陳曉堂　侯衍英　劉　超　張顯忠　李艷玲　郭東會　史仁玖

(泰山醫(yī)學(xué)院 山東省中藥生物技術(shù)重點實驗室，山東 泰安　271016)

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一株羽毛降解菌株的分離及鑒定

陳曉堂侯衍英劉超張顯忠李艷玲郭東會史仁玖

(泰山醫(yī)學(xué)院 山東省中藥生物技術(shù)重點實驗室，山東 泰安271016)

目的從廢棄羽毛堆積處土壤中分離篩選具有高效降解羽毛角蛋白的細菌。方法形態(tài)學(xué)觀察、生化測定和16 SrDNA序列分析鑒定菌株，測定蛋白水解研究酶活性檢及酶特性。結(jié)果鑒定該菌為嗜麥芽窄食單胞菌，降解羽毛的最適發(fā)酵培養(yǎng)溫度為30 ℃，最適pH是7.0，F(xiàn)e2+對酶活有促進作用，Cu2+、Zn2+、Mn2+對酶活有明顯抑制作用。結(jié)論嗜麥芽窄食單胞菌角蛋白酶的作用溫度和 pH寬泛、穩(wěn)定性好，具有良好的開發(fā)價值和應(yīng)用前景。

嗜麥芽窄食單胞菌；角蛋白酶；羽毛

羽毛的成分主要是角蛋白質(zhì)，是一類結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、不溶于的水硬性蛋白，目前缺乏高效的處置方法，通常采用高溫高壓、強酸強堿和擠壓膨化等物理化學(xué)方法斷開二硫鍵，工藝復(fù)雜，耗能多，容易引起環(huán)境污染[1]。目前，研究人員已分離到30多種降解角蛋白的微生物，包括細菌、真菌和放線菌[2-3]，但是多數(shù)羽毛降解菌降解羽毛效率不高，羽毛需要高溫高壓等處理，羽毛處理還需要篩選高效、直接利用羽毛的微生物菌株。本研究從堆積腐爛羽毛的養(yǎng)雞場土壤中篩選分離降解羽毛的菌株，通過菌株形態(tài)特征觀察、生理生化實驗和16S rDNA 分子鑒定法對該菌株鑒定為嗜麥芽窄食單胞菌，并探討了降解酶的特性。

1　 材料和方法

1.1 材料和培養(yǎng)基聊城和濟寧養(yǎng)雞場內(nèi)廢棄羽毛堆積處土樣。家禽市場收集的雞羽毛，自來水洗凈，純水洗3 次，60 ℃烘干至恒重。LB培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10 g，酵母浸提膏5 g，NaCl 10 g，pH 7.0；富集培養(yǎng)基(g/L)：碎羽毛7.5 g，酵母浸提膏1 g，K2HPO41 g，MgCl20.1 g，pH 7.0；初篩培養(yǎng)基(g/L)：酪蛋白10 g，K2HPO41.4 g，KH2PO40.7 g，NaCl 0.5 g，MgSO40.1 g，瓊脂20 g，pH 7.0；種子培養(yǎng)基(g/L)：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，pH 7.2；發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：整根羽毛10 g，K2HPO41.4 g，KH2PO40.7 g，NaCl 0.5 g，MgSO40.1 g，pH 7.0。

1.2羽毛降解菌株的分離及篩選富集：5 g 土樣加入20 ml ddH2O，取上清5 ml于200 ml富集培養(yǎng)基，30 ℃，120 r/min培養(yǎng)48 h；初篩：上清液稀釋涂布于初篩培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)，72 h后篩選透明圈較大的單菌落多次劃線純化，接斜面培養(yǎng)基保存?zhèn)溆?；?fù)篩：菌株接種到種子培養(yǎng)基，37 ℃，180 r/min， 24 h。5%的接種量轉(zhuǎn)接至基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，37 ℃，培養(yǎng)48 h，觀察羽毛降解情況。發(fā)酵液離心，上清液測定角蛋白酶活性和蛋白含量。

