邵國兵，楊萍，姜文俠

（1.天津市工業(yè)生物系統(tǒng)與過程工程重點實驗室，中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津300308；2.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457）

撕裂蠟孔菌的發(fā)酵優(yōu)化及其開放式發(fā)酵

邵國兵1，2，楊萍1，*，姜文俠1，*

（1.天津市工業(yè)生物系統(tǒng)與過程工程重點實驗室，中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津300308；2.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457）

以生物量為指標(biāo)對撕裂蠟孔菌TIB.BPE.11002的液體發(fā)酵進(jìn)行了優(yōu)化。優(yōu)化后的液體培養(yǎng)基配方為：玉米淀粉60 g/L、玉米漿干粉8 g/L、KH2PO45 g/L、α-淀粉酶733 U/L，pH自然。優(yōu)化后的搖瓶培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度25℃，接種量5%，500 mL三角瓶裝液量150 mL，轉(zhuǎn)速150 r/min。優(yōu)化后的生物量達(dá)7 g/L以上。進(jìn)一步探索發(fā)現(xiàn)，該菌株具有在非無菌環(huán)境中大量生長的能力，可以進(jìn)行開放式發(fā)酵。

撕裂蠟孔菌；發(fā)酵優(yōu)化；開放式發(fā)酵

撕裂蠟孔菌（Ceriporia lacerata）是一種白腐真菌，日本［1］、韓國［2］和我國華北、華中、華東及四川的天然林和人工林內(nèi)均有分布［3-4］。撕裂蠟孔菌在工業(yè)廢水處理［5-7］、醫(yī)藥和保健食品［8-15］等領(lǐng)域都有一定的應(yīng)用前景，目前國內(nèi)外對該菌的研究還較少。韓國Kim Byoung-Cheon等［9-11］研究發(fā)現(xiàn)撕裂蠟孔菌發(fā)酵液的粗提物具有降血糖作用，能明顯抑制a-淀粉酶和a-葡萄糖苷酶的活性，含有保護(hù)胰島素分泌細(xì)胞不受損傷的藥理成分，可有效預(yù)防和緩解糖尿病，有可能成為糖尿病的治療藥物和保健功能食品。高冬［12］公開了一株撕裂蠟孔菌，該菌具有營養(yǎng)豐富、食藥兼用的特點，用于治療貧血、心臟病、肺癌和白血病等。此外，還有通過撕裂蠟孔菌的發(fā)酵制備2′，4′-二羥基-6′-甲氧基-3′，5′-二甲基查耳酮［8］、石杉堿甲［13］及其衍生物［14］、甘露糖赤蘚糖醇脂［15］等功效成分的中國專利公開。

對撕裂蠟孔菌TIB.BPE.11002的液體培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，進(jìn)而探索了該菌的開放式發(fā)酵，為撕裂蠟孔菌的進(jìn)一步研究開發(fā)提供參考。

1材料與方法

1.1菌種

撕裂蠟孔菌（Ceriporia lacerate）TIB.BPE.11002：保藏于中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所。

1.2主要試劑和儀器

玉米淀粉：天津中英保健食品有限公司；玉米漿干粉：山東盛泰生物科技有限公司；KH2PO4（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；中溫α-淀粉酶（3 700 U/g）：北京索萊寶科技有限公司。恒溫振蕩器（IS-RDS3型）：美國精騏有限公司；電子天平（PL4002型）、臺式pH計（S20K型）：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；BIOSTATRD-DCU D20-3型液體發(fā)酵罐、BIOSTATRC plus C20-3型液體發(fā)酵罐、BIOSTATRD-DCUD200-3型液體發(fā)酵罐：SartoriusGroup；ZFD-5090型鼓風(fēng)干燥箱：上海智城分析儀器制造有限公司。

1.3培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：可溶性淀粉20g/L，玉米漿干粉6 g/L，KH2PO41 g/L，pH自然，121℃滅菌20 min。

搖瓶基礎(chǔ)培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g/L，玉米漿干粉6 g/L，KH2PO41 g/L，pH自然，121℃滅菌20 min。

