謝雪梅　葛自力

·實驗研究·

絲素蛋白取向電凝膠仿生誘導羥基磷灰石復合物合成的實驗研究

謝雪梅葛自力★

目的 用絲素蛋白取向電凝膠作為模板在模擬體液中仿生誘導羥基磷灰石的合成，并系統(tǒng)研究不同濃度的取向電凝膠和預鈣化溫度對所合成材料的表面形貌和鈣磷摩爾比的影響。方法 制取三種不同濃度具有一定取向性的絲素蛋白電凝膠，經(jīng)過預鈣化3次后分別放入模擬體液中靜置24h，并研究不同預鈣化溫度下復合材料表面的形貌特征變化。結(jié)果 通過改變?nèi)∠螂娔z濃度和改變預鈣化溫度，與未經(jīng)過電場作用的類凝膠仿生礦化誘導生成的羥基磷灰石比較，表面形貌發(fā)生了明顯的變化。并對所得材料進行測試表征，復合材料的鈣磷摩爾比與人體骨組織和牙體硬組織非常接近。結(jié)論 以絲素蛋白取向電凝膠作為模板，鈣磷離子在精確的調(diào)控和引導下，所制備的復合材料在組成、結(jié)構上及形態(tài)上與人體骨組織和牙體硬組織相似。有望為組織工程、整形外科和牙科領域提供一種性能優(yōu)良的修復材料。

絲素蛋白 取向電凝膠 羥基磷灰石

羥基磷灰石［Ca10（PO4）6（OH）2］（HA）是人體堅硬組織中（骨骼和牙齒）的主要無機成分［1-2］。人工合成的HA不僅在成分上與人體組織相同，而且在結(jié)構上也與人體組織相似，植入人體內(nèi)后，在體液作用下，鈣、磷會游離出材料表面，被機體組織所吸收，并長出新的組織［3］，具有良好的生物相容性和生物活性，能與人體骨組織形成化學鍵結(jié)合［4］，并產(chǎn)生骨傳導作用，是理想的硬組織替代材料，近20多年來已廣泛應用于整形外科和牙科領域［5-7］。天然蠶絲蛋白SF（絲素蛋白）具有獨特的機械性能、生物活性、良好的生物相容性和生物可降解性，且植入人體后不會產(chǎn)生免疫反應等特性。絲素蛋白可以誘導無機礦物鹽離子在其表面沉積，如在人體仿生環(huán)境下誘導碳酸鈣、HA等晶體的形成，并且礦化后的復合材料是一種良好的骨移植材料。

1　材料與方法

1.1取向SF纖維電凝膠 量取一定量0.5wt%、1.25wt%、2wt%類凝膠，分別置入電泳槽內(nèi)（排盡類凝膠內(nèi)空氣，盡量減少氣泡）類凝膠置入高度正好與電泳槽邊緣高度平齊，兩端接上直流電壓電極，電泳時間20min。

1.2模擬體液（SBF）的制備 見表1。

表1　制備SBF*的試劑

1.3預鈣化溶液的制備 （1）0.2mol/l氯化鈣溶液的制備：稱取1.1098g無水氯化鈣溶于40ml超純水中，同時用磁力攪拌器促進溶解，待完全溶解后，用Tris堿和1 M-HCl將pH值調(diào)整至7.4再注入超純水至50ml，即得到濃度為0.2M CaCl2溶液。（2）0.12mol/L磷酸氫二鉀溶液的制備：稱取1.3694g K2HPO4·3H2O溶于40ml超純水中，同時用磁力攪拌器促進溶解，待完全溶解后，再注入超純水至50ml，即得到濃度為0.12M K2HPO4溶液。

1.4取向絲蛋白纖維仿生誘導SF/HA的合成 （1）取向電凝膠的預鈣化處理：將三種濃度（0.5%、1.25%、2%）的取向電凝膠分別進行預鈣化處理，預鈣化液溫度為10℃。首先將取向電凝膠放入0.2M CaCl2溶液中放置1min后取出，用超純水清洗取向電凝膠，自然晾干。然后再將取向電凝膠放入0.12M K2HPO4溶液中放置1min后取出，仍用超純水清洗，自然晾干。將上述操作以此交替進行處理3次。將1.25%取向電凝膠進行預鈣化處理，預鈣化液溫度設置為25℃和37℃。其余操作方法同前。（2）預鈣化取向電凝膠的仿生礦化：將上述所得預鈣化取向電凝膠放入SBF中進行仿生礦化處理，反應溫度為37℃。將預鈣化取向電凝膠放入SBF中靜置24h，24h后取出用超純水清洗5遍進行去鹽處理，然后對材料進行凍干，即得材料取向電凝膠SF/HA。

