趙　雷　鄧遠飛　劉　莉

胰島素對糖尿病大鼠膀胱逼尿肌病理組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)的影響

趙雷鄧遠飛劉莉

目的 探討胰島素（INS）對糖尿病大鼠膀胱逼尿肌病理組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)的影響。方法 使用鏈脲佐菌素（STZ）建立誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型，按照隨機原則分為INS注射組（28例）與實驗觀察組（28例），且設(shè)置正常對照組（28例）。在7、11周時分別對上述3組大鼠進行膀胱逼尿肌切片標(biāo)本常規(guī)HE染色，并且觀察大鼠膀胱逼尿肌在光鏡下的組織學(xué)形態(tài)，并隨機選擇一些膀胱逼尿肌切片在電鏡下進行超微病理檢查。結(jié)果 在光鏡下觀察的HE染色石蠟切片中，糖尿病觀察組的膀胱逼尿肌肌束之間排列疏松紊亂，間隙顯著變寬，膠原組織含量減少，在11周時比7周時更明顯；而對照組的膀胱逼尿肌橫斷切面和縱行切斷面所觀察的肌束之間排列非常整齊，肌束之間的結(jié)構(gòu)連接緊密，間隙中有豐富的結(jié)締組織；INS注射組與對照組比較無明顯差異。在電鏡下觀察HE染色石蠟切片中，糖尿病觀察組肌束內(nèi)平滑肌細胞（SMC）的細胞直徑變大，間隙變小，膠原纖維含量減少，SMC肌膜致密帶密度減小，密度帶之間分界不清晰，肌膜各區(qū)域的密度逐漸相同，肌細胞的中間連接、密斑變少，但仍然可觀察到神經(jīng)；上述改變較少隨著時間的增加而改變；INS注射組和對照組的超微結(jié)構(gòu)大體相同。結(jié)論 糖尿病大鼠早期即有膀胱逼尿肌組織形態(tài)學(xué)上的變化，早期注射INS治療可以對預(yù)防和減輕上述變化有良好的效果，可能與INS在預(yù)防和延緩糖尿病神經(jīng)原膀胱的發(fā)生、發(fā)展方面有關(guān)，提示臨床醫(yī)生對臨床上已經(jīng)診斷出患有早期糖尿病神經(jīng)原膀胱的患者應(yīng)盡早使用INS治療。

胰島素 膀胱逼尿肌 組織學(xué)形態(tài) 糖尿病

糖尿病會引起較多并發(fā)癥，糖尿病神經(jīng)原膀胱是泌尿系統(tǒng)并發(fā)癥之一，其占糖尿病并發(fā)癥發(fā)病率的40%～60%［1］，早期患者多無明顯的臨床癥狀?；颊呋加刑悄虿r，本身的膀胱逼尿肌組織形態(tài)上發(fā)生了相應(yīng)的病理變化，但目前而言其病理變化的原因尚未完全明確，所以有必要對其進行深入研究。本研究自2014年8月至2015年1月建立患有胰島素（INS）依賴型糖尿病的大鼠模型，取實驗大鼠的膀胱逼尿肌為觀察對象，將大鼠膀胱逼尿肌組織切片的組織形態(tài)學(xué)改變、電刺激及注射INS后與正常對照組進行一系列比較，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1　材料與方法

1.1材料 （1）儀器：血糖儀。（2）藥物：鏈脲佐菌素粉劑（Streptozotocin，STZ，美國Sigma公司）、0.1mol/ L的檸檬酸鹽緩沖液、魚精蛋白鋅INS。（3）動物：SD大鼠，雌雄不限。

