宋　宇　董明巖

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨外科脊柱病區(qū)，遼寧　錦州　121000)

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丙酸睪酮與5-羥色胺對(duì)老年大鼠脊髓腰骶段年齡相關(guān)還原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸黃遞酶陽(yáng)性體表達(dá)的影響

宋宇董明巖

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨外科脊柱病區(qū)，遼寧錦州121000)

目的探討丙酸睪酮與5-羥色胺對(duì)老年大鼠脊髓腰骶段年齡相關(guān)還原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸黃遞酶陽(yáng)性體(ANB)表達(dá)的影響。方法選擇無(wú)特定病原體級(jí)的SD大鼠進(jìn)行析因設(shè)計(jì)：即LC 組(6 月齡，無(wú)干預(yù)對(duì)照)；LT 組(6 月齡，丙酸睪酮干預(yù))；LS組〔6 月齡，5-羥色胺(HT)干預(yù)〕；MC組(21 月齡，無(wú)干預(yù)對(duì)照)；MT組(21月齡，丙酸睪酮干預(yù))；MS 組(21 月齡，5-HT干預(yù))；HC組(24 月齡，無(wú)干預(yù)對(duì)照)；HT組(24 月齡，丙酸睪酮干預(yù))；HS 組(24月齡，5-HT干預(yù))，每組8只。干預(yù)后，取大鼠脊髓腰骶段，觀察ANB和一氧化氮合酶(NOS)的表達(dá)。結(jié)果ANB和NOS主要分布在大鼠脊髓腰骶段背側(cè)部，隨著大鼠的衰老，ANB的表達(dá)逐漸增多。丙酸睪酮干預(yù)組ANB表達(dá)要明顯少于對(duì)照組。5-HT干預(yù)組ANB表達(dá)與無(wú)干預(yù)對(duì)照組無(wú)明顯變化。隨著大鼠的衰老，NOS的表達(dá)逐漸增少。丙酸睪酮干預(yù)組NOS表達(dá)要明顯多于對(duì)照組，5-HT干預(yù)組NOS表達(dá)與無(wú)干預(yù)對(duì)照組無(wú)明顯變化。各組脊髓腰骶段ANB和NOS含量呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論脊髓腰骶段ANB的出現(xiàn)與衰老有關(guān)，隨著機(jī)體的老化ANB的表達(dá)逐漸增多。脊髓腰骶段ANB的出現(xiàn)可能與體內(nèi)衰老過(guò)程中睪酮的減少存在一定的關(guān)系，補(bǔ)充丙酸睪酮可以減少衰老過(guò)程中ANB的出現(xiàn)；而補(bǔ)充5-HT則未見(jiàn)類(lèi)似效果。

丙酸睪酮；5-羥色胺；脊髓腰骶段；年齡相關(guān)還原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸黃遞酶陽(yáng)性體(ANB)

腰骶段脊髓對(duì)于調(diào)控人體的盆底肌發(fā)揮非常重要的作用〔1,2〕。隨著人體衰老，腰骶段脊髓會(huì)呈現(xiàn)與機(jī)體年齡相關(guān)的退行性變化，伴發(fā)生殖器官、直腸和膀胱的功能衰退。一氧化氮(NO)是神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用的信息物質(zhì)〔3～5〕，其與眾多生理活動(dòng)相關(guān)聯(lián)。老年患者盆腔臟器的生理功能異常與腰骶段脊髓NO及一氧化氮合酶(NOS)的表達(dá)有密切關(guān)系。衰老過(guò)程中腰骶段脊髓會(huì)出現(xiàn)與衰老程度相關(guān)的還原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸黃遞酶陽(yáng)性體(ANB)的表達(dá)上調(diào)〔6〕。而且，隨著衰老，老年男性患者愈來(lái)愈經(jīng)常出現(xiàn)泌尿功能障礙。參與調(diào)節(jié)人體排尿反射的神經(jīng)中樞在腰骶段脊髓，故而推測(cè)腰骶段脊髓中ANB的表達(dá)能夠影響人體排尿反射。此外，隨著衰老，患者體內(nèi)的雄激素——睪酮含量會(huì)逐漸降低〔7～9〕，腰骶段脊髓5-羥色胺(HT)在泌尿反射中發(fā)揮重要作用〔10〕。本文探討丙酸睪酮與5-HT對(duì)老年大鼠脊髓腰骶段ANP表達(dá)影響的分子生物學(xué)機(jī)制。

