陶曉亞,李家寅,韓雪源,黃　斯,茅林春

(浙江大學食品科學與營養(yǎng)系,馥莉食品研究院,浙江省農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室,浙江杭州 310058)

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脫落酸對采后番茄愈傷次生代謝物質(zhì)合成的影響

陶曉亞,李家寅,韓雪源,黃斯,茅林春*

(浙江大學食品科學與營養(yǎng)系,馥莉食品研究院,浙江省農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室,浙江杭州 310058)

為研究脫落酸(abscisic acid,ABA)對采后番茄愈傷次生代謝物質(zhì)合成的影響,以綠熟期櫻桃番茄為材料,對果實損傷處理后,分別用ABA及其合成抑制劑氟啶酮(fluridone,FLD)抽真空滲透處理,黑暗條件下貯藏愈傷,每天取樣測定相關生理指標。測定了果實失重率,傷口部位的總酚、類黃酮含量及相關酶活性,丙二醛(MDA)含量。結果表明:與對照相比,ABA處理減緩果實失重率升高,可有效促進傷口部位總酚、類黃酮的積累,提高與此相關的苯丙氨酸解氨酶(PAL)、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)活性,降低丙二醛(MDA)含量,減少傷口部位氧化損傷,加速傷口愈合;FLD處理則起相反作用,加劇傷口部位氧化損傷,減緩傷口愈合進程。以上結果說明,ABA對采后番茄愈傷次生代謝物質(zhì)合成具有促進作用。

脫落醛,采后,番茄,愈傷,次生代謝物質(zhì),酶活性

果蔬采后易受機械損傷,這將導致果蔬品質(zhì)下降,經(jīng)濟價值降低[1]。在生物化學方面,機械損傷將誘發(fā)一系列脅迫生理反應以促進傷口愈合,例如受苯丙氨酸解氨酶(PAL)調(diào)控的苯丙烷類代謝速度加快,誘導傷口及鄰近部位合成更多的酚類和類黃酮等次生代謝物質(zhì)[2-4]。另一方面,植物受損傷脅迫時,細胞膜會發(fā)生膜質(zhì)過氧化,造成氧化損傷。這將增加植物體內(nèi)與抗氧化相關的酶如超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)的含量。SOD和CAT是果蔬中最主要的活性氧清除劑,能有效地清除自由基,減輕過量自由基對果蔬的毒害作用。

脫落酸(abscisic acid,ABA)是一種植物衰老相關激素,具有抑制種子萌發(fā)、促進氣孔關閉、促進衰老等作用。而其在逆境脅迫下,能誘導植物產(chǎn)生抗性,是植物的抗逆誘導因子,被稱為植物的“脅迫激素”[5]。當植物處于干旱、損傷等不利環(huán)境時,體內(nèi)ABA含量大增,啟動自我修復機制,阻止有害物質(zhì)的進一步侵害[6]。目前,關于ABA促進損傷愈合的研究主要集中在馬鈴薯塊莖方面,而其對采后果蔬愈傷及次生代謝物質(zhì)合成的研究鮮有報道。本實驗采用ABA及其合成抑制劑氟啶酮(fluridone,FLD)處理損傷的番茄果實,研究ABA對果實愈傷過程總酚和類黃酮物質(zhì)含量及相關酶活性的影響,以期為加速采后番茄傷口愈合提供理論依據(jù)。

表1　番茄果實傷口部位ABA含量

注:不同字母代表相同處理組不同貯存時間的樣品差異顯著(p<0.05)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

綠熟期櫻桃番茄“新太陽”采自浙江省蕭山市溫室,于采后2 h內(nèi)運回實驗室,挑選形狀、大小一致,無機械損傷的番茄果實作為實驗材料;ABA(≥ 90%)、沒食子酸(>99%)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、l-苯丙氨酸(≥ 98.5%)、甲硫氨酸(≥ 99%)上海Aladdin試劑有限公司;蘆丁(≥ 98%)、考馬斯亮藍G-250(≥ 85%)、氮藍四唑(NBT,≥ 98%)、核黃素(97.5%～102.0%)上海國藥集團;FLD(99.8%)德國Fluka Analytical;牛血清白蛋白(>98%)上海生工生物工程股份有限公司;其余試劑均為分析純。

