陳筱婷

（1.華南理工大學食品科學與工程學院，廣東廣州510640；2.福建省產品質量檢驗研究院國家加工食品質量監(jiān)督檢驗中心（福州），福建福州350000）

應用微波提取法與RT-PCR技術進行肉制品鑒別

陳筱婷1，2

（1.華南理工大學食品科學與工程學院，廣東廣州510640；2.福建省產品質量檢驗研究院國家加工食品質量監(jiān)督檢驗中心（福州），福建福州350000）

為更好地利用實時熒光PCR技術鑒別肉制品的真實屬性，創(chuàng)新性地采用微波提取法對樣品均質液進行DNA提取，并且根據(jù)不同物種動物的基因序列設計特異性的引物與探針，根據(jù)實時熒光PCR擴增結果確定肉制品所含物種成分。在30份牛肉制品中，檢測出有7份樣品含有豬、雞或鴨源性成分，檢出率約為23.3%；在20份羊肉制品中，檢測出有5份樣品含有豬、雞或鴨源性成分，檢出率為25.0%。微波提取DNA的方法優(yōu)化了DNA提取流程，使不同類型肉制品中提取DNA可在短時間內完成，極大地提高了檢測效率。開發(fā)的樣品前處理方法、DNA提取方法具有靈敏度高、特異性強等優(yōu)點，可廣泛應用于肉制品及其相關產品真實屬性的鑒別，具有良好的社會效益與經濟效益。

肉制品；種類鑒別；微波提取法；實時熒光PCR

肉制品在國際食品市場中占有舉足輕重的地位，肉制品種類鑒別在食品貿易中具有極其關鍵的作用。食品的全球貿易需要考慮不同國家、不同文化以及不同宗教的飲食習慣，并遵循相應規(guī)則。由于豬肉在伊斯蘭教、猶太教以及我國回族居民中是被禁止食用的，因此人們對食品中是否含有豬肉成分的關注度較高。另一方面由于牛肉、羊肉的價格較其它肉類高，在肉制品加工行業(yè)存在以低價肉冒充高價肉，以次充好的現(xiàn)象。原料肉經過各項加工工序通常已經失去原有形態(tài)，已不能通過傳統(tǒng)的經驗判斷、感官鑒別或是經典的生化分析方法來對肉類物種進行鑒定。目前應用于肉制品種類鑒別的方法較多，主要有蛋白分析法、核酸分析法、脂肪酸分析法等［1-8］，具體的分析方法包括PCR、HPLC、FTIR法等［9-14］。

PCR是聚合酶鏈式反應的簡稱，是分子生物學中廣泛運用的一種技術，主要原理是通過熱循環(huán)，達到目的基因片段的大量擴增。目前這項技術越來越廣泛地運用于食品來源種類的檢測鑒別中。例如，運用PCR技術檢測牛奶或臘腸中的植物成分等［15-16］，運用PCR技術檢測肉骨粉等產品中的動物源性成分等［17-19］。結合先進的實時熒光定量PCR技術，以DNA為基礎的檢測技術在食品原材料以及加工食品種屬鑒定中獲得了迅猛長足的發(fā)展。由于PCR技術具有準確性高、特異性強、靈敏度高等優(yōu)點，使得PCR技術在物種鑒定等領域獲得廣泛的應用，可快速準確地為食品摻假的監(jiān)管提供有力的證據(jù)。

對于常規(guī)樣品DNA的提取與純化，目前已有較多商業(yè)化試劑盒應用于科研以及檢測行業(yè)中。然而針對大規(guī)模的樣品篩查檢測，使用試劑盒進行提取具有成本高，提取時間長等諸多不足。為了降低研究成本以及提高實驗速度，本研究開發(fā)了一種快速檢測肉制品真實屬性的方法。該方法基于各物種不同的線粒體等基因序列設計合成專一性的擴增引物與探針，創(chuàng)新性地采用微波法提取樣品中的核酸，根據(jù)PCR擴增結果判斷肉制品種屬成分。

本研究對建立的肉制品提取方法以及熒光PCR方法進行了靈敏度測試，在多種不同類型的樣品中驗證方法與引物的有效性與可靠性。研究方法不僅可應用于肉制品成分的檢測，也可應用于其他產品中相關成分的檢測。需要特別指出的是，不同種類的樣品需要在本方法基礎上再進行合理的優(yōu)化設計，最終建立一個快速穩(wěn)定可靠的檢測體系。

1材料與方法

1.1試驗材料

牛肉、羊肉、豬肉、雞肉、鴨肉標準品均購于中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心；牛肉制品、羊肉制品等測試樣品購自超市。

1.2試驗試劑

Taq DNA聚合酶、10×PCR緩沖液、MgCl2（25 mmol/L）、dNTP（10 mmol/L）、蛋白酶K購自TAKARA公司（大連寶生物工程有限公司）；裂解緩沖液（1 mol/L Tris-HCl，0.5 mol/L EDTA，10%SDS）；去離子水（Promega）。

