高海祥　閆　莉　蘇　艷

(河北省人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科一科，河北　石家莊　050051)

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復(fù)方苦參注射液增加耐克唑替尼ALK陽性肺癌細胞H2228對克唑替尼的敏感性

高海祥閆莉蘇艷

(河北省人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科一科，河北石家莊050051)

目的探討復(fù)方苦參注射液是否增加耐克唑替尼ALK陽性肺癌細胞H2228(H2228/CR)對克唑替尼的敏感性。方法采用CCK8方法觀察復(fù)方苦參注射液、克唑替尼對H2228/CR細胞增殖的影響。取對數(shù)生長期H2228/CR細胞，加入不同濃度的復(fù)方苦參和克唑替尼,CCK8試劑測定各孔光吸收值(A)，取平均值。計算藥物作用72 h后的增殖抑制率。根據(jù)抑制率計算相應(yīng)藥物的IC50，然后選擇適宜的復(fù)方苦參注射液濃度與克唑替尼聯(lián)合，重復(fù)CCK8法，計算兩藥聯(lián)合72 h后的細胞增殖抑制率及聯(lián)合后克唑替尼的IC50，計算逆轉(zhuǎn)倍數(shù)。結(jié)果復(fù)方苦參注射液、克唑替尼對H2228/CR細胞增殖具有抑制作用，該作用與濃度呈正相關(guān)。復(fù)方苦參注射液、克唑替尼對H2228/CR細胞的IC50分別為584.6 μl/ml和3 426.3 nmol/L。復(fù)方苦參注射液聯(lián)合不同濃度克唑替尼后對H2228/CR細胞較單用克唑替尼增殖抑制作用明顯增強，聯(lián)合用藥后克唑替尼的IC50為494 nmol/L，逆轉(zhuǎn)耐藥倍數(shù)為6.93。H2228/CR對克唑替尼敏感性明顯增強。結(jié)論相對單一應(yīng)用克唑替尼易產(chǎn)生耐藥性的缺點，二者聯(lián)合運用可有效提高H2228/CR對克唑替尼敏感性。

耐克唑替尼ALK陽性肺癌細胞H2228(H2228/CR)；復(fù)方苦參注射液；克唑替尼

治療非小細胞性肺癌(NSCLC)的靶向藥物中，表皮生長因子受體(EGFR)和間變性淋巴瘤激酶酪氨酸激酶(ALK)抑制劑(TKIs)最常用，它可使帶有EGFR突變和(或)ALK融合基因的NSCLC患者癥狀得到明顯改善、提高生存率〔1〕?？诉蛱婺嶙鳛锳LK抑制劑在臨床試驗中表現(xiàn)尤為突出，經(jīng)克唑替尼治療的患者90%以上腫瘤縮小，57%的患者獲得客觀緩解〔2〕。在2013版美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)指南上，推薦其作為一線治療藥用于ALK陽性的NSCLC患者。但幾乎所有經(jīng)其治療的患者在初次治療9～12個月后均出現(xiàn)了耐藥〔3〕，如何降低耐藥性，已成為靶向藥物治療NSCLC患者的最大難題。本研究根據(jù)復(fù)方苦參注射液能夠抑制腫瘤血管形成從而控制腫瘤生長〔4〕的臨床用藥經(jīng)驗，通過體外實驗進一步驗證復(fù)方苦參注射液是否能增加耐克唑替尼ALK陽性肺癌細胞H2228(CH2228/CR)對克唑替尼的敏感性。

1　材料和方法

1.1材料耐克唑替尼ALK陽性肺癌H2228細胞(購自ATCC)； 克唑替尼(美國輝瑞公司)；復(fù)方苦參注射液(山西振東金晶制藥有限公司)；膽囊收縮素八肽(CCK8)試劑(日本同仁)；酶聯(lián)免疫檢測儀(奧地利TECAN公司)

