夏延貞, 霍寅萍, 王龍珍, 商雄躍

肺癌是全球最常見的癌癥類型和癌癥死亡原因[1-2],世界衛(wèi)生組織估計全球的肺癌死亡率仍將繼續(xù)升高[3]。目前,手術(shù)切除配合放化療是肺癌主要的治療方法,但患者預(yù)后仍不理想[4]?？诉蛱婺崾且环N多靶點蛋白激酶抑制劑,其可作用于間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK)、c-ros原癌基因1受體酪氨酸激酶(c-ros oncogene 1 receptor tyrosine kinase,ROS1)、肝細(xì)胞生長因子受體(hepatocyte growth factor receptor,c-Met)等位點,對肺癌具有顯著的臨床療效[5],但患者容易產(chǎn)生獲得性耐藥,限制了克唑替尼的應(yīng)用[6]。尋求增強(qiáng)克唑替尼抑癌效果的方法有利于肺癌的治療。環(huán)狀RNA(circular ribonucleic acid,circRNA)是一種具有共價閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的非編碼RNA,參與包括癌癥在內(nèi)的多種病理過程,對肺癌的發(fā)生、發(fā)展以及化療耐藥起著重要的調(diào)控作用[7-8]。有研究表明circ-FOXM1可促進(jìn)肺癌的增殖、遷移和侵襲[9]?？诉蛱婺峥赏ㄟ^抑制磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)信號通路而抑制肺癌細(xì)胞侵襲[10]。本研究旨在探討過表達(dá)和沉默circ-FOXM1是否可改變克唑替尼對肺癌細(xì)胞的抑制效果,以及PI3K/AKT信號通路在其中的作用機(jī)制,為克唑替尼耐藥肺癌的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞、主要試劑與儀器 人正常肺上皮細(xì)胞株BEAS-2B、肺癌細(xì)胞株H2228均購自美國ATCC細(xì)胞庫。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibico公司?？诉蛱婺豳徸悦绹鳶igma-Aldrich公司。四甲基偶氮唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)、RIPA裂解液均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。circ-FOXM1過表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA3.1-circ-FOXM1)及陰性對照質(zhì)粒(pcDNA3.1)、circ-FOXM1小干擾RNA(si-circ-FOXM1)及亂序無意義陰性對照(si-NC)、circ-FOXM1、GAPDH引物均購自上海吉康生物科技有限公司。LipofectamineTM2000、Trizol試劑和RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Invitrogen公司。Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司。鼠抗人單克隆抗體磷酸化的磷脂酰肌醇3激酶(phosphorylated phosphatidylinositol 3 kinase,p-PI3K)、PI3K、磷酸化的蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B,p-AKT)、AKT均購自美國Santa Cruz公司。Epoch全波長酶標(biāo)儀購自美國Bio-Tek公司。CytomicsTMFC 500流式細(xì)胞儀購自美國貝克曼庫爾特公司。Transwell小室,規(guī)格:24孔,孔徑8 μm,購自美國康寧公司。CX-43光學(xué)顯微鏡購自日本奧林巴斯公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及克唑替尼耐藥肺癌細(xì)胞的構(gòu)建 H2228細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,培養(yǎng)箱條件設(shè)置為37 ℃、5% CO2。構(gòu)建克唑替尼耐藥肺癌細(xì)胞時,在培養(yǎng)基內(nèi)添加終濃度為5 nmol/L的克唑替尼,當(dāng)H2228細(xì)胞穩(wěn)定生長時將克唑替尼的濃度加倍,重復(fù)此步驟,歷時8個月。MTT實驗檢測克唑替尼對H2228細(xì)胞的半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50)的變化,計算H2228細(xì)胞的耐藥指數(shù)(resistance index,RI)。IC50指對細(xì)胞增殖的抑制效果達(dá)到細(xì)胞正常增殖水平50%時的藥物濃度。RI=耐藥細(xì)胞IC50/親本細(xì)胞IC50。RI的分級:<5為低度耐藥;5～15為中度耐藥;>15為高度耐藥。本研究構(gòu)建的克唑替尼耐藥肺癌細(xì)胞達(dá)到中度耐藥,記為H2228/CR細(xì)胞。

