張海嫻，李一鳴，汪曉虹，邵 潔，王 怡

復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)科，上海 200040

靶向血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2超聲分子成像在小鼠原位膠質(zhì)瘤血管新生和邊界識(shí)別中的應(yīng)用

張海嫻，李一鳴，汪曉虹，邵 潔，王 怡

復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)科，上海 200040

目的：探討攜帶抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）單克隆抗體的超聲微泡造影劑（microbubble，MB）在評(píng)價(jià)小鼠原位膠質(zhì)瘤血管新生和邊界識(shí)別中的作用。方法：以生物素-親和素橋接法構(gòu)建靶向微泡（MBv），體外鑒定其性質(zhì)。建立小鼠GL261膠質(zhì)瘤模型，分別注射MBv和普通微泡（MBc）進(jìn)行超聲造影檢查。結(jié)果：成功構(gòu)建偶聯(lián)抗小鼠VEGFR2單克隆抗體的MBv，造影結(jié)果表明MBv較MBc能更好地評(píng)價(jià)小鼠膠質(zhì)瘤血管新生和腫瘤邊界。結(jié)論：MBv是良好的腫瘤靶向造影劑，應(yīng)用MBv可較好地實(shí)現(xiàn)術(shù)中評(píng)價(jià)小鼠膠質(zhì)瘤血管新生，更好地輔助術(shù)中超聲導(dǎo)航。

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2；原位膠質(zhì)瘤；超聲

腦膠質(zhì)瘤是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，占全部顱內(nèi)腫瘤的35.26%～60.96%［1］。隨著神經(jīng)外科學(xué)微創(chuàng)、精確理念的不斷深入，如何最大限度地切除腫瘤同時(shí)又不損傷重要的神經(jīng)功能成為當(dāng)今手術(shù)醫(yī)師的難題［2-4］。研究表明，實(shí)體腫瘤在生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移過程中均依賴新生血管形成，血管系統(tǒng)在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中具有至關(guān)重要的作用［5］。由于腫瘤血管發(fā)育不成熟，內(nèi)部存在缺氧微環(huán)境，從而刺激腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞處于持續(xù)高度增殖狀態(tài)，誘導(dǎo)一系列特異性分子表達(dá)上調(diào)，包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2 （vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）［6-7］、整合素αvβ3 （αvβ3-integrin）［8］等。VEGF通過與VEGFR2結(jié)合，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖，促使細(xì)胞浸潤(rùn)，誘導(dǎo)血管新生［9-11］。

本研究利用生物素-親和素橋接方法，將抗VEGFR2抗體與生物素化的脂質(zhì)微泡 （microbubble，MB）偶聯(lián)構(gòu)建靶向微泡 （MBv），利用VEGFR2靶向作用將微泡主動(dòng)靶向至腫瘤新生血管，通過高頻超聲成像術(shù)中實(shí)時(shí)顯示膠質(zhì)瘤的血管新生，從而實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確、便捷的術(shù)中膠質(zhì)瘤切除實(shí)時(shí)導(dǎo)航技術(shù)。

1　資料和方法

1.1普通微泡（MBc）與MBv的制備

將一定比例的二硬脂酰磷酯酰膽堿（distearoyl phosphatidylcholine，DSPC）、二硬脂酰磷酯酰乙醇胺（distearoyl phosphoethanolamine，DSPE）-聚乙二醇2000 ［poly（ethylene glycol） 2000，PEG 2000］和生物素酰化聚乙二醇2000修飾二硬脂酰磷酯酰乙醇胺（DSPEPEG2000-Biotin）溶解于三氯甲烷中，并在渦旋混合器上混勻。使用干燥的N2流除去溶劑使其在試管壁上形成一層均勻的薄膜，真空烘箱中干燥2 h以上。然后加入一定體積脫氣的Tris緩沖溶液（含10%甘油和10%丙二醇，pH 7.4），得到一定濃度的磷脂溶液。加熱磷脂溶液至其相轉(zhuǎn)變溫度（55～60 ℃）以上，并用水浴超聲制成磷脂溶液，分裝入2 mL西林瓶中（1 mL/瓶），將瓶中空氣置換成全氟丙烷，機(jī)械震蕩器震蕩45 s獲得生物素化的超聲微泡。另以DSPE取代DSPE-PEG2000-Biotin，按實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法制備MBc造影劑作為對(duì)照。

