孫福財　呂漢孝

鹽酸米諾環(huán)素軟膏對微螺釘支抗種植體周圍炎齦下伴放線放線桿菌影響的熒光實時定量PCR檢測

孫福財呂漢孝

目的 探討鹽酸米諾環(huán)素軟膏對微螺釘支抗種植體周圍炎齦下伴放線放線桿菌（Aa）影響。方法 選取2013年1月至2015年1月15例微螺釘支抗治療后種植體周圍炎的患者，共20種植體，設(shè)為觀察組；選取同期接受微螺釘支抗治療的患者14例，共20種植體，經(jīng)證實無種植體周圍炎，設(shè)為對照組。記錄兩組菌斑指數(shù)（PLI）、探診深度（PD）及齦溝出血指數(shù)（SBI）。采用實時熒光定量PCR檢測Aa。結(jié)果 觀察組PLI、PD和SBI均顯著高于對照組（P＜0.01）；治療1、3周后觀察組PLI、PD和SBI顯著降低，治療6周后有上升趨勢，但與治療前相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。治療前，觀察組Aa 16s rDNA數(shù)量顯著高于對照組（P＜0.01）；治療1、3周后觀察組Aa 16s rDNA數(shù)量顯著降低，與治療前相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），治療6周后有上升趨勢，與治療前相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論 鹽酸米諾環(huán)素軟膏治療微螺釘支抗種植體周圍炎，可明顯改善種植體周圍炎臨床癥狀，療效確切，其對Aa具有較強(qiáng)的抗菌效果。實時定量PCR是檢測齦下菌斑中Aa的可靠方法。

微螺釘 鹽酸米諾環(huán)素軟膏 種植體周圍炎 伴放線放線桿菌

隨著口腔微螺釘種植技術(shù)的逐漸普遍，口腔微螺釘種植體周圍炎越來越引起科研人員的重視。伴放線放線桿菌（actinobacillus actinomycetemeomitans，Aa）是非腸源性、能發(fā)酵糖類的、兼性厭氧革蘭陰性球桿菌，Aa與侵襲性牙周炎高度相關(guān)，是侵襲性牙周炎的主要致病菌之一［1］。鹽酸米諾環(huán)素軟膏是一種新型的用于牙周病治療的局部緩釋劑型，其有效抗菌成分為鹽酸米諾環(huán)素，具有抗菌譜廣、耐藥菌少、抑制膠原酶代謝、促進(jìn)牙周組織再生等特點(diǎn)，在治療牙周炎上已經(jīng)成為常規(guī)用藥［2］，故本研究用以治療口腔正畸中的微螺釘支抗種植體周圍炎。本文通過微螺釘支抗種植體周圍袋內(nèi)局部應(yīng)用鹽酸米諾環(huán)素軟膏，通過熒光實時定量PCR檢測Aa的數(shù)量，分析鹽酸米諾環(huán)素軟膏的影響。

1　臨床資料

1.1一般資料 選取本院2013年1月至2015年1月15例微螺釘支抗治療后種植體周圍炎的患者，共62顆微種植釘，其中20顆發(fā)生種植體周圍炎，設(shè)為觀察組；選取同期于本院接受微螺釘支抗治療的患者14例，共20種植體，經(jīng)證實無種植體周圍炎，設(shè)為對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：無合并全身系統(tǒng)性疾病；近3個月內(nèi)未口服抗生素或免疫抑制劑；無四環(huán)素族藥物過敏史；植入種植釘＞0.5年，種植釘無松動，種植釘周圍無竇道。排除妊娠期或近期計劃妊娠婦女。參考Mombelli 等［3-4］微螺釘支抗種植體周圍炎診斷標(biāo)準(zhǔn)：種植釘周牙齦充血水腫，探診出血，有≥3mm的種植釘周袋。

1.2治療方法 治療前，徹底清除種植釘周圍齦上菌斑，用生理鹽水沖洗并吹干，采用鹽酸米諾環(huán)素軟膏（日本Sunstar INC，H20020306，0.5 g/支）深入牙齦袋底部，緩慢注入藥物，包裹牙齒種植釘，并略有溢出。用藥后囑患者2h內(nèi)不漱口、喝水和進(jìn)食。1次/周，4周為1個療程。采用醫(yī)師指導(dǎo)的方法刷牙。治療周期為1個療程。

