劉　平　程棟梁　袁玲玲

·臨床研究·

Twist和ZO-1在卵巢癌中的表達及其與卵巢癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性研究

劉平程棟梁袁玲玲

目的 研究Twist和ZO-1在卵巢癌和正常卵巢組織中的表達及其分布特點，并探討二者在卵巢癌表達中的相關(guān)性及其與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。方法 采用免疫組織化學方法（SP法）檢測卵巢癌患者手術(shù)切除標本癌組織及正常卵巢組織中Twist和ZO-1的表達水平，并與腫瘤的分級和分期進行統(tǒng)計學分析。結(jié)果 Twist在卵巢癌組織中陽性表達率（76.0%，38/50）高于正常卵巢組織（20.0%，4/20），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；ZO-1在卵巢癌組織中陽性表達率（32%，16/50）低于正常組織（85.0%，17/20），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；Twist和ZO-1的表達水平在卵巢癌的不同分級和分期中的表達差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；二者在卵巢癌中的表達呈負相關(guān)（r=-0.76，P＜0.05）。結(jié)論 Twist和ZO-1在卵巢癌組織中表達的變化可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)；Twist和ZO-1聯(lián)合檢測可作為評估卵巢癌轉(zhuǎn)移與預后的指標。

卵巢癌 Twist ZO-1 表達

卵巢上皮性癌的病死率長期居于婦科惡性腫瘤的第一位［1］，對女性健康危害較大，這與其較高的侵襲力和轉(zhuǎn)移力、耐藥性以及復發(fā)率等一系列生物學行為密切相關(guān)。因此，研究卵巢癌的發(fā)病機制以及侵襲、轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，對于提高卵巢癌患者的總體療效、改善和評估其預后具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial- mesenchymal transitions，EMT）在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用［2-4］，Twist是參與EMT的重要轉(zhuǎn)錄因子之一，在人體眾多上皮來源的惡性腫瘤中均存在Twist 基因突變，且與惡性腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移及預后密切相關(guān)。本研究以卵巢癌為觀察對象，采用免疫組化方法檢測卵巢癌中Twist與OZ-1等表達情況，從而探討卵巢癌轉(zhuǎn)移機制，為改善卵巢癌預后提供研究方向及實驗基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1一般資料 本研究觀察組標本來自本院病理科自2011年1月至2013年9月期間確診為卵巢癌的蠟塊標本共50例，均為原發(fā)性腫瘤，標本切去前均未行放化療或激素治療。收集同期因子宮脫垂或子宮肌瘤行全子宮及卵巢切除的病例20例作為對照組，對照組卵巢標本經(jīng)本院病理證實為正常卵巢組織。兩組標本年齡差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。觀察組標本根據(jù)WHO分級標準將其分為2級：高級別21例、低級別29例。按 FIGO分期標準進行分期：Ⅰ期9例、Ⅱ期21例、Ⅲ期16例、Ⅳ期4例。

1.2試劑 兔抗人Twist單克隆抗體購自英國Abcam公司，按1∶100 工作濃度的體積濃度進行稀釋后使用。濃縮型兔抗人ZO-1多克隆抗體購自BD公司。濃縮型 DAB 試劑盒、SP免疫組織化學染色試劑盒等常規(guī)試劑購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。

1.3方法 標本經(jīng)常規(guī)甲醛固定、包埋，制作蠟塊，用于免疫組織化學染色。Twist的檢測實驗采用SP兩步免組化的方法，具體實驗方法參考說明書進行，以磷酸鹽緩沖液（PBS）一抗作為陰性對照，用已知陽性結(jié)果作為陽性對照。ZO-1的檢測采用鏈霉親和素-生物-過氧化物酶復合物法（SABC法），ZO-1抗體工作濃度為1：50。