1.5材料表征 采用掃描電鏡（SEM）、X-射線衍射（XRD）、紅外吸收光譜（FTIR）、原子發(fā)射光譜儀（ICP）分析。

2　結(jié)果

2.1不同濃度內(nèi)凝膠所得取向電凝膠SF/HA結(jié)果 （1）FTIR分析：圖1中的a、b、c曲線分別為內(nèi)凝膠、內(nèi)凝膠/HA、1.25%取向電凝膠/HA的紅外光譜，所有樣品均在預鈣化溫度為10℃和SBF（37℃）條件下制備。產(chǎn)物的化學組分由紅外光譜進行表征，圖中b、c曲線606cm-1、563cm-1處是HA中PO43-的O-P-O鍵的彎曲振動引起的吸收光譜，譜中1034cm-1、1098 cm-1、961cm-1處是P-O的伸縮振動的吸收譜帶，631cm-1、1619cm-1至1659cm-1處的譜帶是OH-的特征譜帶［8］。c曲線中1034cm-1峰強度明顯比b曲線強。（2）XRD分析：圖2中的結(jié)果顯示對照樣品在衍射角為25.9°、31.7°兩處出現(xiàn)較強的衍射峰，這些衍射峰位置分別對應：HA標準卡上的（002）、（211）晶面，表明該產(chǎn)物的成分為HA。其均為峰形較寬、強度低、不尖銳的衍射峰，表明該材料的HA結(jié)晶度比較低［9］。（曲線b，c所示）。b、c曲線在25.9°、31.7°比a曲線峰強，同時在222、213、004晶面也比a強，且隨著濃度的增大而增強，說明磷酸鹽在其表面的沉積量增加。在2θ=25.9°時的峰強度依次增強，說明HA在絲素蛋白表面取向生長呈c軸優(yōu)先生長。（3）SEM分析：圖3中的a圖片為類凝膠的掃描電鏡圖，表面平滑且致密。b圖為取向電凝膠的掃描電鏡圖。c～f均是經(jīng)預鈣化和SBF（人體仿生液）礦化后所形成的產(chǎn)物。內(nèi)凝膠經(jīng)仿生礦化后，只有少量球形結(jié)構的羥基磷灰石沉積，顆粒大小不一，分布也不均勻，球表面較光滑；d～f為濃度逐漸增大的掃描電鏡圖，隨著濃度的增加，其HA的形貌發(fā)生了一系列的變化。在0.5%取向凝膠/HA中，顆粒的排列明顯不同于內(nèi)凝膠/HA，沉積的羥基磷灰石數(shù)量增多，顆粒稍變小，但相互之間出現(xiàn)了交聯(lián)。在1.25%取向凝膠/HA中，顆粒變得更小，有少量交聯(lián)轉(zhuǎn)變?yōu)槎嗫谆ゴ┚W(wǎng)絡狀結(jié)構。在2%取向凝膠/HA中，羥基磷灰石形態(tài)發(fā)生了大的變化，由顆粒狀轉(zhuǎn)變?yōu)槠瑺?。圖c中形成的HA少。圖def，經(jīng)過電場作用，使裸露的羧基數(shù)目增加，形成的晶核增加，致模擬體液中釋放的鈣離子多，誘導沉積的磷酸鹽增多。取向電凝膠經(jīng)預鈣化和仿生礦化后磷酸鹽均勻沉積在其表面。從圖4a、b、c、d中可以看出，其形貌變化不大，只是同等放大倍數(shù)下，隨著濃度的增大，顆粒變得更小，有少量交聯(lián)轉(zhuǎn)變?yōu)槎嗫谆ゴ┚W(wǎng)絡狀交聯(lián)結(jié)構。e、f為2%取向電凝膠/HA，形成的晶核在增多，沉積的磷酸鹽也在增多，最終導致堆積明顯，晶體之間相互交聯(lián)成片狀，其分布仍比較均勻。（4）ICP分析：內(nèi)凝膠仿生所得材料中的鈣磷摩爾比低于取向電凝膠，且僅有1.60；而取向電凝膠隨著濃度的增加和預鈣化溫度的增加，鈣磷摩爾比也逐漸增加，最高達1.67，與羥基磷灰石中的鈣磷摩爾比（1.67）一致。

圖1　紅外光譜［預鈣化10℃SBF37℃。a：類凝膠；b：類凝膠/HA；c：1.25%取向凝膠/HA］

圖2　X R D衍射圖譜［預鈣化10℃SBF37℃。A：類凝膠/HA；b：0.5%取向凝膠/HA；c：2%取向凝膠/HA］

圖3　在預鈣化溫度10℃和SBF（37℃）中礦化后的表面形貌［a：純內(nèi)凝膠×50k；b：取向電凝膠×50k ；c：內(nèi)凝膠/HA ×50k；d：0.5%取向凝膠/HA ×50k；e：1.25%取向凝膠/HA ×50k；f：2%取向凝膠/HA×50k］

