蔡義林,袁愛夢(mèng),蔡珺珂,李　彤,李　穎,齊　斌,朱穎越,*

(1.常熟理工學(xué)院,生物與食品工程學(xué)院,江蘇常熟 215500;2.中國(guó)礦業(yè)大學(xué)化工學(xué)院,江蘇徐州 221000)

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基于配子的抗生素檢測(cè)研究進(jìn)展

蔡義林1,2,袁愛夢(mèng)1,蔡珺珂1,李彤1,李穎1,齊斌1,朱穎越1,*

(1.常熟理工學(xué)院,生物與食品工程學(xué)院,江蘇常熟 215500;2.中國(guó)礦業(yè)大學(xué)化工學(xué)院,江蘇徐州 221000)

抗生素因其療效顯著被廣泛的使用,然而其濫用對(duì)人類所帶來(lái)的危害也逐漸被重視。核酸配子作為一種“化學(xué)抗體”,隨著配子篩選技術(shù)的改進(jìn)對(duì)靶目標(biāo)具有更高的特異性和親和力。本文對(duì)以核酸配子為基礎(chǔ)所建立的生物傳感方法檢測(cè)抗生素的研究進(jìn)展做了概括,分別從電化學(xué)、光學(xué)、酶聯(lián)免疫等方面對(duì)近些年來(lái)學(xué)者構(gòu)建的新型傳感方法進(jìn)行介紹,以展現(xiàn)配子技術(shù)在抗生素檢測(cè)上的研究方法和應(yīng)用潛力。

核酸配子,抗生素,傳感器,檢測(cè)

抗生素是生物在其生命活動(dòng)中產(chǎn)生的能選擇性抑制和影響他種生物功能的有機(jī)物質(zhì),其在促進(jìn)生長(zhǎng)、治療和預(yù)防感染性疾病方面得到廣泛且大量的應(yīng)用,不可避免的造成環(huán)境中抗生素的殘留,最終可經(jīng)過食物鏈在人體內(nèi)累積,導(dǎo)致人身體內(nèi)微生物環(huán)境平衡的紊亂和失調(diào),對(duì)人體健康造成威脅[1-3]。

配子是指能與靶分子特異性結(jié)合的核苷酸序列[4-5]。相對(duì)于傳統(tǒng)的蛋白抗體,配子能與靶目標(biāo)結(jié)合形成更穩(wěn)定的化合物且特異性較高。一種物質(zhì)的配子篩選時(shí)間并不長(zhǎng),可以通過PCR技術(shù)放大,進(jìn)而能大量制備。配子制備簡(jiǎn)單,易于修飾,并能長(zhǎng)期保存,且與目標(biāo)物作用條件可控。因此配子基傳感技術(shù)具有很好的應(yīng)用前景。本文在總結(jié)國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究的基礎(chǔ)上,結(jié)合配體技術(shù)在抗生素檢測(cè)方向的研究方法與類型,以及環(huán)境中幾種典型抗生素(四環(huán)素、土霉素和磺胺類等)的殘留檢測(cè)方法,對(duì)現(xiàn)階段配子基生物傳感技術(shù)進(jìn)行了分類和對(duì)比分析。

1　抗生素配子的篩選和構(gòu)建

經(jīng)典的配子指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)[6]將靶目標(biāo)與文庫(kù)進(jìn)行混合反應(yīng),結(jié)合分離技術(shù)和PCR擴(kuò)增分離出靶目標(biāo)的配子文庫(kù),并對(duì)文庫(kù)進(jìn)行克隆、測(cè)序,篩選出單一配子。隨著磁珠、毛細(xì)管電泳以及PCR等技術(shù)的發(fā)展,篩選技術(shù)得到不斷的提高。研究者們通過SELEX技術(shù)在寡核苷酸庫(kù)中篩選出對(duì)目標(biāo)物具有高特異性、高親和力的抗生素配子。