1.2小鼠GL261膠質(zhì)瘤模型的建立

C57小鼠，雄性，體重18～20 g，6～8周齡，由復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院動(dòng)物房提供。GL261小鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞系由復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院神經(jīng)外科研究所提供。復(fù)蘇GL261細(xì)胞，選用DMEM培養(yǎng)基（含15%胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 μg/mL鏈霉素），于37 ℃，5% CO2孵箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至90%融合時(shí)傳代，用胰酶消化培養(yǎng)的細(xì)胞，制成1×108個(gè)/mL懸液備用。小鼠取俯臥位固定于立體定位儀上，術(shù)者用75%乙醇行穿刺點(diǎn)消毒，以前囟為原點(diǎn)，向右2 mm，向前1.3 mm，垂直進(jìn)針3.5 mm，注射備好的細(xì)胞懸液2 μL。

1.3微泡體外黏附實(shí)驗(yàn)

將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）在24孔板內(nèi)培養(yǎng)過夜，將兩種微泡分別與HUVEC孵育30 min后充分洗滌，在光鏡下觀察兩種微泡的黏附。

1.4超聲造影實(shí)驗(yàn)

麻醉并綁定動(dòng)物，用Vevo 2100超聲儀MS-250高頻線陣探頭，先行二維超聲檢查腫瘤，選擇最大切面后轉(zhuǎn)入超聲分子成像模式。探頭發(fā)射頻率18 MHz，機(jī)械指數(shù)0.16，記錄幀頻41 Hz。行外科手術(shù)去除小鼠顱頂骨，暴露荷瘤大腦，完成一次造影后切除部分瘤體，再次進(jìn)行造影。每只小鼠均經(jīng)尾靜脈先后注射MBv和MBc各6×107個(gè)。兩種造影劑注射順序隨機(jī)，兩次造影之間間隔1 h。從注入造影劑即刻起全程記錄動(dòng)態(tài)影像，直至造影劑廓清為止。所有聲學(xué)造影圖像自動(dòng)保存，以備分析。

1.5造影圖像分析

應(yīng)用儀器自帶的Vevo CQ軟件進(jìn)行圖像分析，選擇Target模式，儀器自動(dòng)選擇造影前及造影后的圖像進(jìn)行扣除并生成偽彩。

2　結(jié) 果

2.1MBc和MBv體外黏附實(shí)驗(yàn)

光鏡下觀察HUVEC周邊偶有MBc黏附，平均值為（1.5±0.3）個(gè)（圖1）；而MBv在HUVEC周邊大量黏附，平均值為（9.5±0.5）個(gè)（圖2），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.2腫瘤超聲造影情況及圖像分析

10只小鼠原位腫瘤模型均建模成功（圖3）。在分子造影模式下，可見注入MBc或MBv即刻造影劑從腫瘤周圍逐漸向中央部充填，直至整個(gè)瘤體明顯增強(qiáng)。與MBc造影（圖4）比較，MBv（圖5）能更好地顯示腫瘤組織的血管新生。挖除部分腫瘤后（圖6），再次注入MBc或MBv，MBv（圖7）仍較MBc（圖8）能更好地顯示腫瘤組織的血管新生。

圖1　普通微泡體外黏附HUVEC實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖2　VEGFR2靶向微泡體外黏附HUVEC實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖3　小鼠GL261原位膠質(zhì)瘤模型二維超聲圖

圖4　腫瘤挖除前小鼠原位膠質(zhì)瘤超聲分子成像（一）

圖5　腫瘤挖除前小鼠原位膠質(zhì)瘤超聲分子成像（二）

圖6　腫瘤部分挖除后小鼠GL261原位膠質(zhì)瘤二維超聲圖（一）

圖7　腫瘤部分挖除后小鼠原位膠質(zhì)瘤超聲分子成像（二）

圖8　腫瘤部分挖除后小鼠原位膠質(zhì)瘤超聲分子成像（三）

3　討 論

超聲分子影像學(xué)是應(yīng)用超聲影像學(xué)方法，將靶向超聲造影劑注入體內(nèi)，通過受體與配體結(jié)合特異性停留于靶組織，從而觀察靶組織在組織、細(xì)胞及亞細(xì)胞水平的成像，反映病變組織在分子基礎(chǔ)上的變化［12］。