1.3細(xì)胞分組及干預(yù)處理 將H2228細(xì)胞隨機(jī)分為過表達(dá)組和過表達(dá)對照組。將H2228/CR細(xì)胞隨機(jī)分為沉默組和沉默對照組。參照LipofectamineTM2000試劑盒說明書分別將circ-FOXM1過表達(dá)質(zhì)粒、陰性對照質(zhì)粒、circ-FOXM1小干擾RNA、亂序無意義陰性對照轉(zhuǎn)染進(jìn)過表達(dá)組、過表達(dá)對照組、沉默組、沉默對照組細(xì)胞。采用實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)法檢測轉(zhuǎn)染效果。轉(zhuǎn)染成功后過表達(dá)對照組和過表達(dá)組細(xì)胞用187.56 nmol/L的克唑替尼處理。另將克唑替尼換為等量DMSO處理過表達(dá)對照組和過表達(dá)組細(xì)胞作為對照。沉默對照組和沉默組細(xì)胞用400 nmol/L的克唑替尼處理。另將克唑替尼換為等量DMSO處理沉默對照組和沉默組細(xì)胞作為對照。在細(xì)胞培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2)中培養(yǎng)24 h后收集各組細(xì)胞,檢測相關(guān)指標(biāo)。

1.4qRT-PCR法檢測circ-FOXM1表達(dá) 用Trizol法提取細(xì)胞總RNA,應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA,并以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR。引物序列見表1。實驗條件:95 ℃ 5 min,95 ℃ 10 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,總共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參,通過2-△△Ct法計算circ-FOXM1的相對表達(dá)量。重復(fù)6次獨立實驗。

表1 circ-FOXM1和GAPDH的引物序列

1.5MTT法檢測細(xì)胞存活率 將細(xì)胞分別以5×103cells/孔接種至96孔板,每組設(shè)置6個復(fù)孔。應(yīng)用不同濃度(0、50、100、200、400、800、1 600 nmol/L)的克唑替尼處理,細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后加入10 μl MTT試劑,孵育4 h,棄上清,加入150 μl DMSO重懸后用酶標(biāo)儀檢測490 nm處的吸光度值(OD值)。計算細(xì)胞存活率與克唑替尼的IC50。細(xì)胞存活率=[(實驗孔OD值-空白孔OD值)/(對照孔OD值-空白孔OD值)]×100%。

1.6流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 按Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒說明書進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測。收集培養(yǎng)24 h后的各組細(xì)胞。4 ℃、1 000 r/min離心10 min,棄上清。加入1×Binding Buffer重懸細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度至1×106cells/ml。取100 μl細(xì)胞懸液,加入5 μl Annexin V-FITC、5 μl PI,混勻后室溫避光孵育15 min。加入400 μl 1×Binding Buffer,1 h內(nèi)上機(jī)檢測凋亡率。重復(fù)6次獨立實驗。

1.7Transwell法檢測細(xì)胞遷移水平 在Transwell小室上室加入無胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,下室加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。將各組細(xì)胞培養(yǎng)于上室。培養(yǎng)24 h后除去小室上表面未穿過室膜的細(xì)胞,予無水甲醇固定,1%結(jié)晶紫染色,顯微鏡觀察細(xì)胞遷移情況,隨機(jī)選取5個視野進(jìn)行計數(shù)并拍照。重復(fù)6次獨立實驗。

1.8Western blot法檢測細(xì)胞p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT蛋白表達(dá)水平 收集培養(yǎng)24 h后的各組細(xì)胞,應(yīng)用RIPA裂解液提取總蛋白,SDS-PAGE電泳分離蛋白,轉(zhuǎn)膜、封閉處理后加入p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT蛋白的一抗稀釋液(1∶1 000),4 ℃孵育過夜,加入HRP標(biāo)記的二抗稀釋液(1∶5 000),室溫孵育2 h,磷酸緩沖鹽溶液洗膜,加入ECL試劑,暗室曝光顯影。以GAPDH為內(nèi)參,應(yīng)用Quantity One軟件分析目標(biāo)蛋白的相對表達(dá)量。重復(fù)6次獨立實驗。

2 結(jié)果

2.1克唑替尼耐藥肺癌細(xì)胞H2228/CR的構(gòu)建結(jié)果 MTT實驗結(jié)果顯示,隨著克唑替尼濃度的增加,H2228和H2228/CR細(xì)胞的存活率逐漸降低,克唑替尼對H2228細(xì)胞和H2228/CR細(xì)胞的IC50分別為(195.24±16.89)nmol/L、(1546.83±125.73)nmol/L,克唑替尼對H2228/CR細(xì)胞的IC50顯著高于H2228細(xì)胞(t=26.097,P<0.001)。RI=7.90±0.63,符合耐藥株的要求。見圖1。