1.4結(jié)果判斷 由兩名高年資病理科醫(yī)師按照獨立雙盲的原則進行讀片。Twist蛋白主要表達于細胞質(zhì)中，呈現(xiàn)清晰的棕黃色或棕褐色表達為陽性表達，細胞內(nèi)無黃色或與背景一致的淺黃色為陰性。采用半定量法讀片，染色強度分為0分（陰性）、1分（弱陽性）、2分（中等）和3分（強陽性），染色范圍分為0分（0%）、1分（1%～10%）、2分（11%～50%）、3分（＞50%），根據(jù)染色強度和染色范圍之和作為染色最終結(jié)果，＜3分為Twist表達陰性，≥3分為陽性［5］。ZO-1蛋白主要表達于細胞膜和細胞漿中，以胞膜和胞漿中出現(xiàn)黃色顆粒者為陽性。每張切片陽性細胞的染色強度分為無著色（0分）、淡黃色（1分）、棕黃色（2分）、棕褐色（3分）。在200倍的顯微鏡視野下隨機選取5個視野，計算陽性細胞數(shù)，＜5%（0分）、5%～24%（1分）、25%～50%（2分）、51%～75%（3分）、＞75%（4分）。根據(jù)染色強度和陽性細胞數(shù)評分之和作為染色最終結(jié)果，0～4分為陰性表達（-），≥5分為陽性（+）。

1.5統(tǒng)計學方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（x±s）表示，采用t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1Twist和ZO-1蛋白在卵巢上皮癌與正常卵巢組織的表達 免疫組化染色顯示，Twist蛋白主要表達于細胞質(zhì)中，呈現(xiàn)清晰的棕黃色或棕褐色；ZO-1蛋白主要表達于細胞膜和細胞漿中，典型陽性者呈黃色顆粒狀（圖1～4）。

2.2Twist和ZO-1蛋白在卵巢上皮癌與正常卵巢組織中表達的比較 本組50例卵巢癌組織標本中有38例Twist蛋白表達陽性，陽性表達率為76%；20例正常卵巢組織標本有4例Twist蛋白表達陽性，陽性表達率20%；兩組樣本差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。50例卵巢癌組織標本中有16例ZO-1蛋白表達陽性，陽性表達率為32%；20例正常卵巢組織標本有17例ZO-1蛋白表達陽性，陽性表達率85%；兩組樣本差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

圖1　Twist在卵巢癌組織中的表達［×200（陽性）］

圖2　Twist在正常卵巢組織中的表達［×200（陰性）］

圖3　ZO-1在卵巢癌組織中的表達［×200（陰性）］

圖4　ZO-1在正常卵巢組織中的表達［IHC×200（陽性）］

表1　卵巢癌組織與正常卵巢組織中Twist和ZO-1蛋白的表達［n（%）］

2.3Twist和ZO-1蛋白表達與卵巢上皮癌臨床病理特征的關(guān)系 Twist蛋白在高級別腫瘤和分期晚的卵巢癌組織中的表達高于低級別腫瘤和分期早的卵巢癌組織（P＜0.05）。ZO-1蛋白在卵巢癌組織中的表達則與之相反，其在高級別腫瘤和分期晚的卵巢癌組織中的表達明顯低于低級別腫瘤和分期早的卵巢癌組織（P＜0.05）。見表2。

表2　Twist和ZO-1蛋白的表達與卵巢癌臨床病理特征的關(guān)系

2.4Twist和ZO-1蛋白在卵巢上皮癌組織中表達的相關(guān)性分析 38例Twist蛋白表達陽性的卵巢癌組織中ZO-1蛋白表達陽性者5例，表達陰性者33例；而在Twist表達陽性的16例卵巢癌組織中ZO-1蛋白表達陽性者5例，表達陰性者11例；相關(guān)分析結(jié)果提示卵巢組織中Twist蛋白表達與ZO-1蛋白表達呈負相關(guān)（r=-0.76，P＜0.05）。

3　討論

卵巢癌是起源于正常卵巢表面上皮（OSE）或內(nèi)襯 OSE 的包涵囊腫，約占卵巢惡性腫瘤的 90%，是女性生殖器官中常見的腫瘤之一，發(fā)病率次于子宮頸癌和子宮體癌列居第3位，但病死率長期位居婦科惡性腫瘤之首，對女性健康危害極大。雖然目前治療卵巢癌有手術(shù)、放化療及介入治療等多種方法，但對晚期患者總體療效欠佳。所以，開展卵巢癌病理特點和分子生物學的研究與探索對于干預卵巢癌的發(fā)展和評估卵巢癌的預后具有重要意義。

