關長亮，張宇

（1.河海大學體育系，江蘇南京210098；2.湖南師范大學體育學院，湖南長沙410012）

酶輔助超聲提取松茸多糖及其抗運動疲勞作用

關長亮1，張宇2

（1.河海大學體育系，江蘇南京210098；2.湖南師范大學體育學院，湖南長沙410012）

采用酶輔助超聲波法提取松茸中的多糖，并利用單因素和正交試驗對提取工藝進行優(yōu)化，在此基礎上探討松茸多糖的抗運動疲勞作用。結果表明，酶輔助超聲波提法提取松茸多糖的最佳提取工藝為：超聲時間25 min，超聲功率240 W，料液比1∶40（g/mL），酶添加量2.9%。在此條件下松茸多糖的提取率可達13.97%。小鼠負重游泳實驗和抗疲勞生化指標結果表明松茸多糖具有良好的抗運動疲勞能力。

松茸；多糖；酶輔助超聲法；正交試驗；抗運動疲勞

松茸（Tricholoma matsutake），學名松口蘑，味道鮮美、肉質嫩滑，是一種深受廣大消費者喜愛的純天然食藥用菌［1-2］。松茸以營養(yǎng)豐富著稱，尤其松茸多糖具有抗氧化、提高機體免疫力、抗腫瘤、降血脂、抗病毒等功效［3-5］。因此，松茸多糖（polysaccharide from Tricholoma matsutake，PTM）的提取歷來備受關注。目前，多糖的提取方法有直接水提法、乙醇沉淀法、微波提取法和超聲提取法等［6-9］。然而，上述方法都需要在較高的溫度中進行，隨著生物酶技術的發(fā)展，將酶技術和超聲技術相結合可以實現(xiàn)在較低溫度下提取植物中的多糖成分，從而節(jié)約提取成本［10］。此外，研究發(fā)現(xiàn)植物多糖的抗氧化能力和抗運動疲勞之間存在著一定的內在聯(lián)系［11-13］，因此松茸多糖是否也具有抗運動疲勞能力需要進行深入的研究。本研究以松茸為研究對象，利用酶輔助超聲波法對松茸中的多糖進行提取，并利用正交試驗探究提取的最優(yōu)參數(shù)，達到提高松茸多糖的提取率和節(jié)約成本的目的。最后通過小鼠負重游泳實驗和抗疲勞生化指標分析揭示松茸多糖的抗運動疲勞活性，以期拓展松茸多糖的應用范圍。

1材料與方法

1.1材料與試劑

松茸：選擇完好無損，新鮮無無腐敗變質的松茸，購自黑龍江省雙鴨山市八五三農場。

葡萄糖標準品：上海楚定分析儀器有限公司；纖維素酶，和氏璧生物技術有限公司；苯酚溶液：東莞市東江化學試劑有限公司；95%乙醇：常熟楊園化工有限公司；濃硫酸：廣州市上泰化工有限公司。上述試劑均為分析純。尿素氮（BUN）檢測試劑盒，乳酸測定試劑盒，糖原測試盒，上述試劑盒均購自南京建成生物制品研究所。

1.2儀器與設備

JA1003N電子精密天平：上海精科天美貿易有限公司；FD-1A-50真空冷凍干燥機、RT-25氣流式粉碎機：上海比朗儀器制造有限公司；TY10KQ-400KDB臺式高功率數(shù)控超聲波清洗器：北京中儀友信科技有限公司；UV-2000型紫外可見分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司；小鼠恒溫游泳箱：上海艾研生物科技有限公司。

2方法

2.1松茸多糖的制備及含量測定

根據(jù)蔡嘯鏑等［14］的報道以葡萄糖標準液濃度（mg/ L）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線。利用真空冷凍干燥設備對松茸進行干燥，之后進行粉碎。精確稱取10.0 g的松茸粉末，根據(jù)黃丹丹等［15］的方法對松茸中多糖的含量進行提取和測定，松茸多糖提取率計算公式如下：