1.4方法

1.4.1液體菌種的制備

挑取菌苔約3 cm2接入種子培養(yǎng)基，裝液量為150 mL/500 mL擋板三角瓶，25℃搖床150 r/min培養(yǎng)3.5 d～4 d。

1.4.2搖瓶液體發(fā)酵

將7.5 mL液體菌種接入搖瓶基礎(chǔ)培養(yǎng)基，裝液量為150 mL/500 mL三角瓶，25℃搖床150 r/min培養(yǎng)5 d。通過改變搖瓶基礎(chǔ)培養(yǎng)基中碳源、氮源和無機(jī)鹽等的添加量，以及搖瓶的培養(yǎng)溫度、接種量、裝液量、初始pH和搖床轉(zhuǎn)速等條件，以生物量為指標(biāo)進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化試驗。

1.4.3開放式發(fā)酵

1.4.3.1開放式搖瓶發(fā)酵

將液體菌種按體積比5%分別接入經(jīng)高溫滅菌和未經(jīng)任何滅菌處理的培養(yǎng)基，前者的接種無菌操作；后者則在非無菌環(huán)境下進(jìn)行接種。裝液量為150 mL/ 500 mL三角瓶，25℃搖床150 r/min培養(yǎng)5 d。觀察兩種培養(yǎng)方式的培養(yǎng)基中菌絲體的生長情況，測量其生物量。

1.4.3.220L發(fā)酵罐開放式發(fā)酵

以工作體積20 L的D20-3型液體發(fā)酵罐為培養(yǎng)容器，培養(yǎng)基不經(jīng)任何滅菌處理，按體積比5%直接接入液體菌種，發(fā)酵培養(yǎng)過程中發(fā)酵罐的接種口不密閉。發(fā)酵罐接種后的裝液量為18.9 L，培養(yǎng)溫度25℃，初始通風(fēng)量16 L/min，初始攪拌轉(zhuǎn)速50 r/min，溶氧控制在30%左右。開放式發(fā)酵培養(yǎng)6 d，觀察發(fā)酵液中菌絲體的生長情況，每12 h取樣1次，測量其生物量。

1.4.3.3200L發(fā)酵罐開放式發(fā)酵

以工作體積200 L的液體發(fā)酵罐為培養(yǎng)容器，培養(yǎng)基不經(jīng)任何滅菌處理，按體積比5%直接接入液體菌種，該液體菌種以工作體積20 L的C20-3型液體發(fā)酵罐通過無菌培養(yǎng)的方式制備。發(fā)酵培養(yǎng)過程中，發(fā)酵罐的頂蓋完全敞開，通入的壓縮空氣不經(jīng)過除菌過濾。發(fā)酵罐接種后的裝液量為168 L，培養(yǎng)溫度25℃，初始通風(fēng)量80 L/min，初始攪拌轉(zhuǎn)速100 r/min，溶氧控制在30%左右。開放式發(fā)酵培養(yǎng)6 d，觀察發(fā)酵液中菌絲體的生長情況，每12 h取樣一次，測量其生物量。

1.4.4生物量的測量方法

發(fā)酵液經(jīng)過400目濾布過濾，水洗2次～3次，置105℃鼓風(fēng)干燥箱中烘至恒重，稱量菌絲體的干重。

2結(jié)果與討論

2.1液體培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.1.1碳源對生物量的影響

分別以不同的碳源替代搖瓶基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的可溶性淀粉，搖瓶培養(yǎng)菌株TIB.BPE.11002的試驗結(jié)果見圖1。

圖1　碳源對生物量的影響Fig.1Effect of carbon sources on the biomass

以玉米粉為碳源時，生物量的測定值最高，但因玉米粉中的不溶物對測定結(jié)果的影響，其實際的生物量應(yīng)低于測定值。生物量次高的是果糖，但果糖的價格較高。以玉米淀粉為碳源的僅略低于以果糖為碳源的，因此選擇玉米淀粉為碳源。

2.1.2氮源對生物量的影響

分別以不同的氮源替代搖瓶基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的玉米漿干粉，搖瓶發(fā)酵菌株TIB.BPE.11002的試驗結(jié)果見圖2。

綜合考慮氮源的價格及某些不溶性氮源對生物量測定值的影響，依然以玉米漿干粉作為氮源。

2.1.3碳氮比對生物量的影響

為確定玉米漿干粉的最佳添加量，將搖瓶基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的玉米淀粉添加量固定為20 g/L，通過改變玉米漿干粉的添加量來分析氮源添加量對生物量的影響結(jié)果見圖3。

圖2　氮源對生物量的影響Fig.2Effect of nitrogen sources on the biomass

圖3　氮源添加量對生物量的影響Fig.3Effect of the additive amount of nitrogen source on the biomass