1.3 菌種鑒定方法顯微鏡觀察，革蘭氏染色，藥敏實驗參考細菌系統(tǒng)鑒定手冊[4]。16S rDNA鑒定，挑取單菌于10 ml 液體培養(yǎng)基，30 ℃ 200 r/min培養(yǎng)24 h。提取DNA作為PCR擴增模板，引物為細菌16S rDNA PCR，通用引物：27F-5'-CGGCTACCTTGTTACGACT-3'，1502F-5'-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'。1%的瓊脂糖電泳，回收DNA，連接到載體pMD18-T，轉(zhuǎn)化，華大基因公司測序，BLAST和DNAMAN 軟件比對分析。

1.4 角蛋白酶活的測定方法參照蔡成崗[4]測定角蛋白酶酶活方法，略有改動：4 ml發(fā)酵液，5000 r/min離心10 min，取1 ml上清液，加2 ml 50 mM Tris-HCl緩沖液，10 mg的酪蛋白，50 ℃、180 r/min反應(yīng)1 h，加2 ml 10%的三氯乙酸終止反應(yīng)，5000 r/min離心10 min，上清液280 nm處測其吸光度?？瞻捉M在加入酪蛋白前先加2 ml 10%的三氯乙酸提前終止其反應(yīng)(實驗設(shè)置三個水平，取其平均值)。酶活單位定義：實驗組對空白組每增加0.01吸光度所需要的酶量。

2　結(jié)果與分析

2.1高效降解羽毛菌株的分離及篩選初篩挑選出透明圈較大的單菌落進行復(fù)篩，發(fā)酵培養(yǎng)48 h后挑選羽毛降解情況較好的6支菌株(表1)，菌株B降解羽毛速度最快。

表1　6支菌株發(fā)酵液中羽毛被降解程度比較

注:+表示不同菌株對羽毛的降解程度。

測定菌株發(fā)酵液酶活性和蛋白含量，菌株B的酶活性最高，羽毛發(fā)酵液內(nèi)的降解蛋白質(zhì)量最高，結(jié)果表明菌株B降解羽毛角蛋白的能力最強(圖1)，選用菌株B進行下一步的研究。

圖1　6支菌株發(fā)酵液中酶活性和蛋白含量的比較

2.2菌種鑒定菌株B革蘭氏染色呈陰性，菌落形態(tài)為圓形、白色、凸起，表面濕潤、粘稠、有光澤，邊緣無缺刻，顏色一致。生化反應(yīng)：葡萄糖O/F試驗氧化產(chǎn)酸, 動力試驗陽性，氧化酶陰性，賴氨酸脫羧酶和 DNA酶陽性，水解七葉苷，能液化明膠，葡萄糖、乳糖、麥芽糖、 蔗糖均陽性，葡萄糖酸鹽陰性，初步鑒定為嗜麥芽窄食單胞菌。藥敏試驗表明，菌株對多種抗菌藥物有耐藥(表2)。

表2　菌株藥敏實驗

對該菌的16S rDNA序列進行測序，通過BLAST軟件比對分析，其與Stenotrophomonas maltophilia的相似性為99%，分子水平DNAMAN系統(tǒng)進化樹(圖2)結(jié)果表明該菌株為嗜麥芽窄食單胞菌。

圖2　基于16S rDNA序列和Neighbor-Joining構(gòu)建進化樹

2.3 酶特性研究

2.3.1 角蛋白酶的最適反應(yīng)溫度圖3表明角蛋白酶在20～50 ℃間均有較高活性，40 ℃下酶活性最高，超過50℃酶的酶活逐漸降低。

圖3　溫度對角蛋白酶酶活的影響

2.3.2角蛋白酶最適反應(yīng)pH角蛋白酶在堿性環(huán)境中酶活性較高，pH 7.0 時酶活性最高，達到145.35 U/ml(圖4)。

圖4　不同反應(yīng)體系pH對角蛋白酶活性的影響

2.3.3 金屬離子對角蛋白酶活性的作用

圖5　金屬離子對角蛋白酶活力的影響

金屬離子可以影響蛋白酶活性，對蛋白酶的活性起到激活或抑制作用，研究表明：Fe2+對酶活有促進作用，是對照的1.8倍；Na+、K+、Ca2+、Mg2+對酶活影響不顯著，Cu2+、Zn2+、Mn2+對酶活有明顯抑制作用(圖5)。

