黃瓊

（1.四川大學(xué)生物治療國家重點實驗室 四川成都 610041；2.成都康華生物制品有限公司 四川成都 610100）

狂犬病毒滴度檢測噬斑法（PFU）的建立及應(yīng)用

黃瓊

（1.四川大學(xué)生物治療國家重點實驗室 四川成都 610041；2.成都康華生物制品有限公司 四川成都 610100）

目的 建立狂犬病毒滴度的快速、經(jīng)濟(jì)的檢測方法——噬斑法（PFU），驗證其與小鼠腦內(nèi)攻擊法（計算LD50）的相關(guān)性，并用于PM株狂犬病毒的滴度測定。 方法 狂犬病毒做10倍系列稀釋，然后接種于單層BHK21細(xì)胞上， 37℃、5%CO2吸附1h后，加入覆蓋液， 33℃、5%CO2培養(yǎng)7～10天后用1. 5%的結(jié)晶紫染色。用建立的噬斑法和小鼠腦內(nèi)攻擊法同時測定狂犬病毒的滴度，以比較兩種方法的相關(guān)性和重復(fù)性。結(jié)果 兩種方法測定狂犬病毒滴度的結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義，相關(guān)系數(shù)為0.939，兩種方法的檢測結(jié)果呈良好的正相關(guān)性。結(jié)論 噬斑法可替代小鼠腦內(nèi)滴定法檢測狂犬病毒滴度。

狂犬病毒 病毒滴度 噬斑法 小鼠腦內(nèi)滴定法

狂犬病是由狂犬病毒引起的一種迄今為止人類病死率最高的急性人畜共患傳染病,患者主要是中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生病變,一旦發(fā)病,死亡率高達(dá)100%。目前,還沒有有效的治療狂犬病的方法,免疫接種疫苗是預(yù)防該病發(fā)生的最有效措施［1］。

目前,國內(nèi)各企業(yè)包括藥典推薦,在測定狂犬病毒滴度的時候,仍采用小鼠腦內(nèi)滴定法,即采用通過測定小鼠50%致死量（LD50）來計算病毒滴度。該方法雖然傳統(tǒng)、經(jīng)典,但是需要使用大量動物、動物個體差異大、實驗費(fèi)用高、操作煩瑣、需要操作人員操作技能熟練、人為干擾因素較多,且需要14天的實驗觀察判定結(jié)果,耗時較長。因此,尋找一種快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定、經(jīng)濟(jì)的替代方法成為了一種必然趨勢。細(xì)胞PFU法,做為病毒滴定的另一種經(jīng)典方法,它是用病毒感染、破壞健康的指示細(xì)胞,然后病毒繼續(xù)增殖,繼續(xù)破壞周圍細(xì)胞,從而形成一個病毒感染的痕跡——空斑,通過有效的稀釋,該方法能有效地反映樣品中病毒的含量,并且通過使用相應(yīng)病毒敏感細(xì)胞,能較快得到實驗結(jié)果,快捷、經(jīng)濟(jì)、有效。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用病毒、細(xì)胞和動物

Pitman-Moore狂犬病毒固定株,購自美國維斯塔研究所。適應(yīng)狂犬病毒生長的倉鼠腎細(xì)胞（BHK21細(xì)胞）。11～13g的昆明小鼠,購自成都達(dá)碩生物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑及器材

MEM培養(yǎng)基,購自日水株式會社；小牛血清,購自蘭州民海生物工程有限公司；甲基纖維素,購自SIGMA；結(jié)晶紫,購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。6孔細(xì)胞培養(yǎng)板。

1.2 方法

1.2.1 噬斑法

將病毒樣品進(jìn)行10倍系列稀釋,接種至已鋪滿單層指示細(xì)胞的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,0.2ml/孔。然后于5% CO2、37℃條件下吸附1h,每隔10～15min輕搖板一次,然后加入覆蓋液（用1%的甲基纖維素溶液配制的MEM溶液）,4ml/孔。

于5% CO2、33℃培養(yǎng)7～10天后,棄去覆蓋液,加入1.5%結(jié)晶紫染色液,1～3ml/孔,30～40min后棄去染色液,用自來水沖洗至流水無色透明,細(xì)胞培養(yǎng)板孔內(nèi)噬斑清晰可見。統(tǒng)計各孔蝕斑數(shù),計算結(jié)果。

1.2.2 小鼠腦內(nèi)滴定法

將病毒樣品進(jìn)行10倍系列稀釋,腦腔接種11～13g的昆明小鼠,每個稀釋度注射6只,0.03ml/只。連續(xù)觀察14天,每天記錄死亡及典型發(fā)病情況,3天后死亡或呈典型發(fā)病癥狀的小鼠均計入死亡數(shù)內(nèi),計算LD50。

表1 兩種方法病毒滴度檢測結(jié)果比較Table 1 The comparison results of two methods testing the virus titer

2 結(jié)果

取20份病毒液樣品分別用噬斑法和小鼠腦內(nèi)滴定法測定病毒滴度,結(jié)果見表1。噬斑法測得的lgPFU/ml值的范圍為5.2～7.3,平均值為6.24,用小鼠腦內(nèi)滴定法測得的lgLD50/ml l值的范圍為4. 9～7.0,平均值為6.14,經(jīng)統(tǒng)計分析,這兩種方法的測定結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.610）,相關(guān)系數(shù)為0.939,說明這兩種方法的檢測結(jié)果呈良好的正相關(guān)性。

3 討論

在國內(nèi)外,關(guān)于使用體外細(xì)胞滴定法替代小鼠腦內(nèi)滴定法的研究一直未曾間斷,且已證實兩種方法具有相關(guān)性［2］,如今國內(nèi)外對小鼠腦內(nèi)滴定法的替代法的研究,主要集中于免疫熒光法（FFU）［3］,該方法更快捷,但是需要購買的狂犬病特異性單克隆抗體較貴,而且需要配置熒光顯微鏡,在不具備這些條件的情況出發(fā),根據(jù)病毒滴度指標(biāo)對生產(chǎn)過程控制、指導(dǎo)的意義的程度考慮,我們決定選擇更經(jīng)濟(jì)、較快捷的噬斑法進(jìn)行研究分析,將其測定的病毒滴度結(jié)果與小鼠腦內(nèi)滴定法的檢測結(jié)果進(jìn)行了比較,結(jié)果表明兩種檢測方法的測定結(jié)果具有良好的一致性,且通過不同實驗人員對相同樣本進(jìn)行重復(fù)測定,證實使用噬斑法測定狂犬病毒滴度是準(zhǔn)確、可靠的,而且該方法操作更簡便、更容易操作,實驗人員操作誤差更小,大大降低了人為因素的干擾,不使用實驗動物,也大大降低了檢驗成本（包括經(jīng)濟(jì)成本和時間成本）。

［1］張永振，俞永新，董關(guān)木等.中國狂犬病的流行病學(xué)特征及防治建議［J］.中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2007，41（3）：165-168.

［2］朱蓉，薛紅剛，徐葛林.應(yīng)用細(xì)胞法代替小鼠法檢測狂犬病病毒毒力［J］.中國生物制品學(xué)雜志，2006，19（1）：87-88.

［3］柴苗，徐葛林，孫文，盧穎，畢軍，陳雪婷.細(xì)胞熒光轉(zhuǎn)化灶單位實驗體外滴定狂犬病病毒毒力方法的優(yōu)化［J］.中國疫苗和免疫，2010，16（3）：258-260.

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