎng)基中37 ℃搖菌過(guò)夜，抽提質(zhì)粒后用EcoRⅠ和BglⅡ雙酶切鑒定，并利用pEZX-MR04 forward primer和pEZX-MR04 reverse primer進(jìn)行PCR擴(kuò)增片段電泳鑒定。對(duì)上述步驟鑒定正確的克隆進(jìn)一步測(cè)序鑒定。

1.2.3293T細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前一天，將3×105293T細(xì)胞接種于6孔板，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)70%時(shí)用X-TremeGENE HP DNA Transfection Reagent進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，pEZX-MR04對(duì)照質(zhì)粒作為陰性對(duì)照。培養(yǎng)48 h后，用TRIzol提取總RNA，用miScript II RT Kit對(duì)包含microRNA的總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)定量PCR，實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 30 s，后進(jìn)入30個(gè)循環(huán)重復(fù)(95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s)。U6作為內(nèi)參引物。

2　結(jié)　果

2.1基因組中對(duì)應(yīng)miR-93的目的基因片段PCR擴(kuò)增PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用3%瓊脂糖凝膠電泳，在約300 bp處可見(jiàn)一特異性擴(kuò)增條帶，與預(yù)測(cè)值大小相符(圖1)。

圖1　基因組中對(duì)應(yīng)miR-93的目的基因片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定

Marker：DNA marker (50 bp DNA 標(biāo)記)；1：基因組中對(duì)應(yīng)miR-93的目的基因片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(288 bp)

2.2重組質(zhì)粒pEZX-MR04-miR-93的雙酶切鑒定重組質(zhì)粒pEZX-MR04-miR-93用EcoRⅠ和BglⅡ雙酶切后，用3%瓊脂糖凝膠電泳，雙酶切產(chǎn)物在288 bp處可見(jiàn)一特異性條帶，與預(yù)期相符(圖2)。同時(shí)未酶切pEZX-MR04-miR-93質(zhì)?？梢?jiàn)超螺旋結(jié)構(gòu)、線性結(jié)構(gòu)和環(huán)形結(jié)構(gòu)顯影，pEZX-MR04-miR-93質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物在未酶切產(chǎn)物超螺旋結(jié)構(gòu)和環(huán)形結(jié)構(gòu)間可見(jiàn)一特異性條帶，與預(yù)期相符。

2.3重組質(zhì)粒pEZX-MR04-miR-93的PCR鑒定分別取1 ng重組質(zhì)粒pEZX-MR04-miR-93和pEZX-MR04-miR-con做模板，用pEZX-MR04 forward primer和pEZX-MR04 reverse primer進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s；30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物用3%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，pEZX-MR04-miR-con PCR產(chǎn)物在612 bp處有一條帶，在pEZX-MR04-miR-93 PCR產(chǎn)物在676 bp處有一條帶，與預(yù)期大小相符(圖3)。

圖2　重組質(zhì)粒pEZX-MR04-miR-93的雙酶切鑒定

Marker：DNA marker (50 bp DNA 標(biāo)記)；DC：雙酶切(Double Cutting)；UC：未酶切(Un-Cutting)

圖3　重組質(zhì)粒pEZX-MR04-miR-93 PCR鑒定

Marker：DNA marker (50 bp DNA 標(biāo)記)；1：pEZX-MR04-miR-93 PCR產(chǎn)物；2：pEZX-MR04-miR-con PCR產(chǎn)物

2.4重組質(zhì)粒pEZX-MR04-miR-93的測(cè)序鑒定提取重組質(zhì)粒送北京奧科公司測(cè)序，結(jié)果顯示目的基因序列成功克隆至pEZX-MR04表達(dá)載體中，miR-93真核表達(dá)載體pEZX-MR04-miR-93構(gòu)建成功。

2.5細(xì)胞轉(zhuǎn)染和Real Time q-PCR驗(yàn)證將pEZX-MR04-miR-con和構(gòu)建好的pEZX-MR04-miR-93質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，24 h后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)。在轉(zhuǎn)染了pEZX-MR04-miR-93質(zhì)粒的293T細(xì)胞中可見(jiàn)GFP表達(dá)(圖4)。48 h后提取總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，Real time q-PCR驗(yàn)證miR-93表達(dá)差異。結(jié)果顯示293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染pEZX-MR04-miR-93質(zhì)粒組其miR-93表達(dá)量較pEZX-MR04-miR-con質(zhì)粒組高約21倍(圖5)，證實(shí)重組pEZX-MR04-miR-93質(zhì)?？筛咝П磉_(dá)miR-93。

圖4　熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染了pEZX-MR04-miR-93質(zhì)粒的293T細(xì)胞

圖5　Real time q-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后48 h 293T細(xì)胞中miR-93表達(dá)差異(***P<0.001)