2.21.25%取向凝膠在不同預鈣化溫度所得1.25%取向電凝膠SF/HA （1）FTIR分析：在1645cm-1（酰胺Ⅰ）、1540cm-1（酰胺Ⅱ）和1234cm-1（酰胺Ⅲ）三處均有吸收峰；在1034cm-1、604cm-1、561cm-1三處出現(xiàn)PO43-的吸收峰，并且譜中1034cm-1處的吸收峰強度隨著預鈣化溫度的升高而增強。（2）XRD分析：隨著預鈣化溫度的升高，位于2θ=25.9℃、31.7℃、40.4℃處的衍射峰強度增強，而絲素蛋白的衍射峰未消失。（3）SEM分析：圖4cd為1.25%取向電凝膠在預鈣化溫度10℃和SBF（37℃）條件下仿生礦化后所得材料的SEM圖。由圖可見，有磷酸鹽沉積在取向電凝膠表面，且為球形結(jié)構，球與球之間多孔互穿網(wǎng)絡狀交聯(lián)結(jié)構。在預鈣化溫度25℃條件下，有較多磷酸鹽均勻沉積在取向電凝膠表面，且片狀結(jié)構，片狀結(jié)構之間相互交聯(lián)。當預鈣化溫度達到37℃時，有大量磷酸鹽均勻沉積，也呈片狀結(jié)構，只是同等倍數(shù)下，同等視野范圍內(nèi)磷酸鹽的數(shù)量更多，片狀結(jié)構體積變小，相互之間交聯(lián)更加有規(guī)律，形成規(guī)則多孔的簇狀結(jié)構。

圖4　不同濃度（ab0.5%、cd1.25%、ef2%）取向電凝膠/HA 在預鈣化溫度10℃和SBF（37℃）中礦化后的表面形貌（a、c、e×30k，b、d、f×50k）

3　討論

近年來HA制備方法的研究主要集中在HA納米結(jié)構的控制。常用的制備方法包括干法、濕法和水熱法。生物礦化指生物體在一定的環(huán)境條件下構筑基于無機礦物的分級結(jié)構的過程。生物礦化過程受到溶液狀態(tài)、生物大分子以及引導礦物成核和生長的基質(zhì)等一系列生物環(huán)境的高度調(diào)控，顯示出對無機晶體的成核、形貌及結(jié)晶學定向等控制力。SF分子作為生物礦化的有機模板已廣泛證實，絲素蛋白中-COO-對于礦化起著重要的作用，能夠誘導碳酸鈣、磷酸鈣的礦化，為無機物在其表面礦化提供模板，同時誘導無機離子沉積，在分子水平上控制著無機晶體的成核、生長、形貌、尺寸和取向，對于無機晶體的生長起著模板和調(diào)控的作用。本研究的創(chuàng)新之處在于以下四點：（1）提出了一種全新的SF自組裝的機制，通過電場處理調(diào)控，從而獲得具有一定取向性的規(guī)則結(jié)構的SF取向電凝膠。（2）無須高溫燒結(jié)和調(diào)節(jié)pH，近中性條件下合成HA。（3）以SF取向電凝膠作為模板在SBF中仿生誘導HA的合成，調(diào)控HA生物礦化，制備出SF取向電凝膠/HA復合材料，且HA晶體在其表面沿c軸取向生長。所制備的復合材料在組成、結(jié)構上及形貌上與人體骨組織和牙體硬組織相似。（4）通過改變?nèi)∠螂娔z濃度（0.5wt%、1.25wt%、2wt%）和預鈣化溫度（10℃、25℃、37℃），觀察復合材料表面的形貌特征變化得知：取向電凝膠更有利于HA沉積。在相同的條件下，溫度越高，形成的COOCa+和（-COO）2Ca越多，在SBF中釋放的鈣離子就越多，形成的HA就越多；濃度增高形成的晶核增多，沉積的磷酸鹽也在增多，晶體之間相互交聯(lián)成片狀，其分布仍比較均勻。表面形貌也有小球形結(jié)構向三維多孔片狀結(jié)構轉(zhuǎn)變，而SF的結(jié)構并未破壞。

當然也存在一些不足之處，本課題研究的SF/HA力學性能較低，有望在增強力學性能方面作進一步研究。計劃進一步行細胞實驗和動物學實驗學研究，研究該復合材料對大面積頜骨缺損的修復重建是否具有重要意義。

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Objective In the present study，we used the silk fi broin gel in orientation as template to induce the synthesis of hydroxyapatite in SBF. We have investigated the influence of different concentrations and pre-mineralization temperature on the surface appearance and calcium/ phosphorous ratio. Methods Three kinds of different concentrations silk fi broin gel in orientation were prepared by electrophoresis which were put into pre-mineralization water for three times and into SBF for 24h. We had investigated the infl uence of different kinds of preminilization temperature on the surface appearance. Results The surface appearance transform three-dimensional hole lamellar structure from small-sphere compared with silk fi broin gellike hydroxyapatite. The structure and surface appearance of the apatite were investigated by FTIR，XRD，SEM and ICP. The Results show that the HA crystal grows along the c-axes with increase of the concentration and preminilization temperature. And the HA morphology in the form of self-assembled on the gel surface transferred to three-dimensional hole lamellar structure. Conclusion The silk fi broin gel in orientation was used as template in the study， then calcium and phosphonium ions nucleation and growth on surface of silk fi broin gel in orientation，The composite material are similor to bones and teeth on composition，structure and morphology. So，the silk fi broin gel in orientati-on/HA will take important part in providing a high performance repair material for tissue engineering，plastic surgery and dental fi elds.

Silk fi broin Silk fi broin gel in orientation Hydroxyapatie

201411 上海市奉賢區(qū)奉城醫(yī)院口腔科