試驗結(jié)果（圖3）表明，玉米漿干粉添加量在8 g/L時生物量最高，因此將玉米漿干粉的添加量定為8g/L。

為確定玉米淀粉的最佳添加量，將搖瓶基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的玉米漿干粉添加量固定為8 g/L，通過改變玉米淀粉的添加量來確定其最佳添加量結(jié)果見圖4。

圖4　碳源添加量對生物量的影響Fig.4Effect of the additive amount of carbon source on the biomass

試驗結(jié)果（圖4）表明，玉米淀粉添加量為80 g/L時，菌株TIB.BPE.11002的生物量達(dá)到最高。綜合分析誤差范圍及成本因素的影響，選擇玉米淀粉的添加量為60 g/L。

2.2搖瓶發(fā)酵條件的優(yōu)化

用上述優(yōu)化后的培養(yǎng)基，優(yōu)化菌株TIB.BPE.11002的搖瓶發(fā)酵條件。

2.2.1溫度對發(fā)酵的影響

在不同的溫度搖瓶發(fā)酵菌株TIB.BPE.11002，試驗結(jié)果見圖5。

圖5　溫度對生物量的影響Fig.5Effect of temperature on the biomass

在15℃～33℃時，生物量較高，而低于15℃和高于33℃時生物量都明顯地降低，表明該菌發(fā)酵的適宜溫度范圍較寬。綜合考慮，選擇25℃作為該菌株液體發(fā)酵的溫度。

2.2.2接種量對發(fā)酵的影響

分別以2%、5%、8%、10%和12%的接種量培養(yǎng)菌株TIB.BPE.11002，試驗結(jié)果見圖6。

圖6　接種量對生物量的影響Fig.6Effect of inoculation amount on the biomass

接種量對菌株TIB.BPE.11002生物量的影響較小，2%～12%接種量發(fā)酵的生物量相差不大。綜合考慮，選用5%作為該菌株液體發(fā)酵的接種量。

2.2.3裝液量對發(fā)酵的影響

分別采用不同的裝液量來培養(yǎng)菌株TIB.BPE. 11002，試驗結(jié)果見圖7。

裝液量越低，單位體積中的生物量越高。從經(jīng)濟(jì)角度考慮，裝液量不宜過低，因此裝液量選擇150mL/500mL三角瓶。

圖7　裝液量對生物量的影響Fig.7Effect of liquid medium volume on the biomass

2.2.4培養(yǎng)基初始pH對發(fā)酵的影響

采用鹽酸或氫氧化鈉將培養(yǎng)基的初始pH值調(diào)為2、3、4、5、6、7、8，考察培養(yǎng)基的不同初始pH值對TIB. BPE.11002生長的影響，試驗結(jié)果見圖8。

圖8　培養(yǎng)基初始pH對生物量的影響Fig.8Effect of initial pH on the biomass

培養(yǎng)基的初始pH為4時，TIB.BPE.11002的生物量最高。由于該培養(yǎng)基的自然pH為4.1，因此選擇不調(diào)整培養(yǎng)基的初始pH。

2.2.5搖床轉(zhuǎn)速對發(fā)酵的影響

分別以50、100、150、200 r/min和250 r/min的搖床轉(zhuǎn)速培養(yǎng)菌株TIB.BPE.11002，試驗結(jié)果見圖9。

圖9　搖床轉(zhuǎn)速對生物量的影響Fig.9Effect of shaking speed on the biomass

轉(zhuǎn)速在100 r/min以上時，生物量均能保持較高水平，但由于100 r/min時的數(shù)據(jù)誤差較大，而200 r/min以上時搖瓶中的菌絲聚集，易出現(xiàn)大團(tuán)的菌絲體，菌團(tuán)的形態(tài)發(fā)生了明顯變化，因此，搖床培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速確定為150 r/min。

2.3無機(jī)鹽及維生素對發(fā)酵的影響

在上述優(yōu)化的基礎(chǔ)上，繼續(xù)優(yōu)化液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的無機(jī)鹽和維生素。

以KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCl2和VB1共4種物質(zhì)為因素，做正交試驗，確定其對菌株TIB.BPE.11002液體發(fā)酵的影響及其添加量，各因素水平見表1。

表1　正交試驗因素水平表Table 1The table of factor and level in L9（34）orthogonal experiment

采用SPSS 19.0軟件對試驗結(jié)果進(jìn)行方差分析（由于MgSO4·7H2O所在列顯著性水平ɑ＞0.25，故作為空白列），直觀分析結(jié)果表明KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCl2和VB1最佳添加量分別為2 g/L、0、0、0。方差分析結(jié)果見表2。