?MTT法檢測不同濃度克唑替尼對H2228和H2228/CR細(xì)胞存活率的影響;?克唑替尼對H2228和H2228/CR細(xì)胞的IC50比較;*P<0.05圖1 克唑替尼耐藥肺癌細(xì)胞H2228/CR構(gòu)建結(jié)果圖

2.2circ-FOXM1在BEAS-2B、H2228和H2228/CR細(xì)胞中的表達(dá)水平比較 qRT-PCR實驗結(jié)果顯示,H2228/CR細(xì)胞circ-FOXM1表達(dá)水平顯著高于BEAS-2B細(xì)胞和H2228細(xì)胞(P<0.05)。H2228細(xì)胞circ-FOXM1表達(dá)水平顯著高于BEAS-2B細(xì)胞(P<0.05)。circ-FOXM1表達(dá)水平在三種細(xì)胞間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=183.232,P<0.001)。見圖2。

與BEAS-2B比較,*P<0.05;與H2228細(xì)胞比較,#P<0.05圖2 circ-FOXM1在BEAS-2B、H2228和H2228/CR細(xì)胞中的表達(dá)水平比較圖

2.3過表達(dá)和沉默circ-FOXM1的細(xì)胞模型的構(gòu)建結(jié)果 qRT-PCR實驗結(jié)果顯示,過表達(dá)組H2228細(xì)胞circ-FOXM1表達(dá)水平顯著高于過表達(dá)對照組(t=12.253,P<0.001),沉默組H2228/CR細(xì)胞circ-FOXM1表達(dá)水平顯著低于沉默對照組(t=14.858,P<0.001)。結(jié)果提示過表達(dá)和沉默circ-FOXM1的細(xì)胞模型構(gòu)建成功。見圖3。

圖3 過表達(dá)和沉默circ-FOXM1的細(xì)胞模型的circ-FOXM1檢測結(jié)果圖(*P<0.05)

2.4circ-FOXM1過表達(dá)降低克唑替尼對H2228細(xì)胞的抑制效果 MTT實驗結(jié)果顯示,隨著克唑替尼濃度的增加,過表達(dá)對照組和過表達(dá)組H2228細(xì)胞存活率逐漸降低,克唑替尼對過表達(dá)組的IC50顯著高于過表達(dá)對照組(t=22.442,P<0.001)。選擇過表達(dá)對照組H2228細(xì)胞的IC50(187.56 nmol/L)用于后續(xù)實驗。以克唑替尼對過表達(dá)對照組和過表達(dá)組H2228細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)處理,結(jié)果顯示過表達(dá)組的凋亡率顯著低于過表達(dá)對照組(t=11.865,P<0.001),過表達(dá)組的細(xì)胞遷移數(shù)顯著高于過表達(dá)對照組(t=-6.922,P<0.001)。見圖4。

?不同濃度克唑替尼干預(yù)處理后,過表達(dá)組及過表達(dá)對照組H2228細(xì)胞的存活率比較;?克唑替尼對過表達(dá)對照組和過表達(dá)組H2228細(xì)胞的IC50比較;??流式細(xì)胞術(shù)檢測187.56 nmol/L克唑替尼干預(yù)處理后,過表達(dá)對照組和過表達(dá)組的細(xì)胞凋亡率比較;??Transwell實驗檢測187.56 nmol/L克唑替尼干預(yù)處理后,過表達(dá)對照組和過表達(dá)組的細(xì)胞遷移數(shù)比較;*P<0.05圖4 circ-FOXM1過表達(dá)降低克唑替尼對H2228細(xì)胞的抑制效果圖

2.5circ-FOXM1過表達(dá)對克唑替尼干預(yù)的H2228細(xì)胞的PI3K/AKT信號通路影響結(jié)果 Western blot實驗結(jié)果顯示,經(jīng)克唑替尼干預(yù)處理后,過表達(dá)組p-PI3K/PI3K比值、p-AKT/AKT比值均顯著高于過表達(dá)對照組(t=7.813,P<0.001;t=6.834,P<0.001)。見圖5。

?Western blot實驗結(jié)果圖;?兩組p-PI3K/PI3K比值比較;?兩組p-AKT/AKT比值比較;*P<0.05圖5 circ-FOXM1過表達(dá)對克唑替尼干預(yù)的H2228細(xì)胞的PI3K/AKT信號通路影響結(jié)果圖

