姚宗芹，付存玉，石運香，張志剛，周紀(jì)星，李海德

(臨沂市沂水中心醫(yī)院，山東臨沂276400)

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ERK信號通路對急性ST段抬高型心肌梗死患者急診PCI術(shù)后冠脈無復(fù)流的影響

姚宗芹，付存玉，石運香，張志剛，周紀(jì)星，李海德

(臨沂市沂水中心醫(yī)院，山東臨沂276400)

目的探討ERK信號通路對急性ST段抬高型心肌梗死患者急診PCI術(shù)后冠脈無復(fù)流的影響。方法 選擇急性ST段抬高型心肌梗死(STEMI)行急診PCI的患者38例，根據(jù)術(shù)后TIMI分級分為無復(fù)流患者16例(無復(fù)流組)和有效灌注者22例(再灌注組)；另選擇20例健康體檢者作為對照組。采用全自動生化分析儀測定各組血清總膽固醇(TC)﹑甘油三酯(TG)﹑低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)﹑高密度脂蛋白膽固醇﹑尿素氮﹑肌酐﹑尿酸等生化指標(biāo),利用RT-PCR方法測定各組外周血單個核細(xì)胞ERK mRNA及bad mRNA表達。結(jié)果 無復(fù)流組、再灌注組血清TG、TC、LDL-C水平明顯高于對照組(P均<0.05)；無復(fù)流組血清LDL-C水平明顯高于再灌注組(P<0.05)。對照組單個核細(xì)胞ERK mRNA表達水平高于無復(fù)流組及再灌注組，bad mRNA表達水平低于無復(fù)流組及再灌注組(P均<0.05)；無復(fù)流組ERK mRNA表達水平低于再灌注組，bad mRNA表達水平高于再灌注組(P均<0.05)。單個核細(xì)胞ERK mRNA與bad mRNA表達水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.61，P<0.05)。結(jié)果 在 STEMI患者急診PCI術(shù)無復(fù)流的患者中ERK信號通路表達活性下降；ERK信號通路活性降低及bad mRNA表達增強可能參與了急診PCI術(shù)后冠脈無復(fù)流的發(fā)生。

心肌梗死；細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶；急診PCI； 冠脈無復(fù)流；細(xì)胞凋亡

盡快開通閉塞血管恢復(fù)冠脈血流，實現(xiàn)早期迅速有效再灌注是治療急性心肌梗死的最重要手段。然而，在開通梗死相關(guān)動脈(IRA)的同時，缺血心肌在超微結(jié)構(gòu)、功能、代謝及電生理方面均發(fā)生一系列變化，最終可能導(dǎo)致無復(fù)流現(xiàn)象的發(fā)生。影響無復(fù)流現(xiàn)象的因素眾多且受多種復(fù)雜信號通路的調(diào)控，各種因素存在多層次、多環(huán)節(jié)的相互作用[1]。近年研究表明，bad可通過細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與細(xì)胞凋亡的全過程；壞死心肌中存在ERK通路活性的改變及凋亡蛋白的過度激活，也是導(dǎo)致無復(fù)流發(fā)生的重要機制之一。本文以急性ST段抬高型心肌梗死(STEMI)患者為研究對象，觀察其ERK mRNA及bad mRNA表達的變化，以期從分子水平探尋無復(fù)流現(xiàn)象的發(fā)生機制。

1　資料與方法

1.1臨床資料選擇2015年1月～2016年1月在本院行急診PCI治療患者38例，男23例、女15例，年齡(58.5±8.4)歲，均符合STEMI的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]。入選標(biāo)準(zhǔn)：①首發(fā)心肌梗死患者；②發(fā)病在12 h以內(nèi)并成功行急診 PCI 者；③罪犯血管為單支；④術(shù)后罪犯血管的殘余狹窄<20%。排除標(biāo)準(zhǔn):① 有嚴(yán)重肝、腎疾病患者；②左主干病變；③多支血管病變準(zhǔn)備行冠狀動脈搭橋者；④術(shù)前有嚴(yán)重影響血流動力學(xué)的惡性心律失常；⑤嚴(yán)重鈣化或扭曲病變?；颊呔屑痹\PCI治療，冠狀動脈支架置入術(shù)均按標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)完成。根據(jù)TIMI分級38例患者分為無復(fù)流患者16例(無復(fù)流組)和有效灌注者22例(再灌注組)。另選擇20例體檢健康者作為對照組，男10例、女10例，年齡(56.8±7.7)歲，其性別構(gòu)成、年齡與無復(fù)流組、再灌注組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P均>0.05)。本次研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核通過，入選研究對象均在知情同意下簽署知情同意書。