1.3儀器設備

7500熒光定量PCR儀：美國ABI公司；SmartSpec plus核酸蛋白分析儀：美國Bio-Rad公司；微量可調移液器：德國Eppendorf公司；微波爐：中國美的集團股份有限公司；Minispin臺式離心機：德國Eppendorf公司；MS 3漩渦混合儀：德國IKA公司；DB-3D熱塊加熱器：英國TECHNE公司；Savant DNA 120 SpeedVac DNA濃縮儀：美國Thermofisher公司；Hfsafe1200生物安全柜：上海力申公司。

1.4引物與探針

具體引物與探針信息見表1，引物與探針委托上海生物工程有限公司合成。

表1　引物和探針DNA序列Table 1DNA sequences of the primers and probes

1.5樣品前處理

以中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心購買的肉制品標準品作為陽性對照，對市場中購買的肉制品進行主動性監(jiān)測研究。肉制品樣品均有獨立的包裝，在取樣時為了避免交叉污染，于樣品前處理室分別獨立取樣，于粉碎機中粉碎，粉碎杯在取完每個樣品后更換，粉碎杯在使用后立即清洗、消毒并滅菌。

樣品研磨粉碎均勻后，取2 g樣品，加入10 mL裂解緩沖液，將樣品與裂解液混合溶液渦旋震蕩5 min，獲得均質的溶液，置于56℃放置45 min，每隔15分鐘渦旋振蕩3 min。

1.6微波法提取樣品DNA

渦旋振蕩后，放置3 min讓樣品顆粒沉降，吸取上層清液轉移至2.0 mL離心管中。為了避免微波加熱過程中離心管的變形或破裂，離心管應均勻對稱放置于微波爐載物臺上，并在微波室內放一杯蒸餾水，防止樣品過熱。放置好樣品后，根據(jù)樣品數(shù)量微波加熱1 min～3 min，經微波處理后的管內液體溫度約為75℃～85℃。微波提取后，13 000 r/min離心5 min。離心后，轉移裂解上清液至一新的離心管中，上清液即為DNA模板溶液。用核酸蛋白質測定儀測定其濃度，根據(jù)測定值將樣品DNA濃度稀釋至200ng/μL，置于冰箱中保存。1.7熒光PCR反應初始體系及熒光PCR儀循環(huán)程序

熒光PCR反應初始體系見表2，熒光PCR儀循環(huán)程序見表3。

表2　熒光PCR反應初始體系Table 2Original fluorescent PCR system

表3　熒光PCR儀循環(huán)程序Table 3The thermal program for fluorescent PCR

2結果與分析

2.1熒光PCR引物與探針的特異性驗證

分別使用牛、羊、豬、雞、鴨5種物種的標準品DNA為模板，以表2中的反應體系和表3的循環(huán)程序對引物以及探針進行特異性驗證，具體結果見圖1及表4。

由圖1及表4可知，本研究合成的6對引物及其探針均有良好的特異性與靈敏度，只對目標DNA模板進行擴增，Ct值均小于30。非目標模板DNA及陰性對照在40個循環(huán)內均未出現(xiàn)擴增曲線。

2.2方法檢出限測試

為了測試豬源性成分檢測方法的靈敏度與檢出限，我們將豬肉粉以10%，5%，1%，0.5%，0.3%，0.1%，0.01%（質量比）的比例摻入牛肉粉中。按照本研究方法提取DNA后通過PCR試驗，結果見圖2。

圖中橫坐標Cycle代表實時熒光PCR所經歷的循環(huán)數(shù)；△Rn代表標準指示信號值減去基線信號值。

由圖2可知，采用本研究方法可以檢測出低至含有0.1%濃度豬肉成分的混合樣品。即使在牛肉粉中只摻入0.1%豬肉粉，我們依然可以檢測出豬源性成分。其他動物源性成分的靈敏性測試同豬源性成分測試方法，具體的檢出限見表5。

圖1　熒光引物及其探針的特異性試驗Fig.1The specificity results of primers and probes

表4　熒光PCR的特異性結果Table 4The specificity of fluorescent PCR（The number in table is Ct value，U.D.means undetermined）

2.3市售牛羊肉制品檢測結果

為了評價方法的可靠性與適用性以及了解市售牛肉制品、羊肉制品情況，我們從市場中購買了30份牛肉制品與20份羊肉制品。采用本研究方法進行核酸提取與PCR分析，除檢測出牛源性成分外，我們從30份牛肉制品中檢測出2份牛肉制品含有豬源性成分，2份牛肉制品中含有雞源性成分，3份牛肉制品含有鴨源性成分。除檢測出羊源性成分外，我們從20份羊肉制品中檢測出1份羊肉制品含有豬源性成分，2份羊肉制品含有雞源性成分，2份羊肉制品中含有鴨源性成分。檢測結果見圖3。