Agilent 6460 HPLC-MS美國Agilent 科技有限公司;UV-1750紫外可見分光光度計日本島津公司;UNIVERSAL 320R臺式高速離心機德國Hettich Lab Technology;SHZ-D III循環(huán)水式多用真空泵杭州明遠儀器有限公司;HWS型恒溫恒濕箱寧波東南儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1樣品處理用0.5%次氯酸鈉溶液清洗果實表面,無菌去離子水沖洗后室溫晾干備用。參考Dean和Kolattukudy[7]的方法進行損傷處理:用經(jīng)75%酒精擦拭消毒的手術刀在果實赤道處對稱切除2個直徑約10 mm、厚度1～2 mm的薄片。將損傷后的果實隨機分成3組,分別用1.0 mmol/L ABA、0.1 mmol/L FLD和無菌去離子水(對照)抽真空處理(0.07 MPa,5 min)。室溫自然晾干后于黑暗條件下(20 ℃,90% RH)貯藏愈傷。每天取樣時用已消毒的打孔器切取愈傷組織(10 mm×3 mm),液氮迅速冷凍,于-80 ℃冰箱中保存待用。處理方法和藥品濃度均根據(jù)預實驗結果確定。

1.2.2ABA含量測定參考Chen等[8]的方法提取ABA,采用HPLC-MS測定ABA含量。進樣柱型號規(guī)格:ZORBAX Eclipse XDB-C18(2.1 mm× 150 mm×3.5 μm)。流動相A為甲醇,B為0.1%甲酸,洗脫體系:0～1.5 min,40% A;1.5～8 min,40% A升至100% A;8～10 min,100% A降至40% A;10～17 min,40% A。柱溫:35 ℃,流速:300 μL/min,進樣量:10 μL。

1.2.3總酚和類黃酮含量測定稱取約1 g樣品,加入6 mL 40%的乙醇溶液充分研磨后,60 ℃水浴保溫1 h,9000×g離心15 min,上清液用于測定總酚和類黃酮含量。

總酚含量測定參考Toor和Savage[9]的方法,結果以每100 g樣品中相當于沒食子酸的毫克數(shù)表示,即mg/100 g。類黃酮含量測定采用Zhishen等[10]的方法,結果以每100 g樣品中相當于蘆丁的毫克數(shù)表示,即mg/100 g。

1.2.4損傷番茄果實失重率測定

失重率(%)=(m0-mt)/m0×100

式中,m0:果實初始質(zhì)量;mt:果實檢測時的質(zhì)量。

1.2.5酶活性測定稱取約1 g樣品,分別加入4 mL經(jīng)4 ℃預冷的0.1 mol/L硼酸硼砂緩沖液(pH8.7,含3 g/L PVP,1 mmol/L EDTA)和50 mmol/L PBS(pH7.8,含1 mmol/L EDTA,2 g/L PVP),冰浴研磨,所得勻漿于4 ℃下9000×g離心15 min,上清液分別用于PAL、SOD和CAT活性測定。

PAL活性測定方法參考Yingsanga等[11],以波長290 nm處吸光度值每小時增加0.01為1 U,表示為U/mg(蛋白)。

可溶性蛋白含量測定參考Bradford[12]。

SOD活性測定參考Stewart和Bewley[13],以抑制NBT光化還原50%的酶量為一個酶活力單位U,以U/g(FW)表示。

CAT活性測定參考曹建康等[14],以1 min內(nèi)吸光度值減少0.01為一個酶活力單位U,以U/g(FW)表示。

1.2.6丙二醛(MDA)含量測定MDA含量測定參考曹建康等[14]的方法。

1.2.7數(shù)據(jù)處理以上實驗均重復三次。采用SPSS Statistics 20進行統(tǒng)計分析。

2　結果與分析

2.1番茄傷口部位ABA含量變化

ABA組番茄傷口部位ABA含量在愈傷期間始終高于對照組,表明真空滲透處理方法是卓有成效的,可以保證整個愈傷過程中傷口部位ABA含量維持在較高水平。FLD組ABA含量在愈傷前2 d與對照組無明顯差異(p>0.05),從第3 d開始明顯低于對照組(p<0.05),表明FLD可以抑制果實傷口部位合成新的ABA。

2.2ABA對番茄果實失重率的影響

愈傷可減少傷口表面水分蒸發(fā),愈合程度越高,水分蒸發(fā)越慢,失重率越小,因此,可用失重率來反映損傷愈合程度。隨貯存時間增加,三組處理番茄果實失重率逐漸上升,但處理組間上升程度有差異(圖1)。貯存第1 d,ABA組與對照組無顯著差異(p>0.05),貯存第2 d,FLD組與對照組差異不大(p>0.05),貯存后期,三組處理差異顯著(p<0.05)。ABA組始終低于對照組,FLD組始終高于對照組,因此采用ABA處理番茄傷口后,可以明顯促進愈傷,抑制水分蒸發(fā),降低失重率。