式中：C為對應多糖的濃度，（mg/L）；V為濾液體積，mL；W為提取率，%；m為松茸提取樣本質量。

2.2單因素試驗

由于本實驗選取在纖維素酶最適pH（pH 6）和最適溫度（45℃）下進行［16］，因此選取優(yōu)化的參數(shù)為超聲時間、超聲功率、料液比和酶的添加量。

超聲時間對松茸多糖提取率的影響：在超聲功率為220 W，料液比為1∶30（g/mL），酶添加量為2.6%的條件下，選擇超聲時間分別為10、15、20、25、30 min，分析超聲時間對松茸多糖提取率的影響。

超聲功率對松茸多糖提取率的影響：在超聲時間為25 min，料液比為1∶30（g/mL），酶添加量為2.6%的條件下，選擇超聲功率分別為180、200、220、240 W和260 W，分析超聲功率對松茸多糖提取率的影響。

料液比對松茸多糖提取率的影響：在超聲時間為25 min，超聲功率為220 W，酶添加量為2.6%的條件下，選擇料液比分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL），分析料液比對松茸多糖提取率的影響。

酶添加量對松茸多糖提取率的影響：在超聲時間為25 min，超聲功率為220 W，料液比為1∶30（g/mL）的條件下，選擇酶添加量分別為1.7%、2.0%、2.3%、2.6%、2.9%，分析酶添加量對松茸多糖提取率的影響。

2.3正交試驗設計

為了進一步的酶輔助超聲波法提取松茸多糖的工藝，在單因素試驗的基礎上設計正交試驗。選用超聲時間、超聲功率、料液比和酶添加量4個因素進行優(yōu)化組合，因素與水平表見表1。

表1　正交試驗因素與水平Table 1Factors and levels of orthogonal experiment

2.4松茸多糖抗運動疲勞作用研究

2.4.1動物分組及給藥

選取40只雄性小鼠，年齡均為7周，隨機分為4組，對照組（A）為空白對照組，灌胃生理鹽水；低、中高劑量組分別灌胃不同劑量的松茸多糖［5、10、15 g/（kg·d）］，并分別標號為B、C和D。上述4組小鼠均灌胃28 d，期間小鼠自由飲水和進食。

2.4.2松茸多糖對小鼠負重游泳力竭時間的影響

小鼠末次灌胃30 min后，進行負重游泳實驗，負重量為體重的4%，將4組實驗小鼠放于水溫為25℃，水深為30 cm的游泳箱進行負重游泳實驗，記錄4只小鼠首次下沉和力竭時間。

2.4.3松茸多糖對抗疲勞生化指標的影響

小鼠負重游泳實驗結束后休息1 d，隨后進行無負重游泳30 min，利用試劑盒法對4組小鼠進行血清尿素氮（BUN）、血清乳酸（LD）和肝糖原（LG）進行測定。

2.5數(shù)據(jù)分析

實驗結果以平均數(shù)±標準偏差表示，并利用SPSS20.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，當P＜0.05時可視為具有統(tǒng)計學意義，差異顯著。

3結果與分析

3.1單因素試驗

3.1.1超聲時間對松茸多糖提取率的影響

在超聲時間為10、15、20、25、30 min下分析超聲時間對松茸多糖提取率的影響，結果如圖1。

圖1　超聲時間對松茸多糖提取率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic extraction time on the extraction rate of PTM

松茸多糖的提取率隨著超聲時間的升高而增加，當超聲時間大于25℃時，松茸多糖的提取率趨于恒定，因此松茸多糖提取的最佳超聲時間為25 min。

3.1.2超聲功率對松茸多糖提取率的影響

在超聲功率分別為180、200、220、240、260 W的水平下分析超聲功率對松茸多糖提取率的影響，結果如圖2所示。

圖2　超聲功率對松茸多糖提取率的影響Fig.2Effect of ultrasonic power on the extraction rate of PTM

在180 W～240W范圍內，松茸多糖的提取率也隨之增加，當超聲功率大于240 W時，松茸多糖的提取率隨之下降，這可能是因為較大功率的超聲會破壞多糖的結構，因此松茸多糖提取的最佳超聲功率為240 W。