1.3檢測項目 （1）臨床檢查：記錄兩組菌斑指數(shù)（PLI）、探診深度（PD）及齦溝出血指數(shù)（SBI）。PLI計分方法［5］：無菌斑記為0分；探針尖輕劃支抗螺釘表面即可發(fā)現(xiàn)菌斑記為1分；肉眼可見菌斑記為2分；大量菌斑記為3分。PD測量方法［6］：采用牙周探針檢測齦緣至袋底或齦溝底的距離，將其緊貼種植釘牙面、平行于種植釘牙長軸，穩(wěn)定支點(diǎn)后，探診壓力保持在 20～25g，采用提插式行走方法，并記錄，單位為毫米（mm）。SBI計分方法［7］：以約20g的力控制探針沿種植體齦緣探診，無出血情況發(fā)生為0分，探診有點(diǎn)狀出血為1分，探診出血在齦溝內(nèi)呈線狀為2分，探診出現(xiàn)重度出血為 3分。（2）Aa的定量檢測：①齦下菌斑采集：在用無菌棉球隔濕的情況下，去除齦上菌斑、軟垢，將無菌紙尖插入齦溝中，停留5s后取出，放入1個盛有1ml無菌生理鹽水的無菌離心管中，作為患者的微生物樣本。樣本置于-70℃保存。②熒光定量PCR檢測方法：高純總DNA快速提取試劑盒購自Generay公司，qPCR試劑SuperReal PreMix Plus（with SYBR Green I）購自TIANGEN公司，OD值測量儀器（高精度分光光度計）為Merinton SMA4000，定量PCR儀為CFX connect Real-Time PCR System，配套使用的分析軟件為BIO-RAD CFX Manager。本實驗采用的是外參法，在初始體積的100μl樣本中加入7.2×105copies的pEGFP質(zhì)粒，檢測時同時對EGFP的序列進(jìn)行檢測，作為數(shù)據(jù)分析時的參照。采用高純總DNA快速提取試劑盒提取種植體周齦下菌斑樣本中的DNA，設(shè)計Aa 16SrDNA引物序列如下：上游5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，下游5'-CACTTAAAGGTCCGCCTACGTGCC-3'。PCR產(chǎn)物大小為：593 bp。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系包括2×SuperReal PreMix Plus10μl，上游引物（10μM/L）1μl，下游引物（10μm/L）1μl，DNA 5ng，ddH2O 補(bǔ)足至20μl。使用CFX connect Real-Time PCR System熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增分析。反應(yīng)程序：50.0℃ 3min，95.0℃15min，95.0℃ 10s，56.0℃ 15s，72.0℃ 40s，共40個循環(huán)。1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1兩組患者治療前后PLI比較 見表1。

表1　兩組患者治療前后PLI比較［分，（x±s）］

2.2兩組患者治療前后PD比較 見表2。

表2　兩組患者治療前后PD比較［mm，（x±s）］

2.3兩組患者治療前后SBI比較 見表3。

表3　兩組患者治療前后SBI比較［分，（x±s）］

2.4兩組患者治療前后Aa 16s rDNA數(shù)量（經(jīng)對數(shù)變換后）比較 見表4。

表4　兩組患者治療前后Aa 16s rDNA數(shù)量（經(jīng)對數(shù)變換后）比較（x±s）

3　討論

微螺釘種植體支抗作為絕對支抗現(xiàn)已在口腔正畸界廣泛運(yùn)用。但是，微螺釘種植體容易引發(fā)周圍炎而導(dǎo)致種植體的松動，導(dǎo)致治療失敗。鹽酸米諾環(huán)素軟膏是一種用于牙周病治療的新型局部緩釋劑型，鹽酸二甲胺四環(huán)素是其有效成分，具有抗菌譜廣、耐藥菌少，促進(jìn)牙周組織再生等特點(diǎn)。鹽酸二甲胺四環(huán)素主要通過阻止細(xì)菌的蛋白合成而發(fā)揮其抗菌作用，對齦下菌斑中的革蘭陰性菌具有較強(qiáng)的抑菌效果。本資料應(yīng)用鹽酸米諾環(huán)素軟膏治療微螺釘支抗種植體周圍炎，結(jié)果顯示，治療前與治療后，觀察組PLI、PD和SBI均顯著高于對照組（P＜0.01）；治療1、3周后觀察組PLI、PD和SBI顯著降低，治療6周后有上升趨勢，但與治療前相比差異仍有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。該組結(jié)果表明鹽酸米諾環(huán)素軟膏局部用藥后支抗種植體周圍炎臨床癥狀得到顯著改善，療效確切。同時觀察到4周停藥后至6周時，各指標(biāo)均有上升，可能是由于停藥導(dǎo)致藥效降低所致。因此，作者建議對于微螺釘支抗種植體周圍炎患者采用鹽酸米諾環(huán)素軟膏治療，應(yīng)保持長期藥物的高濃度。

