張麗勇

(白城醫(yī)學高等?？茖W校生理教研室，吉林　白城　137000)

?

AKT-mTOR信號通路在大鼠椎間盤軟骨終板細胞自然退變中的意義

張麗勇

(白城醫(yī)學高等?？茖W校生理教研室，吉林白城137000)

目的探討AKT-雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路在大鼠椎間盤軟骨終板細胞自然退變中的表達情況。方法取清潔級SD大鼠12只，分離并培養(yǎng)椎間盤軟骨終板細胞，建立體外自然傳代退變模型。隨機分為空白對照組(自然傳代第2代細胞)，自然退變組(自然傳代第5代細胞)、AKT-mTOR信號通路抑制組(含LY294002抑制劑培養(yǎng)基傳代至第5代)，AKT-mTOR信號通路激動組(含IGF-1激動劑培養(yǎng)基傳代至第5代)。倒置顯微鏡下觀察各組細胞形態(tài)；甲苯胺藍染色檢測細胞蛋白聚糖變化；RT-PCR檢測細胞中Ⅱ型膠原、蛋白多糖、SOX9以及AKT-mTOR信號通路中關鍵基因mTOR的表達情況；Western印跡檢測AKT、p-AKT蛋白表達情況。結果隨著傳代次數增加，大鼠軟骨終板細胞的表現逐漸減少。自然退變組Ⅱ型膠原、蛋白多糖、SOX9、mTOR的表達水平均明顯低于空白對照組(P<0.05)，AKT-mTOR信號通路抑制組表達水平明顯低于自然退變組(P<0.05)；AKT-mTOR信號通路激動組表達水平明顯高于自然退變組(P<0.05)。四組的AKT蛋白表達水平無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；抑制組p-AKT蛋白表達水平低于另外3組，而激動組p-AKT蛋白表達水平明顯高于抑制組和自然退變組(P<0.05)。結論AKT-mTOR信號通路在大鼠椎間盤軟骨終板細胞自然退變中具有重要作用，添加AKT-mTOR信號通路抑制劑、激動劑能夠加速、抑制細胞體外退變的發(fā)生。

椎間盤退行性改變；軟骨細胞；AKT/mTOR

椎間盤退變是脊柱退行性疾病發(fā)生的起因和病理基礎。軟骨終板是椎間盤主要供養(yǎng)途徑，是維持椎間盤正常形態(tài)和生理功能的關鍵〔1〕。雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶的一種，其所處的信號通路包括上游的P13K、AKT、PTEN、TSC1/2，以及下游的SK6、4EBP。而信號通路中P13K、AKT突變可引發(fā)mTOR通路的高度激活〔2〕。相關研究顯示，mTOR作為P13K相關激酶之一，在控制細胞生長周期方面具有重要作用〔3〕。本研究旨在探明AKT-mTOR信號通路與大鼠軟骨終板細胞退變的關系。

1　材料與方法

1.1動物和試劑清潔級SD大鼠12只，4～5周齡，雌雄各半，體重140～180 g，由吉林大學白求恩醫(yī)學院動物實驗中心提供。膠原酶、胰蛋白酶(北京中生瑞泰科技有限公司)；LY294002 AKT信號通路抑制劑(美國SIGMA公司)；DMEM細胞培養(yǎng)液、胎牛血清(上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司)；PCR試劑盒及相關抗體(北京天根生化科技有限公司)；IGF-1 rat recombinant(上海浩然生物技術有限公司)；AKT、p-AKT(圣克魯斯生物技術有限公司)。

1.2方法

1.2.1細胞分離、培養(yǎng)及分組斷髓處死12只大鼠，75%乙醇溶液中浸泡20 min，無菌操作臺內取完整腰椎，逐個剝離大鼠腰椎間盤1～5段終板軟骨，胰蛋白酶消化分離軟骨終板細胞。當細胞單層融合度85%～90%時開始細胞傳代，傳至第2代后終止，2×105個/孔接種到6孔細胞培養(yǎng)板中，連續(xù)培養(yǎng)2～3 d。其中第2代細胞為空白對照組；第2～5代細胞為自然傳代組；細胞傳代過程中添加30 μmol/ml的含LY294002 AKT信號通路抑制劑的細胞培養(yǎng)液，傳代至第5代為AKT-mTOR信號通路抑制組；細胞傳代過程中添加20 ng/ml的含IGF-1 AKT信號通路激動劑的細胞培養(yǎng)液，傳代至第5代為AKT-mTOR信號通路激動組。