EMT的概念最早由哈佛大學Hay等提出，后經(jīng)證實在較多物種胚胎形成、神經(jīng)嵴形成等過程中存在的一種現(xiàn)象，主要指上皮細胞經(jīng)歷了短暫的結(jié)構(gòu)改變后，表型與細胞形態(tài)發(fā)生改變，從而獲得遷移與運動能力；后來發(fā)現(xiàn)在細胞轉(zhuǎn)化、腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移過程中也存在類似現(xiàn)象。正是因腫瘤進展過程中的EMT，才使得腫瘤細胞獲得浸潤周圍組織的能力，從而發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，形成真正意義上的惡性腫瘤。

Twist是近年發(fā)現(xiàn)的一個癌基因，有研究顯示［6］，Twist在EMT過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。通過進一步深入的研究，國內(nèi)學者也發(fā)現(xiàn)［7］，Twist參與了宮頸癌、卵巢癌等惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程，與腫瘤的預后密切相關(guān)。本研究顯示，卵巢癌組織中Twist蛋白的表達明顯高于正常卵巢組織，且癌組織分化程度越低，分期越晚，Twist蛋白表達越高。細胞連接蛋白OZ-1的表達則正好相反：卵巢癌組織中OZ-1 蛋白的表達低于正常卵巢組織，且隨著腫瘤的進展呈下降趨勢。進一步研究發(fā)現(xiàn)，在無放化療和激素等干預措施的情況下，Twist蛋白表達上升的同時OZ-1的表達下降，二者在卵巢癌中的表達存在負相關(guān)性。

ZO-l是第1個被證實的緊密連接（fight junction，TJ）附著蛋白，研究表明［8］，TJ的結(jié)構(gòu)破壞和功能的改變，與多種上皮細胞惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)聯(lián)，可能是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。關(guān)于ZO-1蛋白在腫瘤轉(zhuǎn)移中所發(fā)揮的作用的研究較少，國內(nèi)學者郭興軍等［9］的研究顯示，TJ蛋白Z0-1在膽管癌中的表達較正常組織明顯減少，認為ZO-1在膽管癌組織中的表達與膽管癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本資料也得到了相似的結(jié)論，在正常卵巢組織中ZO-1蛋白高表達，而在卵巢癌組織中ZO-1蛋白低表達，且其表達與卵巢癌的病理分期和分化程度具有顯著相關(guān)性。

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Objective To investigate the expression and distribution of Twist and ZO-1 in epithelial ovarian cancer and to explore the correlation between Twist and ZO-1 in ovarian cancer. Methods lmmunohistoehemical method（SP method）was used to detect the expression of Twist and ZO-1 in 50 cases of ovarian cancer tissue and 20 cases of normal tissue of patient.The clinicopathologic characteristics and tumor staging were statistically analyzed. Results The positive rate of Twist was76.0%（38/50）in ovarian cancer，20.0%（4/20）in the normal tissue of other patients，There were signifi cant differences（P＜0.05）.The positive rate of ZO-1 was 32.0%（16/50）in ovarian cancer，signifi cantly lower than that in the normal tissue 85.0%（17/20）（P＜0.05）.The expression of Twist and ZO-1 were associated with tumor staging and grading in ovarian cancer patients（P＜0.05）. There was a negative correlation between the expression of Twist and ZO-1 in ovarian cancer patients. Conclusions The the high express of Twist and low express of ZO-1 may be concerned with the genesis and the development of human epithelial ovarian cancer.The combined detection of Twist and ZO-1 expression may be used in assessing the metasasis and predicting the clinical prognosis of adenocarcinoma ovarian cancer.

EOC Twist ZO-1 Expression

湖北省十堰市太和醫(yī)院院級基金項目（2014JJXM0024）

442000 湖北省十堰市太和醫(yī)院病理科