孫 筠，李自立，許曉平，何思敏，薛楊波，程競(jìng)儀，章英劍

1. 上海市質(zhì)子重離子醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，上海 201321；

2. 復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032

64Cu-ATSM乏氧分子影像探針及其荷人乳腺癌小動(dòng)物PET/ CT顯像的初步研究

孫 筠1，2，李自立1，2，許曉平1，2，何思敏1，2，薛楊波1，2，程競(jìng)儀1，2，章英劍1，2

1. 上海市質(zhì)子重離子醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，上海 201321；

2. 復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032

目的：64Cu有半衰期較長(zhǎng)、化學(xué)反應(yīng)溫和的優(yōu)勢(shì)，本研究合成新型乏氧分子影像學(xué)探針64Cu-ATSM，并與18F-氟硝基咪唑（18F-fluoromisonidazole，18F-FMISO）進(jìn)行初步比較。方法：使用SIEMENS Eclipse HP 11 MeV小型醫(yī)用回旋加速器系統(tǒng)，Comecer ALCEO EDL、PRF、TADDEO放射性模塊和定制鉑金靶盤進(jìn)行64Ni電鍍、64Cu純化和64Cu-ATSM合成。用伽馬能譜儀和高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）進(jìn)行放射核純度、放化純度和穩(wěn)定性檢測(cè)。在荷人乳腺癌MDB-MA-231模型中進(jìn)行小動(dòng)物PET/CT顯像并與自制的18F-FMISO進(jìn)行比較。結(jié)果：實(shí)現(xiàn)了64Cu-ATSM的自動(dòng)化生產(chǎn)，產(chǎn)率60%，放射性核純度＞99%，放化純度＞95%，標(biāo)記物穩(wěn)定性＞6 h。與18F-FMISO一樣能反映腫瘤乏氧情況，且注射1 h后T/M值即能達(dá)5.28。結(jié)論：成功用11 MeV SIEMENS回旋加速器和Comecer ALCEO模塊合成了64Cu-ATSM，荷人乳腺癌小動(dòng)物PET/CT乏氧顯像靶/本比高。

64Cu-ATSM；18F-氟硝基咪唑；乏氧顯像；乳腺癌

64Cu （T1/2=12.7 h，β+= 653 keV ［17.8%］），β+衰變產(chǎn)生湮滅輻射后生成的一對(duì)511 keV光子可用于正電子發(fā)射斷層成像（positron emission tomography， PET）［1］，其正電子射程4.7 mm，影像分辨率和放射防護(hù)需求類似18F。64Cu外層軌道上電子的排布（3p63d9）決定了其易與含N、S、O等原子的配體形成較為穩(wěn)定的配合物［2］。與18F分子影像學(xué)探針標(biāo)記反應(yīng)相比，64Cu與螯合物的反應(yīng)一般在水相中完成，不需高溫加熱，且反應(yīng)迅速。64Cu半衰期達(dá)12.7 h，可支持更遠(yuǎn)的運(yùn)輸距離。因此，64Cu標(biāo)記的分子影像學(xué)探針目前受到越來(lái)越多的關(guān)注［3-5］。

腫瘤乏氧是放療抵抗的重要原因，已成為正確實(shí)施個(gè)體化放療的生物靶點(diǎn)之一［6］。乏氧是實(shí)體腫瘤生長(zhǎng)過(guò)快和血管結(jié)構(gòu)異常的共同結(jié)果，是腫瘤進(jìn)展、局部控制失敗及細(xì)胞存活和轉(zhuǎn)移因子激活的重要因素。分析腫瘤細(xì)胞乏氧對(duì)腫瘤的活性診斷、療效分析及預(yù)后評(píng)價(jià)具有重要意義［7］。本研究報(bào)道使用SIEMENS小型醫(yī)用回旋加速器系統(tǒng)、Comecer ALCEO放射性模塊和定制鉑金靶盤進(jìn)行64Cu-diacetyl-bis（N4-methylthiosemicarbazone）（ATSM）合成及其在荷人乳腺癌小動(dòng)物PET/CT乏氧顯像中與18F-氟硝基咪唑（18F-fluoromisonidazole，18FFMISO）對(duì)照的初步結(jié)果。