1.2.2甲苯胺藍染色各組中細胞融合約80%時進行甲苯胺藍染色：除去細胞培養(yǎng)液后用磷酸緩沖液(PBS)沖洗3～4次，4%多聚甲醛固定45 min后除去固定液，用PBS沖3～4次，甲苯胺藍染色60 min，PBS洗凈后放于倒置顯微鏡下觀察、拍照。

1.2.3RT-PCR檢測使用Trizol抽提各組軟骨終板細胞的RNA，Agilent 2100 bioanalyzer檢測提取RNA的純度，取1 μg總RNA，一步法反轉錄合成cDNA。RT-PCR擴增體系為10 μl(SYBRR染料預混的extaq 酶5 μl，上游引物和下游引物各0.5 μl，cDNA模板4 μl)，引物合成由北京三博遠志生物技術有限責任公司完成?；靹蚝蟪Ｒ?guī)反應條件下置于RT-PCR儀中反應。

1.2.4Western印跡檢測吸除6孔細胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，PBS沖3～4次，每孔加入100 μl含PMSF的蛋白裂解液，冰袋上裂解40 min，4℃ 12 000 r/min離心20 min，吸取上清液至無菌EP管中，BCA法測定提取得到的蛋白質濃度。每組取蛋白質樣品20 μg，行SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜120 min。5% BSA封閉60～120 min，加一抗(1∶1 000)，4℃過夜，TBST沖洗3次，加二抗(1∶5 000)，溫室孵育3 h，TBST沖洗3次。紅外熒光掃描成像系統(tǒng)掃描并收集數據，GAPDH為內參。

1.3統(tǒng)計學分析使用SPSS15.0軟件進行t檢驗。

2　結　果

2.1大鼠軟骨終板表型變化隨著傳代次數增加，大鼠軟骨終板細胞逐漸表現出梭形變化，出現多角形和觸角，第2～5代呈現出纖維化趨勢，見圖A1～A4。大鼠軟骨終板細胞甲苯胺藍染色顯示，第2～5代染色逐漸變深、深染，見圖B1～B4?？瞻讓φ战M、自然退變組和第5代激動劑組的軟骨終板細胞形態(tài)、甲苯胺藍染色顯示：第5代激動劑組細胞形態(tài)和染色與自然退變組相比恢復明顯，但未恢復到空白對照組形態(tài)，見圖2。

A1～A4為自然傳代第2～5代細胞形態(tài)；B1～B4為自然傳代第2～5代甲苯胺藍染色圖1　大鼠軟骨終板細胞形態(tài)和甲苯胺藍染色(×100)

圖2　自然傳代第2代、自然傳代第5代、第5代激動劑組細胞形態(tài)和甲苯胺藍染色(×100)

2.2大鼠軟骨終板相關基因RT-PCR檢測自然傳代組中：第2～5代大鼠中Ⅱ型膠原、蛋白多糖、SOX9、mTOR的表達明顯降低；抑制組的表達明顯低于自然傳代組(P<0.05)；激動劑組表達明顯高于自然傳代組(P<0.05)。

2.3大鼠軟骨終板細胞中AKT及p-AKT表達變化Western印跡檢測顯示，空白對照組、自然退變組、AKT-mTOR信號通路抑制組和激動組的AKT蛋白表達水平無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。抑制組p-AKT蛋白表達水平低于另外3組，而激動組p-AKT蛋白表達水平明顯高于抑制組和自然退變組(P<0.05)，見圖3。