1.2血清生化指標(biāo)檢測 STEMI患者PCI術(shù)后即刻抽取肘靜脈血4 mL、對照組晨起抽取空腹肘靜脈血4 mL，EDTA抗凝。其中取2 mL靜脈血送生化室采用日本奧林巴斯公司生產(chǎn)的AU5400全自動生化分析儀測定血清血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)﹑低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)﹑高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)﹑尿素氮(BUN)﹑肌酐(Cr)等生化指標(biāo)。另2 mL靜脈血留作單個核細(xì)胞ERK mRNA、bad mRNA表達檢測。

1.3ERK mRNA、bad mRNA表達檢測取2 mL靜脈血，用Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個核細(xì)胞，硫氰酸胍一步法提取單個核細(xì)胞總RNA。ERK、bad及β-actin內(nèi)參基因的引物序列由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司提供。ERK：上游引物5′-ATATCCTTGGCTACTAAC-3′，下游引物 5′-TATGGCTACAATGATTCTA-3′；bad 上游引物：5′-AGATCCCAGAGTTTGAGCCG-3′，下游引物：5′- CCATCCCTTCGTCGT CCT-3′。PCR擴增體系50 μL，反應(yīng)體系：10×Buffer 5 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，25 mmol/L MgSO43 μL；TaqDNA聚合酶0.3 μL；H2O232.8 μL；引物Sense 1 μL，引物antisense 1 μL，cDNA 5 μL。采用50 μL反應(yīng)體系進行PCR反應(yīng)，嚴(yán)格按照說明書步驟進行操作，體系中共有部分采取整體加樣后分裝法。PCR反應(yīng)條件：48 ℃逆轉(zhuǎn)錄50 min，94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，53.5 ℃退火39 s，70 ℃延伸68 s，70 ℃后延伸7 min，循環(huán)30次。以ERK mRNA、bad mRNA表達條帶與內(nèi)參條帶的灰度比值代表ERK mRNA、bad mRNA的表達水平。

2　結(jié)果

2.1三組血清生化指標(biāo)比較三組血清TG、TC、LDL-C水平比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。無復(fù)流組、再灌注組血清TG、TC、LDL-C水平明顯高于對照組(P均<0.05)；無復(fù)流組血清LDL-C水平明顯高于再灌注組(P<0.05)。見表1。

表1　三組血清生化指標(biāo)比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與再灌注組比較，△P<0.05。

2.2三組單個核細(xì)胞ERK mRNA、bad mRNA表達比較三組ERK mRNA、bad mRNA表達比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。對照組ERK mRNA表達水平高于無復(fù)流組及再灌注組，bad mRNA表達水平低于無復(fù)流組及再灌注組(P均<0.05)。無復(fù)流組ERK mRNA表達水平低于再灌注組，bad mRNA表達水平高于再灌注組(P均<0.05)。見表2。

表2　　　　三組單個核細(xì)胞ERK mRNA、bad mRNA表達水平比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與再灌注組比較，△P<0.05。

2.3STEMI 患者單個核細(xì)胞ERK mRNA與bad mRNA表達的關(guān)系二元線性相關(guān)性分析顯示，ERK mRNA與bad mRNA表達呈負(fù)相關(guān)(r=-0.61，P<0.05)。