圖2　豬源性成分熒光PCR的檢出限Fig.2Detection limit of porcine derived components

表5　動物源性成分熒光PCR的檢出限Table 5The detection limit of fluorescent PCR

3討論

圖3　市售樣品檢測結果Fig.3The test results of market samples

近年來隨著“假牛肉”、“假羊肉”等事件的曝光，肉制品摻假已成為亟待解決的食品安全監(jiān)管問題。實時熒光PCR技術具有實時監(jiān)測、特異性高、靈敏度強等優(yōu)點，已成為對動物、植物源性成分進行檢測的重要技術方法。但是由于食品如肉制品基質的復雜性，使得PCR技術在食品摻假鑒別中的應用也受到了一定的限制。在肉制品加工處理過程中，DNA分子存在不同程度的降解，加工輔料如添加劑、防腐劑等的引入也會對PCR反應帶來一定的干擾，且肉制品脂質蛋白質含量較高引入很多雜質。上述種種原因都可能會導致最終結果的偏差。因此，急需開發(fā)更為科學有效的針對肉制品DNA的提取方法。

本研究創(chuàng)新性地采用微波法提取肉制品DNA，在高溫高能量的作用下，在pH 6.0～9.0裂解體系的環(huán)境中，我們可以獲得較高產量的DNA。與常規(guī)的DNA提取方法相比較，微波提取DNA法由于微波輻射的能量很高，可以將樣品的沸點較通常水平提高25℃左右。在這樣的情況下，更高的裂解沸點可以獲得更快的DNA提取效率。微波處理后，通過高速離心，可以盡量減少添加劑等的干擾，獲得質量較高的樣品核酸，方法簡便快捷經濟，特別適合于大批量樣品的DNA提取。另外根據(jù)常見肉制品種類進行設計相應物種的特異性引物和探針，通過標準品DNA的實時熒光PCR反應證明了引物及探針的特異性。在優(yōu)化的PCR反應體系的基礎上，對方法的靈敏度進行試驗，得到該方法對牛、羊、豬、雞與鴨源性成分的檢測靈敏度在0.1%～0.3%之間。

通過對市場中肉制品種屬成分進行檢測分析，我們發(fā)現(xiàn)市場中牛肉制品以及羊肉制品存在不同程度的摻假行為。在30份牛肉制品中有7份樣品檢測出豬、雞或鴨源性成分，檢出率約為23.3%；在20份羊肉制品中有5份樣品檢測出豬、雞或鴨源性成分，檢出率為25.0%。從上述數(shù)據(jù)可以看出，市場中“假牛肉”、“假羊肉”依然存在，嚴重地擾亂了市場秩序，同時也極大損害了消費者的權益。

本研究開發(fā)的快速檢測方法可以為肉制品樣品種屬成分測試節(jié)約大量的時間，同時本方法采用的微波加熱方法提取樣品DNA具有一定的創(chuàng)新性與廣泛的適用性，特別適合復雜基質樣品如食品等樣品DNA的提取，方法可以推廣應用于不同類型的樣品中，為樣品DNA的提取以及食品種屬鑒別開拓新的思路。通過進一步優(yōu)化試劑組合，本方法可以開發(fā)試劑盒或用于商業(yè)推廣，是食品監(jiān)管部門進行食品摻假監(jiān)管的有力工具，具有重大的價值與意義。

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Detection of Meat Species in Meat Products by Microwave Irradiation and Real-time PCR

CHEN Xiao-ting1，2
（1.College of Food Science and Engineering，South China University of Technology，Guangzhou 510640，Guangdong，China；2.National Centre for Quality Supervision and Testing of Processed Food（Fuzhou），F(xiàn)ujian Inspection and Research Institute for Product Quality，F(xiàn)uzhou 350000，F(xiàn)ujian，China）

A unique DNA isolation protocol based on microwave irradiation and density centrifugation for the simultaneous detection of bovine，caprine，ovine，porcine，chicken and duck species in meat products by PCR using newly developed primers was described.The method had been optimized using the primers designed from mitochondrial DNA（mtDNA）sequence and tested in 50 samples.To evaluate the method，30 beef products and 20 mutton products were analyzed by microwave irradiation and RT-PCR technique.Porcine，chicken and duck content was detected in beef products and mutton products.The design of this protocol makes it possible to process many samples in a short time.The new set of primers and the method involved showed high sensitivity in detecting beef，mutton，porcine，chicken and duck content in meat products.The present sample preparation method has the potential to be applied to other meat detection systems as well.

meat products；species detection；microwave irradiation；real-time PCR

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.19.041

2016-06-25

陳筱婷（1986—），女（漢），助理工程師，本科，研究方向：食品安全與檢測。