本文采用實時定量PCR技術(shù)對Aa進(jìn)行定量檢測，發(fā)現(xiàn)治療前，觀察組Aa 16s rDNA數(shù)量顯著高于對照組（P＜0.01）；治療1、3周后觀察組Aa 16s rDNA數(shù)量顯著降低，與治療前相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），治療6周后有上升趨勢，與治療前相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。提示鹽酸米諾環(huán)素軟膏對Aa具有較強(qiáng)的抗菌效果。

綜上所述，鹽酸米諾環(huán)素軟膏治療微螺釘支抗種植體周圍炎，可明顯改善種植體周圍炎臨床癥狀，療效確切，其對Aa具有較強(qiáng)的抗菌效果。實時定量PCR是檢測齦下菌斑中Aa的可靠方法。

［1］William SP， Travess H， Sandy J. The use of osseointegrate in plants in orthodontic patients：in plant and their use in children. Dent Update， 2013，31（5）：1287-1290.

［2］蔡同道.鹽酸米諾環(huán)素軟膏治療種植體周圍炎的療效觀察.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)，2012，2（11）：168-170.

［3］Mombelli A， van Oosten MA，Schurch E Jr，et al.The microbiota associated with successful or failing osseointegrated titanium implants. Oral Microbiol Immunol，1987，2（4）：145-151.

［4］麥理想，張晟，謝永建，等.微型支抗種植體的臨床效果觀察.中華口腔醫(yī)學(xué)研究雜志，2011，5（1）：79-84.

［5］Lehmann KM，Kammerer PW，Karbach J，et al.Long-term effect of over denture bar design on per-implant tissues. Int J Oral Maxillofac Implants，2013，28（4）：1126-1131.

［6］牟南南.藥物輔助治療牙周炎前后牙齦卟啉單胞菌的定量檢測.大連：大連醫(yī)科大學(xué)，2012：6.

［7］付文，張偉，易小英.鹽酸米諾環(huán)素與碘合劑治療種植體周圍炎的臨床療效及安全性.實用藥物與臨床，2014，17（4）：509-512.

Objective To investigate the effect of minocycline hydrochloride ointment on Actinobacillus actinomycetemeomitans for patients with microscrew implants peri-implantitis. Method 15 cases of patients（with 20 microscrew）with microscrew implants peri-implantitis from Jan 2013 to Jan 2015 were used as observation group and another 14 cases（with 20 microscrew）without microscrew implants peri-implantitis were used as control group. Plaque index（PLI），probing depth index（PD）and sulcus bleeding index（SBI）of two groups were determined.Real-Time PCR was used to inspect Actinobacillus actinomycetemeomitans.Results Before and after treatment，the PLI，PD and SBI of observation group were signifi cantly higher than that of control group（P＜0.01）. After treatment for 1st and 3rd weeks，the PLI，PD and SBI of observation group signifi cantly decreased and increased at 6th weeks without signifi cant difference（P＜0.05）.There was signifi cant difference between the 16s rDNA of Actinobacillus actinomycetemeomitans before treatment（P＜0.01）.After treatment，the 16s rDNA of Actinobacillus actinomycetemeomitans of observation group signifi cantly decreased（P＜0.05）.Conclusion Treatment on microscrew implants peri-implantitis with minocycline hydrochloride ointment could improve clinical symptom and inhibitory effect on actinobacillus actinomycetemeomitans.

Microscrew Minocycline hydrochloride ointmentPeri-implantitis Actinobacillus actinomycetemeomitans

浙江省溫州市科技局項目（Y20130318）

325000 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院口腔科