王偉源　肖小琴　程文德　林梅英

子宮頸腺癌高危型人乳頭狀瘤病毒P16INK4A蛋白表達(dá)情況

王偉源肖小琴程文德林梅英

目的 分析子宮頸腺癌癌變過(guò)程中高危型人乳頭狀瘤病毒（HR-HPV）感染檢測(cè)及P16INK4A蛋白表達(dá)的臨床意義。方法 2013年1月至2015年1月子宮頸微腺體增生患者25例、子宮頸原位腺癌患者65例、子宮頸浸潤(rùn)性腺癌患者24例，以及同期進(jìn)行健康體檢的慢性宮頸炎組織患者35例為觀察對(duì)象。采用免疫組織化學(xué)方法檢查組織中p16INK4A蛋白表達(dá)情況，并應(yīng)用第二代雜交捕獲法（HC-2）對(duì)13種HRHPV DNA進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果 子宮頸微腺體增生組織、原位腺癌及浸潤(rùn)性腺癌HR-HPV感染陽(yáng)性率和P16INK4A蛋白表達(dá)陽(yáng)性率均高于慢性宮頸炎組織（P＜0.05）；宮頸組織中HR-HPV感染陽(yáng)性率與P16INK4A蛋白表達(dá)表現(xiàn)為正相關(guān)性（P＜0.05）。結(jié)論 HR-HPV導(dǎo)致宮頸惡化轉(zhuǎn)化與P16INK4A蛋白表達(dá)密切相關(guān)，可以作為診斷子宮頸腺癌的輔助診斷指標(biāo)，采用P16INK4A與HR-HPV聯(lián)合診斷，有利于提高子宮頸癌及CIN陽(yáng)性預(yù)測(cè)值，為臨床疾病的診斷、治療提供科學(xué)的參考依據(jù)。

子宮頸腺癌 癌變過(guò)程 高危型人乳頭狀瘤病毒 P16INK4A蛋白

子宮頸癌包括鱗癌與腺癌［1］，宮頸腺上皮病變譜系為正常宮頸腺體-良性腺體增生性病變-腺體不典型增生-原位腺癌-浸潤(rùn)性腺癌。P16INK4A蛋白是一種重要的抑癌基因，與高危型人乳頭狀瘤病毒（HRHPV）有關(guān)，大部分子宮頸腺癌及上皮內(nèi)瘤變的發(fā)生、發(fā)展與HPV感染、P16INK4A蛋白表達(dá)密切相關(guān)，可將P16INK4A作為子宮頸癌變的重要指標(biāo)［2］。本文對(duì)2013年1月至2015年1月本院收治的25例子宮頸微腺體增生患者、65例子宮頸原位腺癌患者、24例子宮頸浸潤(rùn)性腺癌患者，以及35例慢性宮頸炎組織患者臨床資料進(jìn)行分析，探討子宮頸腺癌組織中HR-HPV感染及P16INK4A蛋白表達(dá)的聯(lián)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　臨床資料

1.1一般資料 本院門診活檢及住院手術(shù)切除宮頸石蠟包埋組織149例，年齡20～67歲，平均年齡（34.21±10.36）歲。病程1個(gè)月～14年，平均病程（3.54±0.52）年。其中包括子宮頸微腺體增生患者25例、子宮頸原位腺癌患者65例、子宮頸浸潤(rùn)性腺癌患者24例及慢性宮頸炎組織（慢性炎癥）35例。標(biāo)本采集前，患者未接受相關(guān)化療、放療。4組患者一般資料，包括年齡、性別、病程比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2方法 （1）HR-HPV DNA檢測(cè)：采用第二代雜交捕獲法（HC-2）進(jìn)行檢查，儀器由美國(guó)Digene公司提供，采樣刷在宮頸管中旋轉(zhuǎn)3周，保留10s后取出，樣品采集需要在宮頸活檢和手術(shù)切除前進(jìn)行。將采樣刷置于樣本轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基保存液中，保存溫度為4℃，嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，共檢測(cè)13種HR-HPV［3］。（2）不同宮頸組織中P16INK4A蛋白檢測(cè)：由美國(guó)Santa Cruz公司提供鼠抗人P16INK4A單克隆抗體，由福建邁新生物技術(shù)有限公司提供SP免疫染色試劑盒。將P16INK4A一抗稀釋為1：80，PBS液代替一抗作陰性對(duì)照，以陽(yáng)性乳癌切片作為陽(yáng)性對(duì)照。P16INK4A陽(yáng)性染色呈黃色或棕黃色，胞漿、胞核著色，在400倍鏡下觀察切片，重點(diǎn)觀察10個(gè)代表性視野，計(jì)數(shù)500個(gè)中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取平均值［4］。弱陽(yáng)性（+）：陽(yáng)性細(xì)胞10%～30%，染色強(qiáng)度稍弱，少量細(xì)胞著色。中度陽(yáng)性（++）：陽(yáng)性細(xì)胞30%～60%，胞核和胞漿著色。強(qiáng)陽(yáng)性（+++）：陽(yáng)性細(xì)胞≥60%，胞核與胞漿均著色，細(xì)胞染色較深。陰性：陽(yáng)性細(xì)胞＜10%，染色強(qiáng)度與背景顏色無(wú)明顯差異。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以n或%表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1不同組織中HR-HPV檢查結(jié)果比較 見(jiàn)表1。