1.2方法應(yīng)用CCK8方法觀察復(fù)方苦參注射液、克唑替尼對〔H2228/(CR)〕細胞增殖的影響。取對數(shù)生長期的H2228/CR細胞，用 0.25%胰酶消化，制成單細胞懸液后，用全自動細胞計數(shù)儀計數(shù)，以3×104/ml細胞濃度接種于96孔板中,100 μl/孔,其中1孔留作空白組，在37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，以使細胞充分貼壁。然后加入不同濃度的復(fù)方苦參注射液和克唑替尼,使得復(fù)方苦參注射液每孔終濃度分別為50、100、200、400、800 μl/ml，克唑替尼每孔終濃度分別為10、30、90、270、810 nmol/L，陰性對照組每孔加入100 μl普通培養(yǎng)液，空白孔加200 μl普通培養(yǎng)液(不加細胞)，每個濃度組設(shè)3個復(fù)孔。再次置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，每孔加入CCK8試劑20 μl，繼續(xù)溫育2 h，最后采用酶標儀測定各孔OD值，波長取450 nm。取3個復(fù)孔的平均值。計算藥物作用72 h后的增殖抑制率。抑制率=〔1-(實驗組平均OD值-空白組平均OD值)/(陰性對照組平均OD值-空白組平均OD值)〕×100%。根據(jù)抑制率計算兩種藥物的IC50，選擇適宜的復(fù)方苦參注射液濃度與克唑替尼聯(lián)合作用于H2228/CR細胞，重復(fù)CCK8方法，計算兩藥聯(lián)合72 h后的細胞增殖抑制率，計算逆轉(zhuǎn)倍數(shù)。

1.3統(tǒng)計學方法應(yīng)用SPSS19.0軟件行t檢驗。

2　結(jié)　果

2.1復(fù)方苦參注射液、克唑替尼對H2228/CR細胞增殖的影響復(fù)方苦參注射液、克唑替尼對H2228/CR細胞增殖具有抑制作用，該作用與濃度呈正相關(guān)，即濃度越大，抑制作用越強。復(fù)方苦參注射液50、100、200、400、800 μl/ml組細胞抑制率分別為(1.2±0.5)%、(4.5±1.3)%、(10.3±2.1)%、(32.1±4.5)%、(66.7±9.7)%；克唑替尼10、30、90、270、810 nmol/L組細胞抑制率分別為(2.8±0.5)%、(6.2±0.9)%、(11.9±1.6)%、(16.7±1.8)%、(29.7±3.4)%。根據(jù)冦氏改良公式，復(fù)方苦參注射液、克唑替尼對H2228/CR細胞的IC50分別為584.6 μl/ml和3 426.3 nmol/L。

2.2復(fù)方苦參注射液聯(lián)合克唑替尼對H2228/CR細胞增殖的影響根據(jù)復(fù)方苦參注射液對H2228/CR的增殖抑制作用結(jié)果，選擇濃度為100 μl/ml苦參注射液與不同濃度克唑替尼聯(lián)合作用于H2228/CR，表明復(fù)方苦參注射液聯(lián)合不同濃度克唑替尼后對H2228/CR細胞較單用克唑替尼增殖抑制作用明顯增強，聯(lián)合用藥后克唑替尼的IC50為494 nmol/L，逆轉(zhuǎn)耐藥倍數(shù)為6.93。H2228/CR對克唑替尼敏感性明顯增強。見圖1。