1　資料和方法

1.1儀器和試劑

1.1.1儀器設(shè)備

采用SIEMENS Eclipse HP 11 MeV小型回旋加速器及其固體靶系統(tǒng)和為該加速器設(shè)計(jì)定制的鉑金靶盤；Comecer ALCEO 固體靶系統(tǒng)：EDL電化學(xué)/溶解/轉(zhuǎn)移/沉積模塊、PRF電化學(xué)純化模塊、TADDEO放射性藥物合成模塊；AMETEK GEMC5060P4伽馬能譜儀；AGILENT HPLC 1260，配有四元梯度泵、可變波長(zhǎng)檢測(cè)器、流式γ放射性檢測(cè)器（Gabi Star，德國(guó)RAYTEST公司）、Poroshell 120 EC-C18分析柱（4.6 mm×50 mm，2.7 μm）、真空脫氣機(jī)和ChemStation色譜控制和分析軟件；Millipore超純水制備系統(tǒng)；SIEMENS Inveon小動(dòng)物PET/CT。上述儀器設(shè)備均為本科室擁有。

1.1.2試劑

64Ni （99.9%）購(gòu)于深圳愛(ài)索特國(guó)際同位素有限公司；H2-ATSM購(gòu)于ABX公司；氯化銨（≥99.999 5%）購(gòu)于FLUKA公司；AG 1-X8樹脂，氯型，300～1 200 μm，購(gòu)于BIO-RAD公司；28%氫氧化銨（≥99.999 5%）購(gòu)于SIGMA-ALDRICH公司；無(wú)水乙醇［高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）級(jí)］購(gòu)于ALADDIN公司；60%硝酸（超純）購(gòu)于MERK公司；37%鹽酸（trace medal，99.999%）購(gòu)于OURCHEM公司；濃硝酸（≥90%）購(gòu)于SIGMA-ALDRICH公司。

1.2腫瘤模型制備

BALB/c雌性裸鼠，4～6周齡，體重20～25 g，購(gòu)于復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部，于此飼養(yǎng)至實(shí)驗(yàn)開(kāi)始。雌激素受體（estrogen receptor，ER）陰性人乳腺癌MDB-MA-231細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)基中，于37oC、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，在細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)。用磷酸緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌細(xì)胞，0.25%胰酶消化，離心（1 000 r/min，5 min），DMEM培養(yǎng)基吹打混勻，流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞密度，準(zhǔn)備接種。在每只BALB/c雌性裸鼠右腋下皮下注射5×106個(gè)細(xì)胞，飼養(yǎng)于獨(dú)立通風(fēng)籠（individual ventilated cage，IVC）中3周，每2 d用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤長(zhǎng)徑，待腫瘤長(zhǎng)徑長(zhǎng)至0.8～1.0 cm時(shí)用于顯像。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.164Cu的制備和純化

64Ni用60%硝酸加熱溶解后，氫氧化銨調(diào)pH值，使用Comecer ALCEO EDL電化學(xué)/溶解/轉(zhuǎn)移/沉積模塊，通過(guò)電沉積方法將64Ni層鍍于鉑金靶盤中央表面。

基于64Ni （p，n）64Cu反應(yīng)，以富集64Ni為靶材，通過(guò)SIEMENS Eclipse HP回旋加速器，以能量11 MeV、束流強(qiáng)度30 μA的質(zhì)子轟擊64Ni 30 min。轟擊結(jié)束后，冷卻1 h，將靶盤固定于Comecer ALCEO EDL電化學(xué)/溶解/轉(zhuǎn)移/沉積模塊，經(jīng)Comecer ADDEO PRF電化學(xué)純化模塊，分別用6、4 、0.5 mol/L鹽酸溶解靶層，再用AG 1-X8樹脂進(jìn)行64Cu分離純化，制備64CuCl2。

1.3.264Cu-ATSM的合成

64Cu-ATSM的合成路線見(jiàn)圖1。將分離純化后得到的64CuCl2溶液轉(zhuǎn)移至合成模塊的反應(yīng)器中，真空條件下120 ℃蒸發(fā)至干。向反應(yīng)器中加入1.5 mL 1 mol/L CH3COONa，同時(shí)向反應(yīng)器中加入200 μL二甲基亞砜 （dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解的20 μg前體H2-ATSM，鼓泡2 min。將反應(yīng)完全的溶液轉(zhuǎn)移至乙醇/水處理過(guò)的C-18柱，用10 mL無(wú)菌注射用水清洗C-18柱，去除沒(méi)完全反應(yīng)的H2-ATSM，然后用0.7 mL藥用無(wú)水乙醇沖洗C-18柱，并過(guò)0.22 μm無(wú)菌濾膜，再用生理鹽水稀釋得到注射用64Cu-ATSM。