Song等[7]通過親和色譜法在試管內(nèi)篩選出對(duì)卡那霉素具有特異性綁定的卡那霉素配子DNA(ssDNA),熒光強(qiáng)度分析表明其與卡那霉素的解離常數(shù)為78.8nmol/L。Mehta等[8]通過篩選技術(shù)設(shè)計(jì)了氯霉素的DNA配子,得到兩段富含鳥嘌呤G(>35%)的氯霉素配子,通過對(duì)配子綁定分析,其分離常數(shù)為0.8和1 μmol/L。Zhou等[9]利用修飾的磁珠結(jié)合指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(SELEX技術(shù))得到鏈霉素的配子DNA,非線性回歸分析表明,此配子的分離常數(shù)為199.1 nmol/L,且具有很好的特異性。Kim等[10]通過間接性酶聯(lián)免疫競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)和SELEX技術(shù)篩選得到土霉素的配子DNA,分離常數(shù)為4.7 nmol/L,遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于先前Niazi[11]篩選出的土霉素配子分離常數(shù)56.84 nmol/L。

表1　熒光傳感檢測(cè)抗生素

2　配子識(shí)別技術(shù)在抗生素檢測(cè)中的應(yīng)用

2.1抗生素常用的檢測(cè)方法分析

食品中抗生素殘留檢測(cè)受到人們的廣泛關(guān)注。高效液相色譜法(HPLC)、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)、表面等離子體共振以及毛細(xì)管電泳法等[12-14]已經(jīng)被應(yīng)用于檢測(cè)抗生素。然而,這些方法操作繁瑣,耗時(shí)長(zhǎng),通常需要復(fù)雜的樣品預(yù)處理和昂貴的儀器。配子傳感器具有較好的選擇性,靈敏度,構(gòu)造簡(jiǎn)單，操作方便。此外,核酸配子作為生物探針,可以通過堿基配對(duì)作用以及分子內(nèi)作用,形成不同的三維空間結(jié)構(gòu)或閉合結(jié)構(gòu),具有較高的靈活性,通過特殊設(shè)計(jì)的配子已經(jīng)被學(xué)者應(yīng)用于抗生素的檢測(cè)[15-16]。

2.2配子基熒光傳感檢測(cè)抗生素

熒光傳感技術(shù)是基于具有熒光效應(yīng)的化學(xué)物質(zhì)或量子點(diǎn)構(gòu)建的配子基生物傳感器,通過核酸配子與目標(biāo)物的變構(gòu)作用,提供增強(qiáng)或減弱激發(fā)單重態(tài)的環(huán)境或以能量共振轉(zhuǎn)移為基礎(chǔ),改變熒光量子效率,實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的檢測(cè)(表一)。

Li等[17]通過酰胺反應(yīng)EDC-NHS方法將氨基化的卡那霉素配體標(biāo)記到十八烯酸修飾的稀土上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料(NaYF4:Yb,Er)上,由于ssDNA與石墨烯之間的π-π相互堆積作用,使能量供體稀土上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料和能量受體石墨烯靠近,兩者發(fā)生能量共振轉(zhuǎn)移,引起熒光淬滅,但當(dāng)加入卡那霉素后,配子與卡那霉素作用形成發(fā)夾結(jié)構(gòu),從而不能吸附在石墨烯上,基于此構(gòu)建的熒光傳感器的檢測(cè)限可達(dá)9 pmol/L,線性范圍為0.01～3 nmol/L。Leung等[18]利用四面體熒光物質(zhì)鉑復(fù)合物[Pt(CN＾N)Cl]單獨(dú)存在時(shí)較弱的熒光效應(yīng),而與雙鏈DNA共存時(shí)熒光得到加強(qiáng)的特性,設(shè)計(jì)了一種配子基熒光傳感器,當(dāng)卡那霉素不存在時(shí),DNA呈自由狀態(tài),體系熒光強(qiáng)度無(wú)變化,卡那霉素的加入使ssDNA轉(zhuǎn)變?yōu)橐粋€(gè)包含發(fā)夾結(jié)構(gòu)形態(tài),此時(shí)鉑復(fù)合物存在于ssDNA構(gòu)象中熒光得到增強(qiáng)。