1.2方法 （1）糖尿病大鼠模型制備：糖尿病大鼠造模方法：首先將造模大鼠禁食10h，將STZ粉劑溶于0.1 mol/L的檸檬酸鹽緩沖液，配成質(zhì)量濃度為10g/L的溶液，按60mg/kg進行腹腔注射，注射后3d取尾靜脈血采用血糖儀測定血糖，當(dāng)血糖＞16.7mmol/L，可以確定為造模成功。注射后4周時再次進行血糖測試確證血糖水平。INS注射組在注射STZ后4d進行皮下注射魚精蛋白鋅INS，注射量為2～6U/次，1次/d，維持血糖6～10mmol/L。每次測血糖均在上午8～10點。（2）動物分組：選取雌性SD 大鼠196只，月齡：5周，體重200～230g，按照實驗所需的標(biāo)準喂養(yǎng)1周后用于實驗研究。采取隨機數(shù)字表的方法留下對照組56只，經(jīng)STZ腹腔注射造模的大鼠共140只。經(jīng)STZ腹腔注射的大鼠均在注射3d后測量大鼠的血糖，造模成功的標(biāo)準為血糖＞16.7mmol/L，造模成功的大鼠有130只，平均血糖（27.2±3.6）mmol/L。用隨機數(shù)字表的方法將大鼠分為四組：10周STZ組（32只），6周STZ組（30只），10周STZ +INS組（34只），6周STZ +INS組（32只）。飼養(yǎng)中10周STZ組4只死亡，6周STZ組2只死亡，10周STZ +INS組4只死亡，2只未達標(biāo)，6周STZ +INS組2只死亡，2只未達標(biāo)。實際完成10周STZ組有28只，6周STZ組有28只，10周STZ +INS組有28只，6周STZ +INS組有28只。設(shè)立以下兩個對照組： 10周對照組28只，6周對照組28只。（3）電鏡下糖尿病大鼠膀胱逼尿肌的病理檢查方法：取每一張切片標(biāo)本3～5張電鏡照片進行病理常規(guī)觀察，用INS注射組所得的電鏡照片與對照組相互比較觀察。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1實驗動物一般情況 見表1。

表1　INS注射組及對照組大鼠一般狀況（±s）

表1　INS注射組及對照組大鼠一般狀況（±s）

注：同時間與對照組比較，*P＜0.01；同時間與其他組比較，#P＜0.01

STZ+INS組10周對照組10周STZ組10周STZ+INS組n282828282828質(zhì)量（g）221±44219±12220±22222±11217±27220±12第3天血糖（mmol/L）6.3±2.326.8±2.0*27.1±2.6*6.1±3.327.3±5.1*27.5±3.8*第4周血糖（mmol/L）6.5±2.426.2±2.9#6.1±3.46.3±4.125.3±3.5#6.4±3.6麻醉后殘余尿（ml）0.06±0.02 0.56±0.40#0.08±0.210.09±0.220.69±0.42#0.11±0.64組別6周對照組6周STZ組6周

2.2電鏡下糖尿病大鼠膀胱逼尿肌結(jié)構(gòu)表現(xiàn)形態(tài) （1）對照組：膀胱逼尿肌肌束內(nèi)的平滑肌細胞（SMC）排列分布均勻，細胞間排列非常整齊。SMC之間存在較多中間連接（Intermediate junction），細胞之間的間隙較小，在細胞間隙中含有少量彈性纖維與膠原纖維。連續(xù)排列的細胞肌膜分布在肌細胞四周，低密度帶與高密度帶（致密帶）交替排列，肌膜下可見少量小泡，細胞漿可見大量肌絲及密體，以及線粒體等細胞器。（2）糖尿病觀察組：與對照組比較超微結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出比較明顯的差異：①膀胱逼尿肌肌束內(nèi)SMC的間隙變小，細胞之間的膠原纖維含量減少，細胞與細胞的距離變短。②肌膜內(nèi)致密帶的密度變小，肌膜密度趨于一致，細胞間的中間連接和密斑均減少。③少量SMC肌膜形成鋸齒狀突起，兩細胞的肌膜吻合交錯。④SMC胞漿里線粒體發(fā)生變性。⑤神經(jīng)無明顯異常改變，無明顯退化仍然可見神經(jīng)突觸內(nèi)的小泡數(shù)量無明顯減少。見圖1、2。

圖 1 6周治療組電鏡圖（×20000）

圖2　10周治療組電鏡圖（×12000）

2.3光鏡下糖尿病大鼠膀胱逼尿肌結(jié)構(gòu)表現(xiàn)形態(tài) （1）對照組：在低倍鏡下可見膀胱逼尿肌橫斷切面和縱行切斷面的肌束排列整齊、有序。肌束間隙中充滿結(jié)締組織，連接緊密，且有許多神經(jīng)束填充在肌束間隙中。在高倍鏡下可觀察到SMC之間結(jié)構(gòu)連接緊密，排列整齊。（2）糖尿病觀察組：在低倍鏡下有明顯的黏膜異常改變，固有黏膜發(fā)生充血水腫等炎癥病變。膀胱逼尿肌肌束之間排列疏松紊亂，部分肌束發(fā)生斷裂。肌束間的間隙膠原纖維含量減少，間隙明顯增寬。肌束之間仍可見神經(jīng)束，小血管出現(xiàn)充血。并且上述改變在11周時較7周時更加明顯。（3）糖尿病INS注射組：與正常對照組比較，低倍鏡和高倍鏡下表現(xiàn)出的形態(tài)無顯著差異。見圖3。在上述改變中，糖尿病組在11周時比在7周時的改變程度未明顯加重。糖尿病INS注射組與正常對照組比較超微結(jié)構(gòu)無明顯改變。