圖1　64Cu-ATSM合成路線

1.3.364Cu-ATSM質(zhì)量分析

用伽馬能譜儀分析核純度，用分析型Radio-HPLC檢測(cè)放化純度和穩(wěn)定性。HPLC流動(dòng)相是0.05 mol/L CH3CN/NaH2PO4（1∶1，V/V），pH=3，流速為1 mL/min，分析柱為Poroshell 120 EC-C18柱，采用276 nm UV檢測(cè)器和放射性檢測(cè)器。HPLC連續(xù)上樣，檢測(cè)64Cu-ATSM 6 h內(nèi)的放化純度，檢驗(yàn)其穩(wěn)定性。同時(shí)，目測(cè)其外觀顏色和澄清度，利用精密pH試紙測(cè)pH值。

1.3.464Cu-ATSM乏氧成像

取3只荷人乳腺癌MDB-MA-231裸鼠，分別自尾靜脈注射64Cu-ATSM （約550 μCi），于注射后1、2、3 h在異氟烷（異氟烷/氧氣，1.5%/98.5%，V/V）麻醉狀態(tài)下進(jìn)行，同時(shí)行小動(dòng)物PET/CT掃描，3D模式采集10 min靜態(tài)圖像。有序子集最大期望值算法（ordered subsets expectation maximization，OSEM） 3D/MAP法重建，并行衰減校正，獲得荷瘤裸鼠體內(nèi)64Cu-ATSM分布融合圖像。在腫瘤部位和對(duì)側(cè)肌肉勾畫感興趣區(qū)（region of interest，ROI），工作軟件自動(dòng)產(chǎn)生對(duì)應(yīng)的最大標(biāo)準(zhǔn)攝取值（maximum standardized uptake value，SUVmax），然后計(jì)算腫瘤/肌肉（tumor/muscle，T/M）吸收比值。

在注射64Cu-ATSM 后第4天，3只荷瘤裸鼠注射18F-FMISO （制備方法見(jiàn)文獻(xiàn)［8］）進(jìn)行小動(dòng)物PET/ CT掃描成像異比較。

2　結(jié) 果

本研究實(shí)現(xiàn)了SIEMENS Eclipse HP 11 MeV小型回旋加速器固體靶系統(tǒng)和Comecer ALCEO EDL、PRF和TADDEO放射性模塊的銜接，并為此設(shè)計(jì)定制了鉑金靶盤，實(shí)現(xiàn)了使用11 MeV質(zhì)子轟擊生產(chǎn)64Cu，在64Cu制備過(guò)程中實(shí)現(xiàn)了電鍍、溶解、純化和放射性藥物合成的自動(dòng)化。

其中，通過(guò)電沉積方法成功將60 μg64Ni鍍于鉑金靶盤中央表面，置于回旋加速器靶托，以30 μA、11 MeV質(zhì)子轟擊30 min后，溶解靶盤上含64Cu的64Ni固體層，純化得到小動(dòng)物研究用的3.06 mCi64CuCl2。

64Cu的放射性核純度（圖2）僅見(jiàn)1 346 keV的β+特征峰及其湮滅輻射后產(chǎn)生的511 keV γ峰，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［9］，可確認(rèn)產(chǎn)物為64Cu，且無(wú)明顯放射性雜質(zhì)（圖3）。

根據(jù)圖1的合成路線，合成出1.83 mCi64Cu-ATSM，產(chǎn)率為60%。Radio-HPLC分析結(jié)果提示放化純度＞95% （圖3），且在6 h內(nèi)保持穩(wěn)定。其注射液為澄清液體，pH=6。

人乳腺癌MDB-MA-231移植瘤成像結(jié)果（圖4）顯示，64Cu-ATSM、18F-FMISO均可顯示癌灶乏氧情況，肉眼判斷效果相似（圖4）。半定量計(jì)算結(jié)果顯示，注射后1、3 h，T/M值分別為5.28、1.88和4.48、3.69，提示64Cu-ATSM可成像時(shí)間較早，隨時(shí)間延長(zhǎng)，18F-FMISO與其差距縮小。