Chen等[19]利用銀納米簇(AgNCs)與DNA胞嘧啶的組合發(fā)光效應(yīng),將磁珠與DNA進(jìn)行結(jié)合,磁珠上DNA的互補(bǔ)DNA為赭曲霉毒素A配子,當(dāng)體系中含有赭曲霉毒素A時(shí),與其配子特異性結(jié)合,磁珠分離過程中,上清液體系中仍存在含有胞嘧啶的配子,當(dāng)加入Ag+/NaBH4時(shí),生成的銀納米簇與胞嘧啶作用發(fā)出熒光,熒光強(qiáng)度與赭曲霉毒素A濃度呈正相關(guān)性,此熒光傳感器的檢測(cè)限達(dá)到2 pg/mL。Wu等[20]將生物素修飾的氯霉素配子與親和素修飾的磁納米顆粒(Fe3O4MNPs)相結(jié)合,將氨基化的與配子互補(bǔ)的DNA與納米上轉(zhuǎn)換熒光納米材料(NaYF4:Yb,Er)相結(jié)合,當(dāng)溶液中有含有氯霉素時(shí),磁納米顆粒上的配子與氯霉素連接,不能與互補(bǔ)DNA修飾的熒光納米材料形成二聚體,在磁力分離作用下,分離體系中的熒光信號(hào)強(qiáng)度發(fā)生改變,以此可以檢測(cè)氯霉素,檢測(cè)限可達(dá)0.01 ng/mL,線性范圍為(0.01～1) ng/mL,研究者將這種檢測(cè)方法應(yīng)用于牛奶樣品中的氯霉素檢測(cè),得到較好結(jié)果。

2.3配子基比色傳感檢測(cè)抗生素

比色生物傳感技術(shù)廣泛應(yīng)用于配子基生物傳感器,此類傳感技術(shù)大部分以金納米體系為基礎(chǔ),結(jié)合目標(biāo)物與配子之間的高親和力特性,以及ssDNA的堿基互補(bǔ)配對(duì)和具有的負(fù)電性磷酸骨架,改變?nèi)芤褐宣}或陽(yáng)離子聚合物等能引起金納米體系聚集物質(zhì)的濃度,在體系的吸光值與目標(biāo)物質(zhì)的濃度建立對(duì)應(yīng)關(guān)系,實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的識(shí)別檢測(cè)(表2)。

Song等[7]將卡那霉素配子應(yīng)用于金納米比色傳感器的構(gòu)建,由于DNA能附著在納米金表面,對(duì)一定鹽濃度的金納米溶液具有分散作用,當(dāng)在溶液中加入卡那霉素后,配子與卡那霉素結(jié)合從納米金表面剝落,不能維持特定鹽濃度下金納米的分散性,溶液的吸光度發(fā)生改變,基于此特性構(gòu)建的生物傳感器檢測(cè)限為25 nmol/L。Zhou等[9]同樣利用納米金比色方法檢測(cè)鏈霉素,通過紫外掃描得到的檢測(cè)范圍為0.2～1.2 μmol/L,通過蜂蜜中的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)表明所構(gòu)建比色傳感器具有很好的實(shí)際應(yīng)用前景。Kim等[21]采用類似比色方法以土霉素配子檢測(cè)土霉素,得到的檢測(cè)限為25 nmol/L,完全滿足美國(guó)環(huán)保局對(duì)此類抗生素的檢測(cè)要求。Niu等[22]利用卡那霉素配子、腺苷酸配子以及磺胺地索幸配子構(gòu)建的金納米比色傳感器,根據(jù)不同的納米金溶液的顏色變化(紅色-紫色/藍(lán)色)實(shí)現(xiàn)了三種物質(zhì)的同時(shí)檢測(cè)分析。