3　討　論

microRNA是一類(lèi)內(nèi)源性的小分子單鏈非編碼RNA，廣泛存在于多種生物體內(nèi)，即便在同一生物體內(nèi)，其表達(dá)也存在組織和器官特異性。microRNA大小僅19～15堿基，但卻可通過(guò)與其靶基因mRNA的3′非翻譯區(qū)(3′-untranslated region, 3′-UTR)互補(bǔ)配對(duì)促進(jìn)mRNA的降解或抑制其翻譯，從而發(fā)揮其功能，參與生物體的各種進(jìn)化過(guò)程。

miR-93廣泛參與人類(lèi)疾病進(jìn)程，其表達(dá)隨疾病不同而異。在復(fù)發(fā)性結(jié)直腸癌患者標(biāo)本中，miR-93表達(dá)顯著低于無(wú)復(fù)發(fā)患者。在卵巢上皮癌患者標(biāo)本中，其表達(dá)亦低于正常婦女卵巢組織[13-14]。而在胃癌、食管癌、膠質(zhì)瘤等腫瘤中，其表達(dá)均上調(diào)。除腫瘤外，異常表達(dá)的miR-93尚與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化[15]、川崎病、肥胖、糖尿病等多種疾病進(jìn)展相關(guān)。在經(jīng)典的信號(hào)通路調(diào)控中，miR-93亦扮演重要角色。例如在肺癌中，miR-93/ZNRF3/Wnt/β-catenin信號(hào)通路可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[16]；而在結(jié)直腸癌中，miR-93/Smad7/Wnt/β-catenin信號(hào)通路則可抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移及增殖[17]；在肝癌和膠質(zhì)瘤的研究中，miR-93被證實(shí)可激活PI3K/Akt信號(hào)通路，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展[18]?？梢?jiàn)miR-93在不同的疾病進(jìn)展中起著不同的作用，其錯(cuò)綜復(fù)雜的關(guān)系網(wǎng)、眾多的靶基因及不同的信號(hào)通路尚需做進(jìn)一步的深入研究。

本研究成功構(gòu)建了人miR-93真核表達(dá)載體pEZX-MR04-miR-93，該載體可在細(xì)胞水平顯著上調(diào)miR-93表達(dá)水平。重組pEZX-MR04-miR-93質(zhì)粒帶有綠色熒光蛋白標(biāo)簽，可在熒光顯微鏡下直接監(jiān)測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，同時(shí)，載體帶有嘌呤霉素抗性基因，可用于穩(wěn)定表達(dá)克隆的篩選，可為后續(xù)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)提供穩(wěn)定而可靠的模型。綜上，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的人miR-93真核表達(dá)載體pEZX-MR04-miR-93可為后續(xù)進(jìn)一步研究miR-93在泌尿系腫瘤中的作用、機(jī)制提供方便而穩(wěn)定的工具。

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(編輯王瑋)

The construction and expression verification of miR-93 eukaryotic expression vector

HUANG Jun, WU Kai-jie, HUI Ke, WANG Bin, WANG Xin-yang, HE Da-lin

(Department of Urology, the First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University, Xi’an 710061, China)

ObjectiveTo construct a eukaryotic expression vector of human miR-93 and test its expression efficiency, in order to offer a good tool to further study the biological functions of miR-93. Methods PCR was used to amplify the precursor sequence of human miR-93 from the genomic DNA of 293T cells, which were then cloned into the pEZX-MR04 expression vector to produce the recombinant pEZX-MR04-miR-93 plasmid. Enzyme double digestion, PCR and sequence analysis were adopted to verify the recombinant pEZX-MR04-miR-93 plasmid. After that, 293T cells were transfected with the recombinant pEZX-MR04-miR-93 plasmid and real time PCR was used to test its expression efficiency of miR-93. Results The eukaryotic expression vector of miR-93 was successfully constructed. After transfection with the recombinant pEZX-MR04-miR-93 plasmid, the expression level of miR-93 in 293T cells could be up-regulated by 21 folds. ConclusionThe recombinant pEZX-MR04-miR-93 expression vector was successfully constructed and could significantly increase miR-93 level in cells, which will offer us a convenient tool to further study the biological functions of miR-93.

miR-93; expression vector; pEZX-MR04; 293T

2016-05-24

2016-06-18

國(guó)家自然科學(xué)基金(No.81572516)、陜西省國(guó)際科技合作與交流計(jì)劃項(xiàng)目(No.2016KW-021)

賀大林，教授.E-mail: held@mail.xjtu.edu.cn

黃軍(1990-)，男(漢族)，博士研究生在讀.研究方向：microRNA在泌尿系腫瘤惡性進(jìn)展中的作用及機(jī)制研究.

E-mail: 846969656@qq.com

R331

ADOI：10.3969/j.issn.1009-8291.2016.10.016