表2　方差分析結(jié)果Table 2Variance analysis of orthogonal experiment

MgSO4·7H2O、CaCl2和VB1均不是顯著因素（P＞0.05），KH2PO4是顯著因素（P＜0.05）。

對正交試驗結(jié)果進(jìn)行試驗驗證的結(jié)果見圖10。

KH2PO4對生物量有一定的影響，其添加量為5 g/L時的生物量最高，達(dá)到7.6 g/L。因此，選用5 g/L作為KH2PO4的添加量。

2.4開放式發(fā)酵

圖10　KH2PO4添加量對生物量的影響Fig.10Effect of the additive amount of KH2PO4on the biomass

分別采用經(jīng)高溫滅菌處理的發(fā)酵培養(yǎng)基和未經(jīng)高溫滅菌處理的發(fā)酵培養(yǎng)基，搖瓶培養(yǎng)TIB.BPE.11002菌株，發(fā)酵5 d的搖瓶見圖11。

圖11　培養(yǎng)基經(jīng)滅菌處理的發(fā)酵（a）和培養(yǎng)基未經(jīng)任何滅菌處理的發(fā)酵（b）Fig.11Cultured in sterilized medium（a）and cultured in unsterilized medium（b）

采用未經(jīng)任何滅菌處理的培養(yǎng)基，搖瓶發(fā)酵的撕裂蠟孔菌不僅能夠生長，外觀無雜菌生長的跡象，而且菌絲團(tuán)的形態(tài)、生物量及發(fā)酵液氣味與培養(yǎng)基經(jīng)過高溫滅菌的搖瓶發(fā)酵均沒有可以判別的區(qū)別。

以20 L發(fā)酵罐和200 L發(fā)酵罐開放式發(fā)酵培養(yǎng)菌株TIB.BPE.11002，生物量及發(fā)酵液pH的變化見圖12。

圖12　開放式發(fā)酵中生物量和pH的變化曲線Fig.12The changes of the biomass and pH with open fermentation

經(jīng)20 L發(fā)酵罐和200 L發(fā)酵罐的開放式發(fā)酵驗證，該菌株都能夠正常生長，外觀無雜菌生長的跡象，發(fā)酵液的氣味和無菌培養(yǎng)的相同，pH變化在4～5之間，生物量均在75 h前后達(dá)到最高，分別為6.6、8.0 g/L，與搖瓶無菌培養(yǎng)的生物量接近。

通過搖瓶和發(fā)酵罐的開放式發(fā)酵試驗表明，菌株TIB.BPE.11002可以進(jìn)行完全開放式的發(fā)酵培養(yǎng)，該菌株可能產(chǎn)生某些抗菌或抑菌物質(zhì)，拮抗雜菌的生長。

3結(jié)論

通過優(yōu)化液體發(fā)酵培養(yǎng)基和搖瓶培養(yǎng)條件，撕裂蠟孔菌TIB.BPE.11002搖瓶發(fā)酵的生物量達(dá)到7 g/L以上。優(yōu)化后的培養(yǎng)基為：玉米淀粉60 g/L，玉米漿干粉8 g/L，KH2PO45 g/L，α-淀粉酶733 U/L，pH自然。優(yōu)化后的搖瓶培養(yǎng)條件為：溫度25℃，接種量5%，裝液量150 mL/500 mL三角瓶，轉(zhuǎn)速150 r/min。

發(fā)現(xiàn)并試驗驗證了撕裂蠟孔菌TIB.BPE.11002可以進(jìn)行常溫開放式發(fā)酵，不僅培養(yǎng)基無需滅菌，也無需無菌操作，而且通入的壓縮空氣也無需除菌過濾。如果該發(fā)酵方式用于工業(yè)生產(chǎn)，將大幅度降低投資、生產(chǎn)和管理成本。對于該菌株拮抗雜菌的機(jī)理，是否產(chǎn)生抑菌或抗菌物質(zhì)，有待進(jìn)一步的研究。

［1］Suhara H，Maekawa N，Kaneko S，et al.A new species，Ceriporia lacerata，isolated from white-rotted wood［J］.Mycotaxon，2003，86（41）：335-347