2.6沉默circ-FOXM1增強(qiáng)克唑替尼對H2228/CR細(xì)胞的抑制效果 MTT實驗顯示,隨著克唑替尼濃度增加,沉默對照組和沉默組H2228/CR細(xì)胞存活率逐漸降低,克唑替尼對沉默組的IC50顯著低于沉默對照組(t=20.088,P<0.001)。選擇對沉默對照組H2228/CR細(xì)胞抑制率較低的克唑替尼濃度(400 nmol/L)用于后續(xù)實驗。經(jīng)克唑替尼干預(yù)處理后,沉默組的細(xì)胞凋亡率顯著高于沉默對照組(t=12.353,P<0.001),沉默組的細(xì)胞遷移數(shù)顯著低于沉默對照組(t=7.543,P<0.001)。見圖6。

?不同濃度克唑替尼干預(yù)處理后,沉默對照組和沉默組H2228/CR細(xì)胞存活率比較;?克唑替尼對沉默對照組和沉默組H2228/CR細(xì)胞的IC50比較;??流式細(xì)胞術(shù)檢測400 nmol/L克唑替尼干預(yù)處理后,沉默對照組和沉默組細(xì)胞凋亡率比較;??Transwell實驗檢測400 nmol/L克唑替尼干預(yù)處理后,沉默對照組和沉默組的細(xì)胞遷移數(shù)比較;*P<0.05圖6 抑制circ-FOXM1表達(dá)增強(qiáng)克唑替尼對H2228/CR細(xì)胞的抑制效果圖

2.7抑制circ-FOXM1表達(dá)對克唑替尼干預(yù)的H2228/CR細(xì)胞的PI3K/AKT信號通路影響結(jié)果 Western blot實驗結(jié)果顯示,經(jīng)克唑替尼干預(yù)處理后,沉默組的p-PI3K/PI3K比值、p-AKT/AKT比值均顯著低于沉默對照組(t=12.247,P<0.001;t=8.542,P<0.001)。見圖7。

?Western blot實驗結(jié)果圖;?兩組p-PI3K/PI3K比值比較;?兩組p-AKT/AKT比值比較;*P<0.05圖7 抑制circ-FOXM1表達(dá)對克唑替尼干預(yù)的H2228/CR細(xì)胞的PI3K/AKT信號通路影響結(jié)果圖

3 討論

3.1克唑替尼是常用的肺癌靶向治療藥物,但由于肺癌容易產(chǎn)生耐藥性,導(dǎo)致克唑替尼的抑癌效果降低[11]。本研究發(fā)現(xiàn),用濃度遞增的克唑替尼長期處理肺癌細(xì)胞后,克唑替尼對肺癌細(xì)胞的IC50顯著增加,這與相關(guān)文獻(xiàn)結(jié)果一致[12],表明長期使用克唑替尼可使對克唑替尼敏感肺癌細(xì)胞H2228轉(zhuǎn)變對克唑替尼耐藥的肺癌細(xì)胞H2228/CR。探究肺癌對克唑替尼耐藥的機(jī)制對改善肺癌患者的治療效果具有重要意義。

3.2circRNA是目前醫(yī)學(xué)研究的熱點之一,其可通過調(diào)控基因、信號通路、微小RNA參與包括癌癥在內(nèi)的各種病理進(jìn)程[13]。circRNA也參與癌細(xì)胞化療耐藥的調(diào)控,癌細(xì)胞耐藥性的轉(zhuǎn)變與circRNA表達(dá)水平的改變密切相關(guān)[14]。circ-FOXM1是一種新發(fā)現(xiàn)的與癌癥有關(guān)的circRNA,其定位于chr12:2966846-2983691位點,源自FOXM1基因[15]。circ-FOXM1在肺癌中高表達(dá),可通過調(diào)控多種信號通路促進(jìn)肺癌進(jìn)展,抑制circ-FOXM1表達(dá)則可抑制肺癌細(xì)胞的生長。抑制circ-FOXM1表達(dá)可通過靶向miR-149-5p調(diào)控自噬相關(guān)基因5(autophagy-related gene 5,Atg5)表達(dá),從而抑制肺癌細(xì)胞增殖、遷移、自噬并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[16]。抑制circ-FOXM1表達(dá)可通過調(diào)控miR-132-3p/跨膜蛋白14A(transmembrane protein 14A,TMEM14A)軸抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[17]。circ-FOXM1也可能與癌細(xì)胞對某些化療藥物耐藥性的改變有關(guān)。circ-FOXM1可作為miR-1324的分子海綿上調(diào)甲基CpG結(jié)合蛋白2(methyl-CpG-binding protein 2,MeCP2)表達(dá),促進(jìn)肝癌細(xì)胞對索拉非尼的耐藥[18]。本研究發(fā)現(xiàn),circ-FOXM1在肺癌細(xì)胞H2228中的表達(dá)水平顯著高于人正常肺上皮細(xì)胞BEAS-2B,且在克唑替尼耐藥肺癌細(xì)胞H2228/CR中的表達(dá)水平顯著高于克唑替尼敏感肺癌細(xì)胞H2228,提示circ-FOXM1可能與肺癌的克唑替尼耐藥有關(guān)。