表2　比色傳感檢測(cè)抗生素

2.4配子基電化學(xué)傳感檢測(cè)抗生素

電化學(xué)配子傳感器是由固定了適體的電極和電化學(xué)活性識(shí)別元素構(gòu)成。將配子作為分子識(shí)別元素固定在電極上,以電化學(xué)電極作為換能器,當(dāng)待測(cè)目的物加入電極體系,目的物與適體作用從而導(dǎo)致電極表面結(jié)構(gòu)的變化,然后通過檢測(cè)電極表面電活性識(shí)別元素的電信號(hào)來(lái)達(dá)到識(shí)別和鑒定靶物質(zhì)的目的(表3)[23-24]。

Zheng等[27]建立一種老鼠血樣中土霉素的測(cè)定方法,土霉素配子互補(bǔ)DNA兩端分別修飾上氯化二茂鐵和巰基,將此DNA連接在電極表面,利用DNA的堿基互補(bǔ)性使氯化二茂鐵遠(yuǎn)離電極表面,加入土霉素后,配子被競(jìng)爭(zhēng)性剝離,氯化二茂鐵靠近電極表面進(jìn)而改變電子傳遞效應(yīng),所構(gòu)建傳感器對(duì)鼠血樣中土霉素的具有很好的檢測(cè)結(jié)果。Sanaz[28]同樣以氯霉素配子構(gòu)建的金電極傳感器檢測(cè)氯霉素,得到的檢測(cè)限為1.9 nmol/L。Sun等[29]將殼聚糖-金納米顆粒(CS-AuNPs),石墨烯-金納米顆粒(GR-AuNPs),多壁碳納米管-酞菁鈷材料(MWCNTs-CoPc)組合應(yīng)用于卡那霉素的檢測(cè),首先將CS-AuNPs、GR-AuNPs、MWCNTs-CoPc納米混合物依次滴定在金電極上,通過各納米復(fù)合物的協(xié)同效應(yīng)加強(qiáng)電子傳遞效率和電極的靈敏度,然后將氨基化的卡那霉素配子1修飾在混合物表面,用牛血清蛋白阻塞未連接配子的活性位點(diǎn),加入鏈霉親和素-辣根過氧化物酶-配子2混合物構(gòu)成整個(gè)檢測(cè)系統(tǒng),當(dāng)加入卡那霉素后,辣根過氧化物酶的電子傳遞效應(yīng)循環(huán)增加,檢測(cè)過氧化物酶催化雙氧水氧化反應(yīng)多產(chǎn)生的電流效應(yīng)以確定卡那霉素的濃度。所構(gòu)建方法具有很高的靈敏度和特異性且檢測(cè)限達(dá)5.8 nmol/L。

表4　免疫學(xué)傳感檢測(cè)抗生素

水凝膠是由親水性聚合物構(gòu)成的具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的類似于軟組織的物理膠體,能與大量水融合,具有生物相容性,其電化學(xué)性能已經(jīng)被廣泛研究[29-30]。Ezat等[31]通過堿性處理從動(dòng)物蛋白中得到一種膠質(zhì),將巰基化氯霉素配子修飾在金電極上,然后用膠質(zhì)包裹制成一種電化學(xué)芯片,當(dāng)?shù)渭勇让顾卦陔姌O表面時(shí),由于配子目標(biāo)物的特異性結(jié)合導(dǎo)致金電極表面電流發(fā)生變化,以此來(lái)檢測(cè)氯霉素的含量,檢測(cè)限為0.183 nmol/L,具有較好的選擇性和穩(wěn)定性。

2.5配子基酶聯(lián)免疫吸附傳感檢測(cè)抗生素

酶聯(lián)免疫吸附是將抗原抗體免疫反應(yīng)的特異性和酶的高效催化結(jié)合起來(lái)用于檢測(cè)的一種技術(shù)。核酸配子作為“化學(xué)抗體”對(duì)目標(biāo)物質(zhì)具有很高的親和力和特異性,且制備簡(jiǎn)單,便于修飾,故作為單鏈小分子的適體分子具有優(yōu)越性,而以適體為基礎(chǔ)的新型生物傳感器更勝一籌。以酶聯(lián)核酸適體分析為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法,因其檢測(cè)的簡(jiǎn)單性可廣泛應(yīng)用于食品抗生素檢測(cè)。