圖1　損傷番茄果實失重率變化Fig.1　Changes of weight loss in wounded tomato fruit

2.3ABA對番茄傷口處總酚和類黃酮含量的影響

番茄果實愈傷過程總酚含量總體表現(xiàn)為升高、降低、升高(圖2)。損傷后ABA組總酚含量立即升高,第2 d達到最大值,是愈合前的1.23倍,愈合后期含量基本穩(wěn)定,始終高于對照組。FLD組和對照組則稍有降低,之后升高,第2 d達到最大值,分別是愈合前的1.08倍和1.15倍,兩者變化趨勢基本一致,FLD組始終低于對照組,兩者有明顯差別(p<0.05)。愈合后期,各處理組果實總酚含量無顯著差異(p>0.05)。

圖2　番茄果實傷口部位總酚含量Fig.2　Total phenol content in wound tissues of tomato fruit

番茄傷口部位類黃酮含量隨愈合時間延長逐漸增加(圖3)。ABA組類黃酮含量始終高于對照組,FLD組則始終低于對照組。愈合第1 d,FLD組與對照組無顯著差異(p>0.05),愈合第2 d,ABA組與對照組無顯著差異(p>0.05)。愈合第3、4 d,ABA和FLD組與對照組相比,分別增加5.69%、5.84%,降低8.21%、13.25%。

圖3　番茄果實傷口部位類黃酮含量Fig.3　Flavonoids content in wound tissues of tomato fruit

2.4ABA對PAL活性的影響

愈傷可誘導PAL產(chǎn)生,其活性可作為植物抗逆能力的重要指標[15]。圖4顯示,在番茄愈傷期間PAL活性先升高后降低。愈合第1 d,ABA和FLD組與對照組相比,酶活性分別增加了110.68%、降低了17.42%。愈合第3 d,ABA組和對照組酶活性達到最大值,分別是愈合前的5.17倍、3.79倍,而FLD組是愈合前的2.33倍。ABA組PAL活性明顯高于對照組(p<0.05),FLD組初期與對照組差異不顯著(p>0.05),后期明顯低于對照組(p<0.05)。

圖4　番茄果實傷口部位PAL活性Fig.4　PAL activity in wound tissues of tomato fruit

2.5ABA對SOD、CAT活性的影響

圖5　番茄果實傷口部位SOD活性Fig.5　SOD activity in wound tissues of tomato fruit

SOD對果蔬細胞清除活性氧起重要作用,其活性高低反映果蔬的抗逆能力。圖5顯示隨貯存時間增加SOD活性先升高后降低。貯存第1 d,對照組與ABA組SOD活性達到最大值,三個處理組差異顯著(p<0.05),與第0 d相比,對照組、FLD組和ABA組分別增加了22.19%、12.37%和41.77%。隨貯存時間延長,三組處理SOD活性逐漸降低,ABA組始終高于對照組,FLD組始終低于對照組,愈合后期三組處理之間差異顯著(p<0.05)。

圖6反映了不同處理番茄果實損傷部位CAT活性變化情況。損傷后ABA組CAT活性立即升高,之后緩慢下降,但始終高于對照組,對照組和FLD組則呈現(xiàn)先降低后升高再降低的變化趨勢,FLD組始終低于對照組。愈合初期,三個處理組CAT含量差異顯著(p<0.05),愈合第1 d,對照組、FLD組和ABA組分別是愈合前的0.92倍、0.82倍和1.14倍。愈合后期,對照組和FLD組差異不顯著(p>0.05),ABA組與對照組相比,始終差異顯著(p<0.05)。

圖6　番茄果實傷口部位CAT活性Fig.6　CAT activity in wound tissues of tomato fruit

2.6ABA對傷口處MDA含量的影響

機械損傷導致活性氧大量積累而促進膜質(zhì)過氧化,MDA是膜質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物,其積累量可以反映果實在逆境下受傷害的程度[16]。由圖7可知,番茄愈傷過程MDA含量呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢。愈合第1 d,三組處理MDA含量無顯著差異(p>0.05),隨愈合時間延長,MDA含量逐漸降低且差距逐漸加大。愈合第2 d,與對照組相比,FLD組MDA含量下降緩慢,與第1 d無明顯差別(p>0.05),ABA組則下降最快,但與對照組差別不大(p>0.05)。愈合第3、4 d,三組處理MDA含量有明顯差異(p<0.05),FLD組高于對照組,ABA組則低于對照組,但都高于第0 d。