圖3　10周治療組病理切片（×40）

3　討論

糖尿病是一組以高血糖為特征的代謝性疾病。高血糖則是由于INS分泌缺陷或其生物作用受損，或兩者兼有引起。糖尿病長期存在的高血糖，導(dǎo)致各種組織，尤其是眼、腎、心臟、血管、神經(jīng)的慢性損害、功能障礙，會引起較多的并發(fā)癥。

糖尿病神經(jīng)原膀胱是糖尿病最常見的并發(fā)癥之一，該病有尿頻、排尿困難、膀胱殘余尿增多、尿潴留、充盈性尿失禁、頑固性尿路感染、腎積水或腎功能衰竭等臨床癥狀的產(chǎn)生，嚴重影響患者的生活質(zhì)量，危及患者的身心健康，甚至生命［2］。目前該病治療方法較多，主要有擬膽堿藥物、神經(jīng)生長因子、手術(shù)、電刺激等方法，但均無滿意的臨床療效［3］。臨床醫(yī)生只能通過詳細詢問患者的病史與癥狀、體格檢查再結(jié)合括約肌電圖檢查、膀胱電生理測定、實驗室和尿動力學(xué)檢查等方法的結(jié)果確診糖尿病神經(jīng)原膀胱。上述診斷的過程復(fù)雜且花費時間多，可能導(dǎo)致患者的疾病不能及時發(fā)現(xiàn)，如能從病理生理水平去診斷分析，將能早發(fā)現(xiàn)、早干預(yù)，可最大限度改善患者的預(yù)后。因此從病理組織形態(tài)學(xué)的角度觀察糖尿病大鼠膀胱逼尿肌的改變和在INS注射后糖尿病大鼠的膀胱逼尿肌在病理組織形態(tài)學(xué)變化對臨床診斷有較大幫助［4］，可以為臨床診斷提供理論依據(jù)，做到盡早預(yù)防、盡早診斷和盡早治療糖尿病神經(jīng)原膀胱。

研究表明，在光鏡下觀察糖尿病大鼠膀胱逼尿肌產(chǎn)生的最常見病理學(xué)異常改變是肌束的體積增大、肌束之間的間隙變大、肌束之間的膠原含量降低、肌束排列疏松紊亂［5］。目前對糖尿病大鼠膀胱逼尿肌產(chǎn)生的一系列形態(tài)學(xué)上改變的原因尚不清楚，可能因為大鼠患有糖尿病后的神經(jīng)發(fā)生病變。本研究中發(fā)現(xiàn)肌束結(jié)構(gòu)排列疏松紊亂，肌束之間的小血管充血水腫。但并未發(fā)現(xiàn)膀胱逼尿肌肌束的體積有明顯的增大，可能與造模時間比較短，還未出現(xiàn)代償性肥大有一定的關(guān)系。在實驗中還發(fā)現(xiàn)黏膜下和肌束間的膠原組織含量減少，但并非膠原組織量的絕對值減少。有關(guān)研究可以證實膀胱重量和膠原的增加也可以是膀胱部分出口梗阻的原因。細胞增長和膠原形成速度是基本相同的，膀胱總重量與膠原總量的比值將會增加或降低。部分大鼠模型患有膀胱出口梗阻，膀胱逼尿肌增生的速度大于膠原組織生成的速度，雖然膠原組織的含量絕對增加，但膠原組織所占膀胱逼尿肌的比重卻會下降，因此膠原濃度也降低。研究中在形態(tài)學(xué)觀察時期能觀察到膀胱逼尿肌肌細胞體積肥大，細胞形態(tài)表現(xiàn)出多樣性，膀胱逼尿肌肌束間、細胞間膠原纖維組織含量減少。實驗人員取以前研究有關(guān)膀胱出口梗阻繼發(fā)的肥大細胞與糖尿病大鼠肥大的膀胱逼尿肌的細胞做比較和分析，發(fā)現(xiàn)兩者間的形態(tài)學(xué)特征并無差異［6］。故作者認為在研究中糖尿病組大鼠膀胱逼尿肌的膠原組織相對含量下降和由于膀胱出口梗阻造成膀胱逼尿肌的膠原組織相對含量下降具有相同的原因。因此在光鏡下觀察時出現(xiàn)肌束之間的膠原纖維含量減少是膀胱逼尿肌的膠原組織相對含量的減少，而并非絕對含量的減少，且在光鏡下觀察時，上述出現(xiàn)的改變會隨造模時間的加長而變得更顯著［7］。是由于膀胱逼尿肌肌束結(jié)構(gòu)之間排列疏松紊亂及膠原纖維含量減少才導(dǎo)致膀胱逼尿肌收縮功能的降低，這與作者在膀胱逼尿肌肌條張力和在體膀胱壓力測定時所得結(jié)論相符合。在光鏡下觀察INS注射組大鼠的膀胱逼尿肌的組織形態(tài)與正常對照組基本相同，因此可以推測INS用于臨床治療糖尿病具有明顯的療效，能明顯的預(yù)防、延緩糖尿病鼠膀胱組織病理形態(tài)學(xué)上的改變。