3.3為驗證circ-FOXM1表達(dá)水平對肺癌細(xì)胞克唑替尼耐藥性的影響,本研究以克唑替尼敏感肺癌細(xì)胞H2228和克唑替尼耐藥肺癌細(xì)胞H2228/CR為實驗對象。結(jié)果顯示,circ-FOXM1過表達(dá)后,克唑替尼對H2228細(xì)胞的IC50顯著增加,并顯著降低克唑替尼干預(yù)后H2228細(xì)胞的凋亡率,增加細(xì)胞遷移數(shù)。表明circ-FOXM1過表達(dá)可降低克唑替尼對H2228細(xì)胞的抑制效果,circ-FOXM1表達(dá)水平上升可能是肺癌細(xì)胞對克唑替尼由敏感向耐藥轉(zhuǎn)變的一個原因。另外,本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn),沉默circ-FOXM1后,克唑替尼對H2228/CR細(xì)胞的IC50顯著降低,沉默circ-FOXM1可顯著增加克唑替尼作用下H2228/CR細(xì)胞的凋亡率并降低細(xì)胞遷移數(shù)。表明沉默circ-FOXM1可增加克唑替尼對H2228/CR細(xì)胞的抑制效果,circ-FOXM1可能成為提高克唑替尼的抑癌效果的一個靶點。

3.4PI3K/AKT是一條與磷脂酰肌醇有關(guān)的信號通路,參與對腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、凋亡、糖酵解等方面的調(diào)控,在許多癌癥中發(fā)揮致癌作用,針對PI3K/AKT信號通路的抑制劑是抗癌藥物研究的熱點[19]。PI3K/AKT信號通路可通過調(diào)控多種耐藥基因的表達(dá)影響化療耐藥[20]。有研究表明,克唑替尼通過抑制PI3K/AKT信號通路調(diào)控相關(guān)蛋白表達(dá)抑制肺癌細(xì)胞增殖、遷移并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10,21]。本研究結(jié)果顯示,克唑替尼可降低肺癌細(xì)胞H2228和H2228/CR細(xì)胞中p-PI3K/PI3K比值、p-AKT/AKT比值,表明克唑替尼可抑制肺癌細(xì)胞PI3K/AKT信號通路,這與相關(guān)研究結(jié)果一致。許多circRNA對癌癥進(jìn)程的調(diào)控及對化療耐藥的調(diào)控也都涉及PI3K/AKT信號通路。circRNA circ_103809通過激活PI3K/AKT信號通路加速乳腺癌的細(xì)胞周期進(jìn)程并抑制細(xì)胞凋亡[22]。circRNA circ_PTN通過miR-542-3p/PIK3R3途徑激活PI3K/AKT信號通路,促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的順鉑耐藥[23]。本研究發(fā)現(xiàn),circ-FOXM1過表達(dá)可上調(diào)克唑替尼干預(yù)后H2228細(xì)胞的PI3K/AKT信號通路,沉默circ-FOXM1則可下調(diào)克唑替尼干預(yù)后H2228/CR細(xì)胞的PI3K/AKT信號通路,由此推測circ-FOXM1可能通過調(diào)控PI3K/AKT信號通路影響克唑替尼對肺癌細(xì)胞的抑制效果。

綜上所述,circ-FOXM1可降低克唑替尼對肺癌細(xì)胞的抑制效果,其機(jī)制可能與circ-FOXM1激活PI3K/AKT信號通路有關(guān),但本研究僅進(jìn)行了細(xì)胞實驗,相關(guān)機(jī)制還有待進(jìn)一步完善。由于化療耐藥的產(chǎn)生是多種基因、信號通路、circRNA等同時進(jìn)行調(diào)控的復(fù)雜過程,且一個circRNA可同時調(diào)控多種基因、微小RNA、蛋白質(zhì)、信號通路;反之,circRNA亦可受各種分子的調(diào)控,故今后的研究將深入下游機(jī)制,并進(jìn)行動物實驗,為減輕克唑替尼耐藥提供參考。