圖7　番茄果實傷口部位MDA含量Fig.7　MDA content in wound tissues of tomato fruit

3　討論

ABA組番茄傷口部位ABA含量始終保持較高水平,FLD組則始終保持較低水平,這是因為FLD能有效抑制ABA合成前體類胡蘿卜素的形成,阻礙ABA合成[17]。

PAL是苯丙烷代謝的限速酶,調(diào)控代謝產(chǎn)物總酚和類黃酮等次生代謝物質(zhì)的合成。本實驗中,愈合部位總酚和類黃酮含量的整體變化趨勢與PAL活性變化結果基本一致。ABA處理使這兩種次生代謝物質(zhì)含量增加,PAL活性升高,增強果實對逆境的抵抗能力。這與對馬鈴薯塊莖研究的相關報道相一致[18-20]。而FLD處理則起相反作用[18],當ABA合成受阻時,損傷處誘導的PAL活性降低,施加ABA后,該誘導作用部分恢復[21]。此外,也有報道稱ABA處理能提高鎖陽莖PAL活性[22]。

SOD可催化超氧化物的歧化反應,是清除活性氧反應的第一個抗氧化酶,CAT可清除過氧化氫,兩者對植物防御氧化損傷起重要作用[23]。本實驗結果表明,在損傷初期,SOD活性快速增加,這可能是由于損傷打破了番茄組織細胞中酶和底物的空間區(qū)域化分布,使得兩者結合,酶活性增加[24]。之后活性逐漸降低,這可能是因為隨愈合時間增加,活性氧毒性逐漸減弱,果實抗性逐漸增強。與對照相比,ABA處理能顯著提高番茄傷口部位SOD與CAT活性,增強果實對損傷脅迫的抵抗能力,加速傷口清除自由基,減緩氧化損傷,提高番茄果實對損傷的抗性,這與段園園[22]等對鎖陽莖CAT活性研究結果基本一致。膜質(zhì)過氧化終產(chǎn)物MDA是反映果蔬受傷害程度的一個重要指標。本實驗中,損傷使得傷口表面細胞膜遭到破壞,誘導傷口部位MDA含量迅速上升,膜質(zhì)過氧化加劇,隨著傷口逐漸愈合,MAD含量也呈下降趨勢。與此對比,ABA處理能減輕傷口處細胞膜系統(tǒng)的受傷害程度,這可能與ABA促進傷口部位SOD和CAT活性升高有關。

4　結論

與對照相比,ABA處理減緩果實失重率升高,可有效促進傷口部位總酚、類黃酮的積累,提高與此相關的苯丙氨酸解氨酶(PAL)、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)活性,降低丙二醛(MDA)含量,減少傷口部位氧化損傷,加速傷口愈合;FLD處理則起相反作用,加劇傷口部位氧化損傷,減緩傷口愈合進程。以上結果說明,ABA對采后番茄愈傷次生代謝物質(zhì)合成具有促進作用。

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Effect of abscisic acid on secondary metabolite production during wound-healing in postharvest tomato fruit

TAO Xiao-ya,LI Jia-yin,HAN Xue-yuan,HUANG Si,MAO Lin-chun*

(Department of Food Science and Nutrition,Fuli Institute of Food Science,Zhejiang Key Laboratory of Agro-Food Processing,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China)

The effect of abscisic acid(ABA)on wound-healing,secondary metabolite production and related enzyme activities in postharvest mature green cherry tomato fruit was investigated in this study. Tomato fruit were treated under vacuum with ABA and fluridone(FLD)solution after wounding and allowed to heal in the dark. Weight loss of fruit,total phenol,flavonoids and MDA content,and enzyme activities(PAL,SOD,CAT)in wound tissues were determined every day during storage time. The results indicated that weight loss and MDA content were reduced in ABA-treated tomato fruit compared with control. ABA promoted wound-healing process by enhancing total phenol and flavonoids contents as well as PAL,SOD and CAT activities in wound tissues of tomato fruit. However,FLD treatment had the opposite effects. In conclusion,ABA promoted the synthesis of secondary metabolite production during wound-healing in postharvest tomato fruit.

ABA;postharvest;tomato;wound-healing;secondary metabolite production;enzyme activities

2016-01-20

陶曉亞(1990-),女,碩士,研究方向:果蔬采后損傷及修復,E-mail:taoxiaoya00@163.com。

茅林春(1962-),男,博士,教授,研究方向:農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮,E-mail:linchun@zju.edu.cn。

國家自然科學基金資助項目(31372113)。

TS255.3

A

1002-0306(2016)16-0330-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.16.058