3　討　論

大量的廢棄羽毛，若不合理處置會污染環(huán)境，角蛋白酶是生物降解羽毛的關(guān)鍵酶，目前羽毛角蛋白降解菌的研究主要集中在真菌和放線菌[6]。本研究從養(yǎng)雞場廢棄羽毛的土壤中分離到1株高效降解羽毛的細菌，形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特征研究和16SrDNA序列比對結(jié)果分析, 鑒定為嗜麥芽窄食假單胞菌，命名Microbacterium sp.TSMC-1?？寺?6SrDNA，同源性分析構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，表明TSMC-1與假單胞菌屬細菌聚成一族。該菌株所產(chǎn)生酶及酶的作用條件溫和，酶在pH 7，溫度40℃酶活性較高，F(xiàn)e2+對酶活有促進作用，Cu2+、Zn2+、Mn2+對酶活有明顯抑制。菌株酶活性達137.95 U，與已篩選得到的菌株[7-8]相比，酶活性及降解能力較強，具有良好的開發(fā)和應(yīng)用價值。目前已克隆得到該菌的角蛋白酶基因片段，為下一步構(gòu)建角蛋白酶高產(chǎn)工程菌做好了準備。后續(xù)的實驗還將對角蛋白酶的結(jié)構(gòu)和功能進行研究，并進一步探索該菌株降解羽毛的機理。

[1] Cedrola S M L,de Melo A C N,Mazotto A M,et al.Keratinases and sulfide from Bacillus subtilis SLC to recycle feather waste[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology,2012,28(3):1259-1269.

[2]Ghasemi Y,Shahbazi M,Rasoul Amini S,et al. Identification and characterization of feather-degrading bacteria from keratin-rich wastes [J].Annals of Microbiology,2012,62(2):737-744.

[3]Evgenia V T,Adriana G,Georgi N.Ecologically safe method for improved feather wastes biodegradation[J].International Biodeterioration & Biodegradation,2009,63(8):1008-1012．

[4]東秀珠,蔡妙英.常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[M].北京:科學(xué)出版社,2001.

[5]蔡成崗.角蛋白酶生產(chǎn)菌株選育、發(fā)酵與分離純化研究[D].浙江大學(xué),2007.

[6]劉婕.羽毛降解菌的篩選、鑒定及產(chǎn)酶條件優(yōu)化[D].南寧:廣西大學(xué),2013.

[7]楊興旺,李術(shù)娜,李紅亞,等.高效產(chǎn)角蛋白酶芽孢菌株JDBM-1 的篩選及鑒定[J].內(nèi)蒙古大學(xué)學(xué)報,2014,45(4):391-397．

[8]劉曉迪,顧振紅,朱紅惠,等.一株羽毛降解菌產(chǎn)酶特性的初步研究[J].生物技術(shù)進展,2012,2(6):423-427．

Isolation and characterization of a feather-degrading bacterium

CHEN Xiao-tang HOU Yan-ying LIU Chao ZHANG Xian-zhong LI Yan-ling GUO Dong-hui SHI Ren-jiu

(Shandong Provincial Key Laboratory of Bio-Technology of Traditional Chinese Medicine, Taian 271016,China)

Objective: To isolate and characterize feather-degrading bacteria from soil of discarded feathers. Methods: Morphological observation, biochemical analysis and 16SrDNA sequence analysis were used for identifying bacteria, and the enzyme activity and enzyme properties were studied by mensurating protein hydrolysis.Results: The strain was identified as a strain of the genus Pseudomonas, The optimal pH and temperature for growth were 7.0 and 30 °C, Fe2+promote the activity of the enzyme, Cu2+, Zn2+, Mn2+inhibited the activity of the enzyme.Conclusion: This bacteria has the potential for the application of feather keratin sources because the keratinase of Stenotrophomonas maltophilia functional temperature and pH are broad and stable.

Stenotrophomonas maltophilia; feather, keratinase

山東省中醫(yī)藥科技發(fā)展計劃項目(2015-247)。

陳曉堂(1989—)，男，泰山醫(yī)學(xué)院2013級微生物與生化藥學(xué)研究生。

史仁玖，rjshi@tsmc.edu.cn。

Q939.9

A

1004-7115(2016)09-0968-03

10.3969/j.issn.1004-7115.2016.09.002

2016-04-11)