［2］Jang Y，Choi H E，Lim Y W，et al.The first report of Ceriporia lacerata（Phanerochaetaceae，Basidiomycota）in Korea［J］.Mycotaxon，2012，119（7）：397-403

［3］崔寶凱，魏玉蓮，戴玉成.江蘇紫金山的多孔菌［J］.菌物學(xué)報，2006，25（1）：9-14

［4］戴玉成.中國木本植物病原木材腐朽菌研究［J］.菌物學(xué)報，2012，31（4）：493-509

［5］Lin Y H，He X B，Han G M，et al.Removal of Crystal Violet from aqueous solution using powdered mycelia biomass of Ceriporia lacerata P2［J］.Joumal of Environmental Sciences，2011，23（12）：2055-2062

［6］Choi Y S，Seo J Y，Lee H，et al.Decolorization and detoxification of wastewater containing industrial dyes by Bjerkandera adusta KUC9065［J］.Water，Air，&Soil Pollution，2014，225（1）：1-10

［7］田啟建，林永慧，何興兵，等.耐高鹽撕裂蠟孔菌P2對模擬橙黃G染料廢水的脫色及廢水脫色前后的毒性測試［J］.應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報，2011，17（6）：876-882

［8］Wang J，Yao L Y，Lu Y H.Ceriporia lacerata DMC1106，a new endophytic fungus：isolation，identification，and optimal medium for 2'，4'-dihydroxy-6'-methoxy-3'，5'-dimethylchalcone production［J］. Biotechnology and Bioprocess Engineering，2013，18：669-678

［9］Kim J E，Kim H J，Lee S P.Hyperglycemic effect of submerged cultureextract of Ceriporia lacerata in streptozotocin-induced diabetic rats［J］．Food Science and Biotechnology，2012，21（6）：1685-1693

［10］Kim J H，Park Y K，Kim J E，et al．Crude extract of Ceriporia lacerata has a protective effect on dexamethasone-induced cytotoxicity in INS-1 cells via the modulation of PI3K/PKB activity［J］．International Journal of Molecular Medicine，2013，32：179-186

［11］Kim B C．Pharmaceutical composition for prevention or treatment of steroid-induced diabetes and health functional food：US，2014 0193455［P］．2014-07-10

［12］高冬．撕裂蠟孔菌及其用途：中國，ZL 201110433356.0［P］．2013-06-26

［13］吳水生，張方方，鄭雅媗，等．閩浙馬尾杉內(nèi)生真菌及其產(chǎn)石杉堿甲的方法和應(yīng)用：中國，CN 201410045031.9［P］．2014-05-28

［14］單偉光，應(yīng)優(yōu)敏，占扎君．一種蛇足石杉內(nèi)生真菌及其在制備8α，15α-環(huán)氧化石杉堿甲的應(yīng)用：中國，ZL 201310445192.2［P］．2014-03-26

［15］陳啟和，范琳琳，董亞晨．撕裂蠟孔菌菌株及其應(yīng)用：中國，CN 201410520107.9［P］．2015-01-14

Optimization of Submerged Fermentation for Mycelium of Ceriporia lacerata and Its Open Fermentation

SHAO Guo-bing1，2，YANG Ping1，*，JIANG Wen-xia1，*
（1.Tianjin Key Laboratory for Industrial Biological Systems and Bioprocessing Engineering，Tianjin Institute of Industrial Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，Tianjin 300308，China；2.College of Biotechnology，Tianjin University of Science&Technology，Tianjin 300457，China）

Submerged fermentation of Ceriporia lacerata TIB.BPE.11002 was optimized，the optimal biomass was above 7 g/L.The optimal parameters in submerged fermentation of TIB.BPE.11002 were found as：corn starch 6 g/L，corn steep powder 8 g/L，KH2PO45 g/L，α-amylase 733 U/L，natural pH，culture temperature 25℃，inoculum ratio 5%，loading volume 150 mL/500 mL，shaking speed 150 r/min.In addition，it was discovered and verified that the mycelia of TIB.BPE.11002 could be cultured with open fermentation.

Ceriporia lacerata；optimization of fermentation；open fermentation

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.19.043

2015-06-11

天津市科技支撐重點項目（12ZCZDSY12900、14ZCZDSY00063）

邵國兵（1990—），男（漢），碩士研究生，研究方向：發(fā)酵工程。

楊萍（1978—），女（漢），高級工程師，研究方向：食品與發(fā)酵工程。姜文俠（1964—），男（漢），研究員，研究方向：發(fā)酵工程。