Lise等[32]在通過直接或間接酶聯(lián)競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)物的檢測(cè),在直接酶聯(lián)競(jìng)爭(zhēng)檢測(cè)中,將牛血清蛋白修飾的赭曲霉素連接在管壁上,牛血清固定的赭曲霉素和自由赭曲霉素競(jìng)爭(zhēng)性綁定生物素修飾的配子,然后利用鏈霉親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶對(duì)四甲基聯(lián)苯胺的催化顏色反應(yīng)確定赭曲霉素的濃度,所建立方法的檢測(cè)限為10 ng/mL。間接性競(jìng)爭(zhēng)檢測(cè)就是用親和素將生物素標(biāo)記的赭曲霉素配子固定在管壁上,利用辣根過氧化物酶標(biāo)記的赭曲霉素和自由赭曲霉素之間競(jìng)爭(zhēng)性綁定配子,然后通過辣根過氧化物酶的催化變色作用確定赭曲霉素的濃度,檢測(cè)限為1.4 ng/mL。Kim等[10]設(shè)計(jì)了一種類似的間接性酶聯(lián)競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)土霉素,通過加入生物素標(biāo)記的土霉素配子和非標(biāo)記的土霉素進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性綁定,對(duì)土霉素的檢測(cè)限為12.3 μg/L,并成功應(yīng)用于牛奶樣品中土霉素的檢測(cè)。Wang等[33]利用間接性酶聯(lián)競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)了對(duì)四環(huán)素的檢測(cè),線性檢測(cè)范圍為0.1～1000 ng/mL,檢測(cè)限為0.0978 ng/mL,將其應(yīng)用于蜂蜜中四環(huán)素的檢測(cè),回收率在92.09%～109.7%之間。

2.6其它配子基生物傳感檢測(cè)抗生素

表面等離子體共振波譜是一種免標(biāo)記高靈敏技術(shù),能夠詳細(xì)提供表面親和力和生物分子相互作用的親和力和動(dòng)力學(xué)信息。相較于其它方法,由表面等離子體共振得到的動(dòng)力學(xué)和綁定常數(shù)信息更加方便,快速,便于操作。加入分析物質(zhì)后,通過檢測(cè)金陣列的表面共振角改變確定綁定過程的信息,結(jié)合配子科技,這種技術(shù)已經(jīng)被應(yīng)用于抗生素的檢測(cè)[34]。N de los等[16]采用表面等離子體技術(shù)建立的方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)新霉素B的檢測(cè),檢測(cè)范圍達(dá)10～100 μmol/L,并且具有很好的特異性。

懸臂陣列傳感器作為一種能實(shí)時(shí)、高靈敏度的檢測(cè)技術(shù)近些年來(lái)受到很多學(xué)者的關(guān)注,懸臂陣列傳感技術(shù)具有較小的尺寸,靈敏的動(dòng)力學(xué)響應(yīng)和較高的準(zhǔn)確度,能夠?qū)⒎肿幼R(shí)別作用直接轉(zhuǎn)換為納米力學(xué)響應(yīng)信號(hào)。通過將功能化的受體分子固定在傳感器上,目標(biāo)分子被捕捉時(shí)會(huì)在傳感器的表面產(chǎn)生不同的壓力信號(hào),基于此實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)分子的檢測(cè)[35-36]。Hou等[37]采用懸臂陣列傳感技術(shù),將巰基化的土霉素配子綁定在單層分子膜懸臂上,將6-巰基1-乙醇化的單層分子膜作為參比懸臂,當(dāng)土霉素被配子綁定后,懸臂表面的壓力信號(hào)發(fā)生變化,以此檢測(cè)土霉素得到的線性范圍是1.0～100 nmol/L,檢測(cè)限為0.2 nmol/L。