圖1　克唑替尼單用與聯(lián)合復(fù)方苦參對H22288/CR細胞增殖的影響

3　討　論

克唑替尼屬靶向治療藥物，是ALK競爭性抑制劑。藥理作用為劑量依賴式抑制細胞內(nèi)ALK與抑制c-Met激酶，從而抑制腫瘤細胞的生長〔5〕。3%～7%的NSCLC患者ALK基因陽性，因此，自克唑替尼應(yīng)用以來，NSCLC ALK陽性患者中位生存時間和生存率明顯提高〔6～8〕。然而，這部分患者在經(jīng)過1～2年治療后出現(xiàn)不同程度的克唑替尼耐藥現(xiàn)象。耐藥的機制可能為:(1)ALK繼發(fā)性耐藥突變。ALK繼發(fā)性耐藥突變約占耐藥原因的37%，其中ALK激酶區(qū)突變約占28%，而ALK基因拷貝數(shù)擴增占9%。ALK激酶區(qū)突變是最早明確的耐藥機制〔9〕。體內(nèi)外研究顯示，ALK激酶區(qū)突變包括L1196M、L1152R、G1202R、G1269A、1151Tins、S1206Y、C1156Y、F1174C和D1203N。(2)驅(qū)動基因轉(zhuǎn)換。ALK陽性腫瘤細胞的生長和遷移主要受ALK及其下游信號通路來實現(xiàn)，當克唑替尼阻斷該信號通路時，腫瘤細胞則通過驅(qū)動基因轉(zhuǎn)換激活其他信號傳導(dǎo)通路替代原有通路。這些轉(zhuǎn)換驅(qū)動基因中最為常見的是EGFR突變或磷酸化、KRAS突變和c-KIT擴增。(3)腫瘤異質(zhì)性。NSCLC是基因突變和細胞異質(zhì)性最大的腫瘤之一。同一ALK陽性NSCLC患者，可能存在兩種不同的激酶及突變，另外，不同的時間檢測也可能出現(xiàn)不同的驅(qū)動基因突變。

祖國醫(yī)學認為熱毒瘀結(jié)是肺癌發(fā)病機制主要特征之一，故清熱解毒法作為肺癌治療的基本法則在臨床上廣為應(yīng)用。復(fù)方苦參注射液又名巖舒，主要功效為清熱解毒，散結(jié)消腫。主要由苦參、土茯苓等多味中藥組成。其中苦參具有清熱、解毒、燥濕作用，現(xiàn)代藥理研究認為苦參的主要成分為苦參堿。其作用機制為通過影響端粒酶活性，殺傷惡性腫瘤細胞，同時誘導(dǎo)腫瘤細胞分化、促進腫瘤細胞凋亡。還可提高正常細胞免疫功能，對自然殺傷細胞和 T細胞亞群作用明顯，是一種良好的細胞免疫調(diào)節(jié)劑，最后還可通過阻斷腫瘤細胞和內(nèi)皮細胞的黏附，達到抑制腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移的作用〔10〕。土茯苓具有解毒、除濕、止痛功效，現(xiàn)代藥理研究認為其主要成分茯苓多糖及茯苓總皂甙具有抗腫瘤作用。復(fù)方苦參注射液聯(lián)合化學治療及分子靶向治療各種惡性腫瘤療效顯著,尤其在減毒增效方面，同時具有一定的抗腫瘤作用。陳南江等〔11〕研究發(fā)現(xiàn)復(fù)方苦參注射液能顯著減輕化療引起的疼痛不適、惡心嘔吐、發(fā)熱乏力等不良反應(yīng),提高人體免疫力,抑制惡性腫瘤細胞生長,延長腫瘤患者生存期，提高患者的生活質(zhì)量。司維柯等〔11〕研究表明,復(fù)方苦參注射液不但能對惡性腫瘤細胞具有直接的殺傷作用,而且還能誘導(dǎo)惡性腫瘤細胞分化、促進細胞凋亡,同時還可抑制腫瘤細胞侵襲與轉(zhuǎn)移。

本實驗，觀察到復(fù)方苦參注射液即使在體外對耐克唑替尼ALK陽性肺癌H2228細胞仍具有增殖抑制作用，且抑制作用隨藥物濃度增加而增加，顯示出復(fù)方苦參注射液具有多靶點抗腫瘤作用機制?？诉蛱婺嶙鳛锳LK抑制劑，前期實驗表明其對ALK陽性肺癌H2228細胞有明顯抑制作用，IC50為302 nmol/L，與蘇翠云〔13〕試驗中測得的334 nmol/L極為接近。但是當ALK陽性肺癌H2228細胞對克唑替尼產(chǎn)生耐藥后，藥物的敏感性明顯下降，相應(yīng)的IC50明顯上升。但是與小劑量的復(fù)方苦參注射液聯(lián)合應(yīng)用后，對細胞增殖抑制作用明顯增強，抑制率明顯升高。我們推測可能因復(fù)方苦參注射液抗腫瘤譜廣，作用靶點及信號通路廣泛、時間持久、不易耐藥，其不但可對惡性腫瘤細胞起到直接的殺傷作用,而且還能誘導(dǎo)惡性腫瘤細胞分化、促進惡性腫瘤細胞凋亡,最后還可抑制腫瘤細胞侵襲與轉(zhuǎn)移，逆轉(zhuǎn)克唑替尼耐藥。因此與克唑替尼聯(lián)合后增效作用明顯。本從體外實驗進一步驗證了復(fù)方苦參注射液聯(lián)合克唑替尼的臨床減毒增效作用。