在本次實驗中電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，膀胱逼尿肌肌束內(nèi)SMC的膠原纖維含量減少。與本次實驗光鏡下的觀察具有相同的結(jié)果。少量SMC肌膜異常突起呈鋸齒狀并互相嵌和，胞漿內(nèi)出現(xiàn)線粒體變性。電鏡下神經(jīng)形態(tài)無以上所述變化，但還需深入研究糖尿病晚期的膀胱逼尿肌神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)的改變。在電鏡下觀察到肌細胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)線粒體空泡變性，因為線粒體是為細胞能量的供應(yīng)站，所以其改變對細胞的能量供應(yīng)產(chǎn)生較大影響，可能造成膀胱逼尿肌收縮力下降。在電鏡下INS注射組大鼠膀胱逼尿肌組織形態(tài)上和正常對照組大體相同。通過對INS注射組大鼠的膀胱逼尿肌在電鏡下形態(tài)的表現(xiàn)并與正常對照組的比較的研究，推測INS可以有效治療糖尿病并發(fā)癥中的糖尿病神經(jīng)原膀胱，對預(yù)防、延緩早期糖尿病神經(jīng)原膀胱的發(fā)生有重大的臨床意義，這與INS的胰外作用或INS降低血糖有一定關(guān)系。

綜上所述，糖尿病早期會出現(xiàn)膀胱逼尿肌組織形態(tài)學(xué)上的改變，并會影響膀胱的收縮功能，INS治療可以有效的預(yù)防和延緩糖尿病神經(jīng)原膀胱的發(fā)生。因此診斷出患有糖尿病神經(jīng)原膀胱的患者應(yīng)盡早使用INS治療，做到早發(fā)現(xiàn)、早治療。

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Objective To study the insulin（INS）on diabetic rats bladder tissue morphology performance forced urinous myopathy. Methods Use chain urea with cephalosporins（STZ）induced diabetic rats model was established，based on the principle of random divided into insulin injection group（28 cases）and the experimental group（28 cases），and set up the normal control group（28 cases）.At 7，11 w，respectively，for the above three groups of rats bladder detrusor biopsy specimens of routine HE staining，and observed the rat bladder detrusor histological morphology under light microscopy，and randomly selected some of the bladder detrusor slice ultrastructural examination under the electron microsco.Results Under light microscopy observation of paraffi n section，HE dyeing diabetes group between the bladder detrusor muscle bundles of loosely arranged disorder，gap widened signifi cantly，reduce collagen content，in the 11 w was more obvious than when 7 w；And the control of the bladder detrusor cross sectional plane and longitudinal cut surface was observed between muscle bundle arrangement was very neat，the structure of the connection between muscle bundles were tight，clearance was rich in the connective tissue；.Insulin injection group compared with the control group had no obvious difference.HE dyed in paraffi n section，when observed under electron microscope， diabetes group within the muscle bundle of smooth muscle cells（SMC）had larger cell diameter，smaller gap，and collagen fi ber content reduce，SMC muscle membrane density decreased density，density zone between the boundary was not clear，the density of various regions gradually the same muscle membrane，muscle cells in the middle of the connection，tight spot less，but still can be observed nerve；The above change little with the increase of time and change；Ultrastructure of insulin injection group and the control group in general were the same. Conclusions Are laid down early diabetic rats bladder detrusor change of tissue morphology，early insulin therapy to prevent and reduce the effect of these changes are good，may be related to insulin in the prevention and delay the occurrence and development of diabetic neurogenic bladder with help，So prompt clinicians to have clinical patients diagnosed with early diabetic neurogenic bladder should use insulin treatment as soon as possible.

Insulin Bladder detrusor Histological appearance Diabetes

518035 北京大學(xué)深圳醫(yī)院