表1　不同組織中HR-HPV檢查結(jié)果比較（n）

2.2不同組織中P16INK4A蛋白表達(dá)情況比較 子宮頸微腺體增生與慢性宮頸炎組織中P16INK4A表達(dá)以陰性表達(dá)為主，少量細(xì)胞胞核著色；其他三種組織以中、強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)為主，為胞漿、胞核著色。見(jiàn)表2。

表2　不同組織中P16INK4A蛋白表達(dá)情況比較（n）

2.3宮頸組織中P16INK4A蛋白表達(dá)與HR-HPV感染相關(guān)性分析 宮頸組織中HR-HPV感染陽(yáng)性率與P16INK4A蛋白表達(dá)率呈正相關(guān)性（r=0.565，P＜0.05）。

3　討論

子宮頸癌是臨床腫瘤科臨床常見(jiàn)疾病，好發(fā)于30～55歲女性患者，臨床表現(xiàn)為陰道流血、尿頻、尿急、貧血、便秘、下肢腫脹、器官衰竭等，其發(fā)病原因和機(jī)制十分復(fù)雜，迄今尚未完全清楚，可能與病毒感染、性行為、分娩、營(yíng)養(yǎng)不良、衛(wèi)生條件差等因素有關(guān)［5］，直接影響患者正常生活與工作。人乳頭狀瘤病毒（HPV）是一種嗜上皮性病毒，在人和動(dòng)物中廣泛分布，具有較高的特異性，可引起人類良性腫瘤與疣。生殖道感染HPV常見(jiàn)型為6、11、16、18，其中16、18屬于HR-HPV［6］，也是感染率最高的HPV型，據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)顯示［7］，約99%宮頸癌組織中可以檢測(cè)出HPV16、18。當(dāng)子宮頸受HPV16、18持續(xù)性侵襲感染時(shí)，將DNA整合在宿主細(xì)胞基因組中，病毒DNA上含有完整的E6、E7癌基因，其表達(dá)E6、E7原癌蛋白可引起自身調(diào)節(jié)，并導(dǎo)致宿主基因表達(dá)失調(diào)，干擾正常細(xì)胞周圍調(diào)控機(jī)制，使子宮頸上皮細(xì)胞出現(xiàn)惡變。HC-2陽(yáng)性有利于反映HR-HPV當(dāng)前感染狀態(tài)，僅以HRHPV感染陽(yáng)性率對(duì)CIN和SCC進(jìn)行篩查，可能導(dǎo)致一定的誤診事件。

在本資料中，采用HC-2對(duì)13種HR-HPV DNA進(jìn)行檢測(cè)，主要包括HPV16、18、31、33、35、39、 45、51、52、56、58、59及HPV68等，結(jié)果顯示子宮頸微腺體增生、原位腺癌及浸潤(rùn)性腺癌患者HRHPV感染陽(yáng)性率明顯高于慢性宮頸炎組織（P＜0.05），同時(shí)HR-HPV感染陽(yáng)性率從高到低依次為：浸潤(rùn)性腺癌＞原位腺癌＞子宮頸微腺體增生，提示當(dāng)HR-HPV持續(xù)感染并整合入宿主細(xì)胞，才可導(dǎo)致宮頸上皮惡性轉(zhuǎn)化，一過(guò)性感染并不能引起CIN，在應(yīng)用HC-2時(shí)，無(wú)法對(duì)HPV游離狀態(tài)、整合于宿主細(xì)胞進(jìn)行鑒別，說(shuō)明對(duì)HR-HPV感染進(jìn)行檢測(cè)，CIN陽(yáng)性預(yù)測(cè)值始終較低，故對(duì)子宮頸癌篩查也存在一定的局限性。因此為提高子宮頸癌診斷準(zhǔn)確性，需探尋一種準(zhǔn)確性高的診斷方案。