圖3　Western印跡檢測大鼠軟骨終板細胞的AKT水平

3　討　論

PI3K-AKT-mTOR信號通路在哺乳動物細胞內廣泛存在，可影響細胞的增殖、分化PI3K是一種分布于細胞質中的復合體，作為脂類激酶能夠催化磷脂酰肌醇D3位的酸化，進而調控細胞的整個周期以及能量轉運等〔4〕。相關研究顯示，胰島素樣生長因子、表皮樣生長因子等多種信號傳導復合體和生長因子均可啟動PI3K-AKT信號通路的激活過程〔5〕。而PI3K-AKT信號通路在細胞增殖、分化、代謝中發(fā)揮重要作用。人類和鼠類在mTOR結構的氨基酸分子水平上的同源性高達95%〔6〕，mTOR不僅有控制基因翻譯、參與DNA/RNA合成、影響蛋白質降解等生理過程，最新研究還發(fā)現其與哺乳動物生理性衰老及腫瘤發(fā)生具有明顯關聯〔7〕。mTOR信號通路不僅是細胞正常生長周期的調控中心，還是PI3K-AKT信號通路控制細胞自噬的關鍵調節(jié)點。mTOR位于PI3K-AKT信號通路的下游，能夠調控翻譯過程中的啟動及延伸、氨基酸轉運、機體代謝相關蛋白酶的轉錄、核糖體合成。

相關研究顯示，AKT-mTOR信號通路與人體一系列退行性病變存在明顯相關性〔8〕。LY294002是目前常用的AKT-mTOR信號通路抑制劑，能夠抑制該通路的磷酸化而使其喪失活性，影響下游mTOR信號，進而抑制細胞分化、增殖，誘導細胞凋亡。IGF-1是目前常用的AKT-mTOR信號通路激動劑，能夠明顯加快關節(jié)軟骨細胞的增殖、分化，以及軟骨基質合成，能夠有效削弱LY294002對細胞的抑制效果。本研究結果顯示，AKT-mTOR信號通路在大鼠椎間盤軟骨終板細胞體外自然退變過程中起到重要作用，在軟骨終板細胞傳代過程中調控AKT-mTOR信號通路可有效加速、緩解甚至抑制大鼠椎間盤軟骨終板細胞的生理性退變。本次實驗結果為抑制腰椎間盤生理性退變提供了一個全新思路和靶點，可以此為基礎研發(fā)相關治療藥物。

1鐘小明，胡偵明，沈皆亮，等.白藜蘆醇干預對已退變椎間盤終板軟骨細胞SIRT1表達的影響〔J〕.中國老年學雜志，2013；33(6)：1304-7.

2Wang K，Chen YP，Lei Y，etal.Electrochemical method for monitoring the progress of polymerase chain reactions using Methylene blue as an indicator〔J〕.Mikrochimica Acta，2013；180(9/10)：871-8.

3Urquiza MP，Acatzi Silva AI.Copy number ratios determined by two digital polymerase chain reaction systems in genetically modified grains〔J〕.Metrologia，2014；51(1)：61-6.

4徐宏光，彭紅心，程加峰，等.人頸椎椎體終板軟骨細胞退變模型的建立及其意義〔J〕.中華醫(yī)學雜志，2011；91(41)：2912-6.

5Wang C，Zhou H，Zhu W，etal.Ultrasensitive electrochemical DNA detection based on dual amplification of circular strand-displacement polymerase reaction and hybridization chain reaction〔J〕.Biosensors Bioelectronics，2013；47：324-8.

6Deng M，Wang Y，Li J,etal.N-Methylimidazolium modified magnetic particles-assisted highly sensitive Escherichia coli detection based on polymerase chain reaction and capillary electrophoresis〔J〕.Anal Chim Acta，2014；827：47-53.

7鐘小明.白藜蘆醇通過SIRT1/IGF-1R/AKT通路促進退變椎間盤終板軟骨細胞合成細胞外基質〔D〕.重慶：重慶醫(yī)科大學，2012.

8王飛.腰椎間盤退變中軟骨終板細胞的凋亡及CTGF對其保護作用的實驗研究〔D〕.廣州：南方醫(yī)科大學，2010.

〔2016-02-15修回〕

(編輯滕欣航)

吉林省教育廳“十二五”項目(20140129)

張麗勇(1974-)，女，碩士，副教授，主要從事臨床生理學研究。

R68

A

1005-9202(2016)15-3651-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.15.018