1　材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇無(wú)特定病原體級(jí)(SPF)SD大鼠，在實(shí)驗(yàn)大鼠繁育到第6個(gè)月時(shí)選用，體重275～300 g，由遼寧醫(yī)學(xué)院的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部提供(合格批準(zhǔn)文號(hào)：動(dòng)012)。標(biāo)準(zhǔn)的大鼠飼料(鼠糧由動(dòng)物中心提供)喂養(yǎng)，自由攝食與飲水。本實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)遼寧醫(yī)學(xué)院的倫理審查委員會(huì)的審查批準(zhǔn)，并且全部操作按照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相關(guān)的經(jīng)典指南來(lái)嚴(yán)格地執(zhí)行。

1.2分組LC組(6月齡，無(wú)干預(yù)對(duì)照)；LT組(6月齡，丙酸睪酮干預(yù))；LS組(6月齡，5-HT干預(yù))；MC組(21月齡，無(wú)干預(yù)對(duì)照)；MT組(21月齡，丙酸睪酮干預(yù))；MS 組(21月齡，5-HT干預(yù))；HC組(24月齡，無(wú)干預(yù)對(duì)照)；HT組(24月齡，丙酸睪酮干預(yù))；HS 組(24 月齡，5-HT干預(yù))。每組8只。

1.3儀器與試劑色譜級(jí)純品L-谷氨酸(美國(guó)Sigma公司)；Agilent 1200高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)。

1.4干預(yù)措施無(wú)干預(yù)對(duì)照：通過(guò)背部皮下注射芝麻油作為安慰劑，給藥劑量為2.0 mg·kg-1·d-1，每天1 次，連續(xù)3個(gè)月；丙酸睪酮干預(yù)：通過(guò)背部皮下注射睪酮制劑，給藥劑量為2.0 mg·kg-1·d-1，每天1 次，連續(xù)3個(gè)月；5-HT干預(yù)：通過(guò)背部皮下注射5-HT，給藥劑量2.0 mg·kg-1·d-1，每天1 次，連續(xù)3個(gè)月。

1.5觀察指標(biāo)〔4〕脊髓腰骶段ANB、NOS的表達(dá)情況。

1.6取材干預(yù)結(jié)束后，取材前8 h禁食，但同時(shí)不禁水，尾靜脈注射1.5 g/kg 20%麻醉劑脲乙烷麻醉后，使用自制的大鼠專(zhuān)用的斷頭臺(tái)迅速斷頭取出腰骶段脊髓組織；在去除二乙基焦炭酸鹽的冰面之上，充分吸去腰骶段脊髓組織的血跡。稱(chēng)重，加1 ml甲醇-水配制的離心液，低溫下勻漿處理，繼而取出一部分的勻漿液置于4℃ ，以12 000 r/min進(jìn)行15 min的離心處理，最后取出上清液，再經(jīng)濾膜的過(guò)濾處理之后，將其放置在-80℃冰箱保存待測(cè)。