P16INK4A是人體中重要的抑癌基因，在機(jī)體抗癌保護(hù)方面發(fā)揮著重要作用。近年來(lái)，臨床對(duì)P16INK4A蛋白與宮頸癌關(guān)系研究不斷深入，逐漸成為宮頸癌研究的重點(diǎn)與難點(diǎn)，P16INK4A蛋白在宮頸上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化前已出現(xiàn)，當(dāng)然在慢性宮頸炎組織、子宮頸微腺體增生、原位腺癌及浸潤(rùn)性腺癌組織中表達(dá)水平不盡相同，隨著宮頸癌前病變級(jí)別進(jìn)展，P16INK4A表達(dá)水平上升。盡管P16INK4A蛋白是一種抑癌基因，但其在子宮頸癌中表達(dá)水平較高，在正常細(xì)胞受到相關(guān)因素干擾后轉(zhuǎn)化為腫瘤細(xì)胞過(guò)程中，人體可通過(guò)大量分泌P16INK4A蛋白，抑制正常細(xì)胞癌變，另一方面，腫瘤細(xì)胞的“逃避機(jī)制”使P16INK4A蛋白起到“癌基因”的作用，進(jìn)而出現(xiàn)腫瘤分級(jí)越高，P16INK4A表達(dá)水平就越高的現(xiàn)象。P16INK4A蛋白及產(chǎn)物在多數(shù)原發(fā)性癌細(xì)胞中缺失，但在HPV感染的子宮頸癌及癌前病變中表達(dá)水平較高。本資料結(jié)果顯示，P16INK4A蛋白在CIN和浸潤(rùn)性腺癌組織中陽(yáng)性率高于慢性宮頸炎組織，同時(shí)發(fā)現(xiàn)HR-HPV感染陽(yáng)性率與P16INK4A蛋白表達(dá)率呈正相關(guān)（P＜0.05），可作為HPV基因表達(dá)和活動(dòng)的標(biāo)志物，并作為子宮頸早期診斷的輔助指標(biāo)。因此在臨床子宮頸癌診斷中，可以將HPV感染檢測(cè)和P16INK4A蛋白表達(dá)聯(lián)合進(jìn)行篩查，能提高子宮頸癌診斷準(zhǔn)確性，且節(jié)省財(cái)力和物力，經(jīng)濟(jì)性較高，具有較高的推廣價(jià)值和應(yīng)用價(jià)值。

［1］陳瓊，屈王蕾，楊子英，等.高危型人乳頭瘤病毒感染后TopoⅡα和P16INK4A蛋白的表達(dá)及診斷價(jià)值.中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，2013，25（1）：25-28.

［2］王華，蔡紅兵，郭廣林，等.高危型HPV負(fù)荷量和p16INK4A蛋白監(jiān)測(cè)評(píng)估宮頸錐切術(shù)治療CIN.腫瘤學(xué)雜志，2012，18（9）：700-703.

［3］程靜新，姚立麗，沈谷群，等.P16INK4A蛋白及HPV感染與宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸鱗癌的關(guān)系研究.現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展，2011，20（8）：624-627.

［4］傅小一，張子雯.p16INK4A蛋白及HPV感染與宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸鱗癌的相關(guān)性分析.中國(guó)老年學(xué)雜志，2014，23（15）：4138-4140.

［5］王靜芳，郝敏，賴煒玲，等.P16INK4A在宮頸液基細(xì)胞學(xué)涂片中的表達(dá)及意義.中國(guó)藥物與臨床，2015，9（5）：618-620.

［6］劉艷君，臧春逸.P16INK4a、Ki-67在宮頸上皮病變組織中的表達(dá)規(guī)律及其與HPV負(fù)荷量的相關(guān)性研究.北京醫(yī)學(xué)，2011，33（11）：904-907.

［7］陳偉芳，張江宇，李荔，等.宮頸病變組織中p16蛋白表達(dá)及其與人乳頭瘤病毒感染的關(guān)系.中華婦幼臨床醫(yī)學(xué)雜志（電子版），2009，5（6）：572-576.

Cervical adenocarcinoma Cervical intraepithelial neoplasia Papillomavirus of high risk type patients P16INK4A protein

518110 廣東省深圳市龍華新區(qū)中心醫(yī)院病理科

【Abstracts】 Objective To analyze and discuss infection detection of papillomavirus（HR-HPV）of high risk type cervical adenocarcinoma and clinical signifi cance of P16INK4A protein expression. Methods 25 cases of cervical intraepithelial neoplasia CIN Ⅰ，30 cases of CIN Ⅱ，35 cases of CIN Ⅲ，24 cases of infi ltrating adenocarcinoma hospitalized from January 2013 to January 2014 in our hospital were selected，at the same time，35 cases of normal cervical tissues（chronic infl ammation）were selected，the expression of p16INK4A protein was detected by immunohistochemical method，and the 13 DNA HR-HPV was detected by the second generation hybrid capture（HC-2）. Results The positive rates of CIN of cervical intraepithelial neoplasia，CINⅡ、CINⅢtissue，invasiveadenocarcinoma HR-HPV infection and the positive rate of P16INK4A protein expression were higher than those of normal cervical cells（P＜0.05）； HR-HPV infection positive ratein cervical tissues and P16INK4A protein expression were the positive correlation（P＜0.05）. Conclusions Papillomavirus（HR-HPV）of high risk patients leading to the transformation of cervical deterioration has a close relationship with the P16INK4A protein expression，it can be used as an auxiliary diagnosis index in diagnosis of cervical adenocarcinoma，using P16INK4A and HR-HPV to diagnose can improve positively predictive value of cervical cancer and CIN，and it can provide scientifi c basis for the diagnosis and treatment of clinical diseases.