3　討 論

目前已發(fā)現(xiàn)的64Cu制備方法有3種：① 通過(guò)熱中子捕獲反應(yīng)63Cu （n，γ）64Cu獲得，但比活度低；② 通過(guò)快中子反應(yīng)64Zn （n， p）64Cu獲得，比活度高，但需進(jìn)入反應(yīng)堆快中子通量阱，而這在大多數(shù)反應(yīng)堆設(shè)備中難以實(shí)現(xiàn)；③ 通過(guò)本研究所述64Ni （p， n）64Cu核反應(yīng)。目前大多數(shù)研究在15MeV及以上的醫(yī)用回旋加速器中生產(chǎn)64Cu［10-11］。本研究證明，在低至11 MeV的常規(guī)醫(yī)用回旋加速器中也可生產(chǎn)出高純度的64Cu。

圖2　純化后的CuCl2伽馬能譜　

圖3　64Cu-ATSM HPLC圖譜

圖4　64Cu-ATSM與18F-FMISO microPET/CT乏氧顯像比較

本研究使用11 MeV質(zhì)子轟擊30 min，束流強(qiáng)度30 μA，產(chǎn)出3.06 mCi64CuCl2，產(chǎn)量為0.204 mCi/μA·h，遠(yuǎn)低于12 MeV、50 μA轟擊的產(chǎn)量0.6～3 mCi/μA·h［12］，提示質(zhì)子轟擊時(shí)間、能量和束流強(qiáng)度是影響產(chǎn)量的重要因素。質(zhì)子通過(guò)非線性方式釋放能量，增加64Ni厚度，更充分地吸收質(zhì)子能量可進(jìn)一步提高產(chǎn)量。國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)［10］報(bào)道，用37～70 μA束流強(qiáng)度、15 MeV質(zhì)子打靶生產(chǎn)大劑量64Cu時(shí)需轟擊 2.5～10h。綜合考慮以上因素，下一步將調(diào)整電鍍質(zhì)量、提高束流強(qiáng)度、延長(zhǎng)轟擊時(shí)間以生產(chǎn)臨床所需64CuCl2產(chǎn)量。

本研究發(fā)現(xiàn)，64Cu-ATSM T/M值在注射后1 h達(dá)5.28，高于18F-FMISO，這種差異可能是由于肌肉組織中64Cu-ATSM攝取較少。分子影像學(xué)探針在靶區(qū)的快速集聚有利于提高檢查通量，本研究小動(dòng)物乏氧影像初步結(jié)果提示優(yōu)于文獻(xiàn)［11］報(bào)道的64Cu BMS181321，最佳顯像時(shí)間可望縮短至1 h，有助于縮短患者乏氧成像的等待時(shí)間。

本研究在國(guó)際上首次實(shí)現(xiàn)了SIEMENS Eclipse HP 11 MeV小型回旋加速器固體靶系統(tǒng)和Comecer ALCEO EDL、PRF、TADDEO放射性固體靶藥物模塊的銜接，定制的鉑金靶盤可很好地用于64Ni電鍍，實(shí)現(xiàn)了64Cu制備過(guò)程中電化學(xué)、溶解、純化和放射性藥物合成的自動(dòng)化。實(shí)驗(yàn)性生產(chǎn)的64CuCl2具有極高的放射核純度。64Cu-ATSM產(chǎn)率為60%，放化純度高，可顯示荷人乳腺癌MDBMA-231腫瘤的乏氧情況，肉眼判斷效果與18FFMISO相似，且1 h的T/M值顯著高于18F-FMISO，有助于縮短患者乏氧成像的等待時(shí)間。

［1］ ANDERSON C J， FERDANI R. Copper-64 radiopharmaceuticals for PET imaging of cancer: advances in preclinical and clinical research ［J］. Cancer Biother Radiopharm， 2009， 24（4）: 379-393.

［2］ 馬磊， 劉宇， 柴之芳.64Cu放射性藥物化學(xué) ［J］. 化學(xué)進(jìn)展， 2012， 24（9）: 1720-1728.

［3］ WU N， KANG C S， SIN I， et al. Promising bifunctional chelators for copper 64-PET imaging: practical64Cu radiolabeling and high in vitro and in vitro complex stability ［J］. J Biol Inorg Chem， 2016， 21（2）: 177-184.

［4］ KANG C S， WU N， CHEN Y， et al. Transferrin conjugates of triazacyclononane-based bifunctional NE3TA chelates for PET imaging: Synthesis， Cu-64 radiolabeling， and in vitro and in vivo evaluation ［J］. J Inorg Biochem， 2016， 154: 60-66.