實(shí)體腫瘤的生長(zhǎng)均依賴新生血管生成，腫瘤內(nèi)部的缺氧微環(huán)境致使腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞持續(xù)高特異性表達(dá)某些促生長(zhǎng)受體，其中最重要之一為VEGFR2，而該受體在正常血管表達(dá)極低［5，8-9］。本研究采用生物素-親和素橋接法構(gòu)建了攜帶抗VEGFR2單克隆抗體的MBv，用體外黏附實(shí)驗(yàn)鑒定其性質(zhì)，并結(jié)合超聲造影檢查評(píng)價(jià)活體腫瘤新生血管的情況。體外鑒定結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)制備的生物素化微泡對(duì)親和素具有很好的結(jié)合力。而通過生物素-親和素橋接法構(gòu)建的MBv，其所偶聯(lián)的抗體在體外亦有很好的活性，可與相應(yīng)二抗特異性結(jié)合。

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，腫瘤挖除前利用超聲分子成像評(píng)價(jià)小鼠原位膠質(zhì)瘤血管新生情況，顯示膠質(zhì)瘤的邊界以引導(dǎo)膠質(zhì)瘤切除，術(shù)中仍可再次進(jìn)行靶向成像，不受術(shù)中水腫偽像或腦漂移的影響，可多次重復(fù)進(jìn)行，良好地實(shí)現(xiàn)膠質(zhì)瘤切除術(shù)中超聲導(dǎo)航。

綜上所述，本研究應(yīng)用生物素-親和素橋接法構(gòu)建了MBv，可與新生血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的靶分子特異性結(jié)合，并產(chǎn)生顯著的主動(dòng)性靶向超聲分子顯像，為無(wú)創(chuàng)性評(píng)價(jià)組織內(nèi)血管新生提供了一種新的方法，更好地實(shí)現(xiàn)了膠質(zhì)瘤術(shù)中超聲導(dǎo)航。

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Application of vascular endothelial growth factor receptor 2-targeted ultrasound molecular imaging in intraoperative assessment of tumor angiogenesis and boundary identification in vivo

ZHANG Haixian， LI Yiming，WANG Xiaohong， SHAO Jie， WANG Yi （Department of Ultrasound， Huashan Hospital， Fudan University， Shanghai 200040， China）
Correspondence to: WANG Yi E-mail: Y_wang1111@hotmail.com

Objective: To develop and validate a targeted ultrasonographic （US） imaging agent with microbubbles （MBs）that binds to vascular endothelial growth factor receptor 2 （VEGFR2） in a murine model for tumor angiogenesis. Methods: Targeted US imaging agent was prepared by bridged avidin biotin through binding anti-VEGFR2 antibody to the shell of perfluorocarbonfilled MBs. The binding specificities of targeted MB （MBv） and with nonlabeled MB （MBc） were tested with VEGFR2-positive cells（human umbilical vein endothelial cells， HUVECs）. In vivo imaging signals of contrast-enhanced US by using anti-VEGFR2-targeted MBv and MBc were quantified in 10 mice bearing GL261 cells. Results: Attachment of HUVECs was significantly higher for MBv（mean MBs per cell 9.5±0.5） than MBc （mean MBs per cell 1.5±0.3）. The imaging signal in the murine tumor angiogenesis model was significantly higher for MBv than for MBc. Conclusion: Targeted contrast-enhanced US directed at VEGFR2 improves in vivo visualization of tumor angiogenesis and boundary identification in a murine model of orthotopic gliomas.

Vascular endothelial growth factor receptor 2； Orthotopic glioma； Ultrasound

R445.1

A

1008-617X（2016）03-0248-04

王怡 E-mail：Y_wang1111@hotmail.com

（2016-09-03）