3.1.3料液比對松茸多糖提取率的影響

在料液比分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）的條件下分析料液比對松茸多糖提取率的影響，結果如圖3所示。

圖3　料液比對松茸多糖提取率的影響Fig.3Effect of liquid material ratio on the extraction rate of PTM

由圖3所示，松茸多糖的提取率隨著料液比的增加而增加，當酶添加量大于1∶40（g/mL）時，松茸多糖的提取率趨于恒定，因此松茸多糖提取率的最佳料液比為1∶40（g/mL）。

3.1.4酶添加量對松茸多糖提取率的影響

在酶添加量分別為1.7%、2.0%、2.3%、2.6%、2.9%的條件下分析酶添加量對松茸多糖提取率的影響，結果如圖4所示。

圖4　酶添加量對松茸多糖提取率的影響Fig.4Effect of enzyme concentration on the extraction rate of PTM

由圖4可知，松茸多糖的提取率隨著酶添加量的增加而增加，當酶添加量大于2.6%時，松茸多糖的提取率趨于恒定，因此松茸多糖提取率的最佳酶添加量為2.6%。

3.2正交試驗

為了得到酶輔助超聲波法提取松茸多糖的最佳參數(shù)組合，在單因素試驗的基礎上進行正交試驗，并進行方差分析，結果如表2、表3所示。

表2　正交試驗結果Table 2Results of orthogonal experiment

表3　方差分析Table 3Variance analysis

由表2可知，4個因素對松茸多糖提取率的影響順序為：超聲功率（B）＞酶添加量（D）＞超聲時間（A）＞料液比（C）；超聲波乙醇浸提法提取何首烏中多糖的最佳因素水平組合為A2B2C2D3，即超聲時間25 min，超聲功率240 W，料液比1∶40（g/mL），酶添加量2.9%。由表3方差分析可知，4個因素都對松茸多糖提取率有極顯著的影響（P＜0.01）。按照上述最優(yōu)方案進行了3次平行實驗，松茸中多糖的提取率分別為14.01%、13.91%、13.98%，3次實驗的平均值為13.97%，其結果高于正交試驗各組提取率。

3.3松茸多糖抗運動疲勞的研究

3.3.1松茸多糖對小鼠負重游泳力竭時間的影響

利用小鼠負重游泳實驗分析松茸多糖的抗疲勞作用，結果如圖5所示。

圖5　松茸多糖對小鼠游泳耐力的影響Fig.5Effects on swimming endurance of mices of PTM

與空白對照組（A組）相比，灌胃不同劑量的松茸多糖［低（B組）、中（C組）和高（D組）劑量組］均能夠顯著的增加小鼠首次下沉和負重游泳力竭時間（P＜0.05），并隨著給藥量的增加小鼠負重游泳的耐力被顯著地提高（P＜0.05），這說明了松茸多糖具有抗運動疲勞的作用。

3.3.2松茸多糖對抗疲勞生化指標的影響

利用試劑盒法對4組不同處理小鼠的血清尿素氮、血乳酸和肝糖原進行測定，結果如表4所示。

與空白對照組相比，低劑量、中劑量和高劑量的松茸多糖均能顯著的降低小鼠血清尿素氮和血乳酸的含量P＜0.05）。而與空白對照組相比，B、C和D劑量組的小鼠的肝糖原含量則顯著的提高（P＜0.05）。

表4　松茸多糖對小鼠跑運動后血清尿素氮、血乳酸和肝糖原含量的影響Table 4Effects on serum urea nitrogen，blood lactic acid and the content of hepatic glycogen of mices after exercising of PTM

4結論

本研究優(yōu)化了酶輔助超聲波法提取松茸多糖的提取工藝，結果表明，松茸多糖提取率的影響順序為：超聲功率＞酶添加量＞超聲時間＞料液比，最佳工藝參數(shù)為：超聲時間25 min，超聲功率240 W，料液比1∶40（g/mL），酶添加量2.9%，此條件下松茸多糖的提取率為13.97%，小鼠負重游泳實驗和抗運動疲勞生化指標分析表明松茸多糖具有良好的抗運動疲勞能力。