1Rosell R,Carcereny E,Gervais R,etal.Erlotinib versus standard chemotherapy as first-line treatment for European patients with advanced EGFR mutation-positive non-small-cell lung cancer(EURTAC):a multicentre,open-label,randomised phase 3 trial〔J〕.Lancet Oncol,2012;13(3):239-46.

2Zou HY,Li Q,Lee JH,etal.An orally available small-molecule inhibitor of c-Met,PF-2341066,exhibits cytoreductive antitumor efficacy through antiproliferative and antiangiogenic mechanisms〔J〕.Cancer Res,2007;67(9):4408-17.

3Chen Z,Fillmore CM,Hammerman PS,etal.Non-small-cell lung cancers:a heterogeneous set of diseases〔J〕.Nat Rev Cancer,2014;14(8):535-46.

4李敏,錢曉萍,劉寶瑞.復(fù)方苦參注射液聯(lián)合熱療抗血管生成作用的實驗研究〔J〕.實用臨床醫(yī)藥雜志,2007;11(5):57-61.

5Shaw AT,Yeap BY,Mino-Kenudson M,etal.Clinical features and outcome of patients with non-small-cell lung cancer who harbor EML4-ALK〔J〕.J Clin Oncol,2009;27(26):4247-53.

6Kwak EL,Bang YJ,Camidge DR,etal.Anaplastic lymphoma kinase inhibition in non-small-cell lung cancer〔J〕.New Engl J Med,2010;363(18):1693-703.

7Camidge DR,Bang YJ,Kwak EL,etal.Activity and safety of crizotinib in patients with ALK-positive non-small-cell lung cancer:updated results from a phase 1 study〔J〕.Lancet Oncol,2012;13(10):1011-9.

8Shaw AT,Kim DW,Nakagawa K,etal.Crizotinib versus chemotherapy in advanced ALK-positive lung cancer〔J〕.New Engl J Med,2013;368(25):2385-94.

9Doebele RC,Pilling AB,Aisner DL,etal.Mechanisms of resistance to crizotinib in patients with ALK gene rearranged non-small cell lung cancer〔J〕.Clin Cancer Res,2012;18(5):1472-82.

10王兵,王國俊.氧化苦參堿對腫瘤誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞增殖的抑制作用〔J〕.實用腫瘤雜志,2000;15(5):297-300.

11陳南江,李杭,譚詩生.復(fù)方苦參注射液聯(lián)合紫杉醇治療老年晚期非小細胞肺癌臨床觀察〔J〕.上海中醫(yī)藥雜志,2006;40(9):22-3.

12司維柯,高利宏,劉斌,等.苦參堿誘導(dǎo)人肝癌細胞分化、凋亡時對 G1細胞周期調(diào)節(jié)因子的調(diào)控〔J〕.癌癥,2001;20( 8):848-51.

13蘇翠云.克唑替尼、TAE684對EML4-ALK陽性肺癌細胞株H2228作用的研究〔D〕.南寧：廣西醫(yī)科大學,2013.

〔2015-12-31修回〕

(編輯袁左鳴)

2016年度河北省醫(yī)學科學研究重點課題計劃(20160065)

高海祥(1979-)，男，在讀博士，主治醫(yī)師，主要從事呼吸腫瘤、呼吸系統(tǒng)感染性疾病研究。

R734.2

A

1005-9202(2016)17-4159-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.17.010