3　討論

急診PCI已成為STEMI患者治療的有效手段，在臨床上已得到廣泛應(yīng)用和充分認(rèn)可，超過 70%的 STEMI 患者行 PCI 治療后冠狀動脈血流可恢復(fù)心肌梗死溶栓3 級。大規(guī)模的臨床雙盲試驗顯示，STEMI患者直接行PCI治療及時充分開通IRA，可明顯降低梗死后缺血事件，顯著改善患者預(yù)后。然而，當(dāng)冠狀動脈機械性梗阻解除后，雖管腔達到再通，無殘余狹窄或夾層，但部分患者仍存在前向血流障礙，TIMI血流分級≤2級，心肌灌注不足，即冠狀動脈無復(fù)流。有文獻報道，對STEMI患者行直接 PCI時冠狀動脈無復(fù)流發(fā)生率可高達 32%[3]。有關(guān)冠狀動脈無復(fù)流的發(fā)生機制及其發(fā)生的相關(guān)危險因素研究頗多，但目前尚沒有任何一種機制或明確的危險因素可以完全闡明這一現(xiàn)象。近年來無復(fù)流現(xiàn)象越來越受到臨床重視，目前已成為心血管領(lǐng)域亟待解決的重要課題。

在心血管疾病中的發(fā)病機制中，ERK信號通路有重要作用，主要表現(xiàn)為介導(dǎo)細(xì)胞的生長、分化、凋亡以及細(xì)胞間的功能同步等多種生理功能。其不僅涉及心肌細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、生長等生理過程，還與心肌細(xì)胞的肥厚和凋亡、血管平滑肌細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、血管再狹窄、動脈粥樣硬化斑塊的形成以及急性心肌梗死后心肌重塑等病理生理過程也密切相關(guān)[4～7]。近年來越來越多的動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，ERK信號通路也與PCI術(shù)后無復(fù)流的發(fā)生有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，無復(fù)流組、再灌注組TG、TC、LDL-C水平均高于對照組，提示血脂水平增高尤其是LDL-C水平增高是急性心肌梗死發(fā)病的危險因素。無復(fù)流組LDL-C水平高于再灌注組，提示LDL-C可能進一步影響急診PCI后梗死相關(guān)動脈的心肌灌注。相關(guān)研究亦提示高水平的氧化型LDL-C影響急診PCI患者的心肌灌注，并且可使患者術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)生率升高[8]。LDL-C主要通過刺激巨噬細(xì)胞分泌粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子,進一步活化胞內(nèi)信號分子如ERK、NF-кB等,誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞增殖?；颊哐接绊慐RK mRNA表達，因血脂水平異常導(dǎo)致的病理生理變化參與了動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展,且可能加劇動脈粥樣硬化的病理過程[9]。

本研究中，STEMI患者無復(fù)流組、再灌注組與對照組相比，單個核細(xì)胞ERK mRNA表達水平降低，bad mRNA水平增高。此與國內(nèi)外多項研究[10～12]一致。提示冠狀動脈的急性閉塞導(dǎo)致了ERK信號通路活性的改變和心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生，其機制可能與冠狀動脈粥樣硬化斑塊破裂、血小板激活、炎癥介質(zhì)等刺激導(dǎo)致ERK信號通路抑制有關(guān)。STEMI患者急診PCI術(shù)后無復(fù)流組ERK mRNA表達水平低于再灌注組，提示無復(fù)流組ERK信號通路受到進一步抑制，細(xì)胞凋亡活躍，而高水平的細(xì)胞凋亡進一步引起冬眠心肌增多，細(xì)胞功能失調(diào)，心肌灌注不良。單個核細(xì)胞ERK mRNA與bad mRNA表達水平的相關(guān)性分析提示，隨著ERK mRNA水平的降低，bad mRNA水平逐漸升高，即當(dāng)各種原因?qū)е翬RK信號通路受抑制、活性下降，從而發(fā)生心肌細(xì)胞凋亡和多種炎癥因子釋放，冠狀動脈內(nèi)皮功能下降，微循環(huán)障礙，進一步導(dǎo)致無復(fù)流的發(fā)生。由此可見ERK信號通路及細(xì)胞凋亡是影響急診PCI術(shù)后無復(fù)流的重要因素。相關(guān)研究還證實，ERK信號通路可能通過影響血流動力學(xué)、心肌梗死面積以及CK、LDH的酶學(xué)活性[13～15]，參與心臟保護；而ERK信號通路活性減低可導(dǎo)致其對心臟的保護作用減弱甚至消失，表現(xiàn)為無復(fù)流現(xiàn)象的發(fā)生。ERK信號通路可能是未來防治急診PCI無復(fù)流的一個潛在靶點。

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姚宗芹(E-mail：yaozongqin211@163.com )

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.33.021

R542.2+2

B

1002-266X(2016)33-0060-03

2016-03-17)