［1］徐博文.松口蘑菌株紫外誘變育種、培養(yǎng)條件優(yōu)化及多糖抗氧化活性研究［D］.合肥：合肥工業(yè)大學，2014

［2］王悅，薛偉.不同溫度和濕度對松茸保鮮效果的影響［J］.食品工業(yè)科技，2012，33（8）：366-368

［3］葛紅霞.姬松茸及其多糖的研究進展［J］.畜牧獸醫(yī)科技信息，2011（11）：4-5

［4］霍俊鳳，漢麗梅，馬吉飛.姬松茸水溶性多糖對鎘中毒小鼠組織器官損傷的保護作用研究［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2008（7）：85-87

［5］彭勇勝.姬松茸多糖的制備及其抗氧化、保肝作用研究［D］.武漢：華中農業(yè)大學，2011

［6］沈愛英，孫震，劉平，等.姬松茸多糖的分離純化及其對白血病細胞的抑制作用［J］.無錫輕工大學學報：食品與生物技術，2001，20（4）：380-383

［7］賈薇，郭倩，周昌艷，等.姬松茸多糖提取方法初探［J］.食用菌學報，2001，8（1）：43-45

［8］唐小俊，張名位，池建偉，等.姬松茸多糖的微波輔助提取與含量測定［J］.中國食品學報，2006，6（1）：267-272

［9］張婭，李寶才，項朋志，等.松茸多糖超聲提取物抗氧化活性研究［J］.化學與生物工程，2011（9）：75-77

［10］周連文，張存蘭，劉新華.酶輔助超聲波提取何首烏多糖及其抗氧化性研究［J］.食品科技，2008，33（1）：170-173

［11］王鳳舞，沈心荷，任嘉瑋，等.大棗多糖對香菇多糖抗疲勞抗氧化的增效作用的研究［J］.食品科技，2014（9）：210-215

［12］劉祝祥，尹紅，肖琳莉，等.獼猴桃根多糖抗疲勞、抗氧化與單糖組分鑒定［J］.食品科學，2013，34（13）：239-242

［13］李明.黃精多糖對運動疲勞大鼠抗氧化及神經遞質的影響［J］.食品科技，2014（9）：227-230

［14］蔡嘯鏑，劉躍峰.恰瑪古多糖的純化及對運動小鼠抗疲勞活性研究［J］.食品工業(yè)，2015（8）：59-62

［15］黃丹丹，朱秋勁，沈奇，等.酶輔助超聲提取紫蘇迷迭香酸工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研究［J］.中國釀造，2016，35（3）：89-93

［16］郭鴻.水牛瘤胃未培養(yǎng)微生物宏基因組文庫的構建及纖維素酶基因的克隆和鑒定［D］.南寧：廣西大學，2007

Enzyme-assisted Ultrasonic Extraction Technology and Anti-exercise-fatigue Activity of Polysaccharide from Tricholoma matsutake

GUAN Chang-liang1，ZHANG Yu2
（1.Department of Physical Education，Hehai University，Nanjing 210098，Jiangsu，China；2.Institute of Physical Education，Hunan Normal University，Changsha 410012，Hunan，China）

The enzyme-assisted ultrasonic extraction process of polysaccharide from Tricholoma matsutake（PTM）was optimized using the the single factor experiment and orthogonal experiment.On this basis，the antiexercise-fatigue activity of PTM was discussed.The results showed that the optimum extraction condition of PPMT using enzyme-assisted ultrasonic extraction method was：ultrasonic extraction time 25 min，ultrasonic power 240 W，liquid material ratio 1∶40（g/mL），and enzyme concentration 2.9%.Under the optimum conditions，the extraction rate of PTM was 13.97%.The results of the weight-loaded swimming test and biochemical indicators related to anti-exercise-fatigue activity showed that PTM had a good resistance to movement fatigue.

Tricholoma matsutake；polysaccharide；enzyme-assisted ultrasonic extraction；orthogonal experiment；anti-exercise-fatigue

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.19.046

2016-07-19

關長亮（1981—），男（滿），講師，碩士，研究方向：體育教育與訓練。