［5］ NEDROW J R， LATOCHE J D， DAY K E， et al. Targeting PSMA with a Cu-64 labeled phosphoramidate inhibitor for PET/CT imaging of variant PSMA-expressing xenografts in mouse models of prostate cancer［J］. Mol Imaging Biol， 2016， 18（3）: 402-410.

［6］ VORDERMARK D， HORSMAN M R. Hypoxia as a biomarker and for personalized radiation oncology ［J］. Recent Results Cancer Res， 2016， 198: 123-142.

［7］ 程競(jìng)儀， 耿道穎， 章英劍. 腫瘤乏氧和乏氧分子影像進(jìn)展 ［J］. 腫瘤影像學(xué)， 2014， 23（3）: 172-177.

［8］ 王明偉， 張勇平， 鄭宇佳， 等.18F-FMISO的自動(dòng)化合成改進(jìn)及其腫瘤乏氧Micro-PET/CT顯像 ［J］. 核技術(shù)，2013， 36（10）: 38-43.

［9］ KIM J Y， PARK H， LEE J C， et al. A simple Cu-64 production and its application of Cu-64 ATSM ［J］. Appl Radiat Isot， 2009， 67（7-8）: 1190-1194.

［10］ 陳玉清， 梁積新， 李光， 等. 陰離子交換法從輻照后的Ni靶中分離64Cu ［J］. 同位素， 2012， 25（3）: 144-148.

［11］ 羅政， 朱華， 林新峰， 等. 新型核素64Cu標(biāo)記硝基咪唑類腫瘤乏氧顯像劑及正電子發(fā)射斷層掃描顯像研究 ［J］.高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)， 2015， 36（1）: 87-92.

［12］ OBATA A， KASAMATSU S， MCCARTHY D W， et al. Production of therapeutic quantities of64Cu using a 12 MeV cyclotron ［J］. Nucl Med Biol， 2003， 30（5）: 535.

Preliminary research of preparation of64Cu-ATSM and its small animal scanning

SUN Yun1，2， LI Zili1，2， XUXiaoping1，2， HE Simin1，2， XUE Yangbo1，2， CHENG Jingyi1，2， ZHANG Yingjian1，2 （1. Department of Nuclear Medicine，Shanghai Proton and Heavy Ion Center， Shanghai 201321， China； 2. Department of Nuclear Medicine， Fudan University Shanghai Cancer Center； Department of Oncology， Shanghai Medical College， Fudan University， Shanghai 200032，China）
Correspondence to: CHENG Jingyi E-mail: jingyi.cheng@sphic.org.cn

Objective: To investigate the synthesis and application of64Cu-ATSM in hypoxia imaging of xenografted MDBMA-231 breast cancer. Methods:64CuCl2was prepared by SIEMENS Eclipse HP 11 MeV cyclotron， Comecer ALCEO EDL， PRF and TADDEO pharmaceutical modules， and the modified platinum target plate. And then the prepared64CuCl2and synthesized64Cu-ATSM were monitored by energy spectroscopy and high performance liquid chromatography （HPLC） for detection of radioactive purity， radiochemical purity and stability.64Cu-ATSM was intravenously injected into MDB-MA-231 cells xenografted nude mouse and then imaged by microPET/CT. The results were compared with that of18F-fluoromisonidazole （18F-FMISO） injected 4 d after64Cu-ATSM imaging. Results: The automatic production of64Cu-ATSM with a productivity of 60% without radioactive and radiochemical impurity was achieved.64Cu-ATSM was stable at 6 h after synthesis. Both64Cu-ATSM and18F-FMISO could demonstrate the hypoxic degree of MDB-MA-231 cell xenografted tumor. And the tumor/muscle （T/M） ratio of64Cu-ATSM was 5.28， which was significantly higher than that of18F-FMISO （1.88）. Nevertheless， three hours after injection， the T/M ratios of the two probes were similar. Conclusion: The synthesized64Cu-ATSM could image the hypoxic condition of MDB-MA-231 xenografted tumor.

64Cu-ATSM；18F-fluoromisonidazole； Hypoxia； Breast cancer

R445.5

A

1008-617X（2016）03-0267-05

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金（No：21501029、21401025）；上海市科委項(xiàng)目（No：15ZR1438600、14DZ2251400）

程競(jìng)儀 E-mail：jingyi.cheng@sphic.org.cn

（2016-08-22

2016-09-07）