抗體-抗原的特異結(jié)合性質(zhì)容易引起抗體修飾的微球體聚集,這種改變能夠通過統(tǒng)計(jì)學(xué)或光散射的方法進(jìn)行監(jiān)測(cè)[38-39]。采用此原則,將表面固定有抗體的膠體微球與抗原進(jìn)行反應(yīng),可以通過光散射強(qiáng)度檢測(cè)抗原的濃度。Kim等[40]將氨基化的土霉素配子視為化學(xué)抗體,固定在羧基化的微球表面,當(dāng)加入土霉素時(shí),由于土霉素配子具有多綁定區(qū)域,會(huì)引起微球的聚集,改變光散射強(qiáng)度,所構(gòu)建方法的檢測(cè)限可達(dá)100 μg/L,線性范圍為100～104 μg/L，并且具有很好的特異性。

3　結(jié)論與展望

抗生素對(duì)人類健康的威脅已成為重大環(huán)境問題,發(fā)展簡(jiǎn)單高效,快速靈敏的抗生素檢測(cè)方法至關(guān)重要。SELEX技術(shù)結(jié)合新型篩選體系的構(gòu)建,使得目標(biāo)配子的篩選更加容易,而且配子作為“化學(xué)抗體”合成簡(jiǎn)單,具有類似于抗體-抗原的特異性結(jié)合性質(zhì)。隨著新型材料的應(yīng)用和納米技術(shù)的發(fā)展,氧化石墨烯、磁納米顆粒、金納米顆粒、熒光量子點(diǎn)等,使各類生物傳感器的構(gòu)建變的容易,實(shí)時(shí)檢測(cè)能力也得到提高。

綜上所述,相較于傳統(tǒng)的檢測(cè)系統(tǒng),配子基生物傳感器極具發(fā)展?jié)摿?。由于此類生物傳感器的靈敏度受到體系溫度、pH以及降解酶等的干擾,作為一種應(yīng)用型的分析檢測(cè)技術(shù)還需要進(jìn)行改進(jìn)。篩選技術(shù)的發(fā)展和后處理方法的完善,可以使篩選配子的專一性、親和力以及抗降解能力得到提高,配子基傳感技術(shù)的多樣化、簡(jiǎn)便性以及可靠性必將為抗生素的實(shí)際檢測(cè)提供可行的應(yīng)用研究基礎(chǔ),為抗生素的快速檢測(cè)提供新型的方法。

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Research advance in antibiotics detection based on aptamer

CAI Yi-lin1,2,YUAN Ai-meng1,CAI Jun-ke1,LI Tong1,LI Ying1,QI Bin1,ZHU Ying-yue1,*

(1.School of Biotechnology and Food Engineering,Changshu Institute of Technology,Changshu 215500,China;2.School of Chemical Engineering & Technology,China University of Mining and Technology,Xuzhou 221000,China)

Antibiotics has been widely used for its distinctive curative effect in the treatment of diseases,however,the overuse of antibiotics and harmful social problems has become a public problem affecting public health. Aptamers,a kind of chemical antibodies,reveal higher specificity and affinity to target with the improvement of aptamer screening technology. In this paper,the latest research recently for some sensing methods based on aptasensing technologies were summarized,from the electrochemistry,optics and enzyme-linked immunology respectively,which showed the application ability of aptamers in antibiotics detection and its potential applications in the exploration of research methods.

aptamer;antibiotics;sensor;detection

2016-01-20

蔡義林(1989-)，男，碩士，研究方向：生物檢測(cè)分析，E-mail：yilin10sky@163.com。

朱穎越(1983-)，男，博士，講師，研究方向：食品安全與檢測(cè)，E-mail：yyzhujnu@163.com。

江蘇省基礎(chǔ)研究計(jì)劃(自然科學(xué)基金)項(xiàng)目(BK20130379，BK20140416)；江蘇省“六大人才高峰”第十二批高層次人才選拔培養(yǎng)(NY-021)；蘇州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(SYN201515)；2016年度大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(省級(jí)立項(xiàng))資助。

TS207.3

A

1002-0306(2016)16-0368-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.16.065