1.7色譜法檢測(cè)神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸的海馬內(nèi)濃度①將取材完畢的大鼠的海馬組織置于勻漿器之內(nèi)勻漿處置取其上清液備用。②選用測(cè)試所需的標(biāo)準(zhǔn)品和輔助實(shí)驗(yàn)試劑，包括鄰苯二甲醛和色譜級(jí)甲醇。③調(diào)試色譜系統(tǒng)至工作狀態(tài)，選用低溫型高速離心機(jī)和色譜測(cè)試系統(tǒng)及色譜測(cè)量分析工作站。④調(diào)整色譜測(cè)試條件，即將色譜測(cè)試柱的溫度調(diào)節(jié)為35℃，設(shè)定A流動(dòng)相為0.1 mol/L醋酸鉀，設(shè)定B流動(dòng)相為色譜級(jí)甲醇。第五步驟實(shí)施洗脫程序(二元的梯度洗脫)，采用標(biāo)準(zhǔn)的二元的梯度洗脫程序。⑤測(cè)試所需蛋白(色譜測(cè)試過(guò)程中用作標(biāo)準(zhǔn)液)，選用Eppendorf 3810型微量離心管，在測(cè)試離心管中加入待測(cè)的樣品本溶液100 μl(提前調(diào)定好濃度)和衍生試劑100 μl(已經(jīng)調(diào)定好濃度)，反應(yīng)持續(xù)2 min，再次加入已經(jīng)調(diào)定好濃度的樣品本溶液20 μl。⑥繪制測(cè)試蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定待測(cè)樣本的含量。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS19.0軟件行χ2檢驗(yàn)和方差分析。

2　結(jié)　果

2.1各組脊髓腰骶段ANB的含量ANB主要分布在大鼠脊髓腰骶段背側(cè)部，并且隨著大鼠的衰老，ANB的表達(dá)逐漸增多(P<0.05)。各丙酸睪酮干預(yù)組ANB表達(dá)要少于對(duì)照組(P<0.05)。5-HT干預(yù)組ANB表達(dá)較無(wú)干預(yù)對(duì)照組無(wú)明顯變化(P>0.05)(表1)。

2.2各組脊髓腰骶段NOS的含量NOS主要分布在大鼠脊髓腰骶段背側(cè)部，并且隨著大鼠的衰老，NOS的表達(dá)逐漸增少(P<0.05)。各丙酸睪酮干預(yù)組NOS表達(dá)要多于對(duì)照組(P<0.05)。5-HT干預(yù)組NOS表達(dá)較無(wú)干預(yù)對(duì)照組無(wú)明顯變化(P>0.05)(表2)。

表1　各組脊髓腰骶段ANB含量

1)與無(wú)干預(yù)對(duì)照組比較：P<0.05，2)主效應(yīng)；3)交互效應(yīng)；下表同

表2　各組脊髓腰骶段NOS含量

2.3各組脊髓腰骶段ANB和NOS含量相關(guān)性LC、LT、LS、MC、MT、MS、HC、HT、HS組脊髓腰骶段ANB和NOS含量呈負(fù)相關(guān)(r=-0.96、-0.95、-0.85、-0.90、-0.89、-0.97、-0.96、-0.91、-0.88，均P<0.05)。

3　討　論

雄激素在保持機(jī)體的肌肉量和機(jī)體代謝方面具有重要功能。本研究結(jié)果提示ANB表達(dá)量的增多與隨年齡增長(zhǎng)導(dǎo)致睪酮的減少有密切關(guān)系。本文中高齡大鼠腰骶段脊髓的ANB的表達(dá)量亦有下降的趨勢(shì)，但其下降幅度較小，其原因可能是在補(bǔ)充丙酸睪酮時(shí)老年大鼠脊髓腰骶段已經(jīng)表達(dá)了較多的ANB，此時(shí)難以完全緩解這一趨勢(shì)。NO在外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中具有重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。NOS是NO生成的關(guān)鍵酶，在NO發(fā)揮的眾多生理與病理作用的過(guò)程中，起著非常重要的調(diào)節(jié)作用，因此經(jīng)常通過(guò)檢測(cè)NOS活性來(lái)間接反映NO的含量〔11,12〕。本文結(jié)果提示，5-HT可能沒(méi)有深切參與控制排尿的神經(jīng)回路或者泌尿道神經(jīng)活動(dòng)。

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6周晨明.老年大鼠脊髓腰骶段 ANB 表達(dá)及相關(guān)特性〔D〕.石家莊：河北醫(yī)科大學(xué),2012.

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〔2015-01-19修回〕

(編輯杜娟)

董明巖(1963-)，男，碩士，主任醫(yī)師，主要從事骨脊柱疾病研究。

宋宇(1989-)，男，在讀碩士，主要從事脊柱退行性變研究。

R744.6

A

1005-9202(2016)17-4178-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.17.019