高林，朱小天，鄧晶晶，梁宇，吳繼紅

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，國(guó)家果蔬加工工程技術(shù)研究中心，農(nóng)業(yè)部果蔬加工重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，北京100083）

酶解技術(shù)在腰果蛋白制備中的應(yīng)用

高林，朱小天，鄧晶晶，梁宇，吳繼紅*

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，國(guó)家果蔬加工工程技術(shù)研究中心，農(nóng)業(yè)部果蔬加工重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，北京100083）

以剝殼后所得等外果及碎腰果果仁為原料，采用低溫冷榨取油結(jié)合溶劑浸提的方法，獲得二浸腰果餅粕，將其油脂含量降低至2.99%，蛋白含量為34.61%；利用酸沉淀法，結(jié)合α-淀粉酶的作用對(duì)腰果蛋白進(jìn)行提取，探究酶添加量、酶解溫度、酶解pH、酸沉淀pH、料液比對(duì)所得蛋白純度的影響，確定最佳提取條件為：α-淀粉酶添加量為底物量的2.0%、酸沉pH為4.50；選取酶解pH、料液比、溫度3個(gè)因素作為響應(yīng)面優(yōu)化因素進(jìn)一步優(yōu)化了工藝參數(shù)并結(jié)合實(shí)際，最終獲得最佳提取工藝為：pH7.0、溫度60℃、料液比1∶10（g/mL），產(chǎn)品粗蛋白純度可達(dá)到64%。

腰果；植物蛋白；酶解技術(shù)；α-淀粉酶；工藝優(yōu)化

腰果（Anacardium occidentale L.）又名介壽果、雞腰果，為世界著名四大干果之一［1］。腰果仁美味可口，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，深受消費(fèi)者喜愛(ài)［2］。目前市面上比較常見(jiàn)的產(chǎn)品除未經(jīng)加工的生腰果，多以奶香腰果、炭燒腰果、鹽焗腰果等初加工產(chǎn)品為主［3］。隨著人們生活水平的提高與保障腰果產(chǎn)業(yè)的良性發(fā)展，對(duì)等外果及碎果仁的進(jìn)一步利用，進(jìn)行精深加工成為腰果產(chǎn)業(yè)勢(shì)在必行的發(fā)展趨勢(shì)。

腰果仁蛋白質(zhì)含量（約20%）豐富，且蛋白質(zhì)的氨基酸組成種類(lèi)齊全，人體必需氨基酸占氨基酸總含量的31%，約占腰果仁蛋白質(zhì)總量的25%，符合營(yíng)養(yǎng)學(xué)規(guī)定的必需氨基酸需求量與蛋白質(zhì)需求量的比例范圍（20%～37%）［4］。且其氨基酸組成比例與WHO建議的人體氨基酸模式非常接近，優(yōu)于其它堅(jiān)果類(lèi)產(chǎn)品如杏仁、榛子、核桃等［5］。鑒于目前腰果市場(chǎng)產(chǎn)品形式單一、產(chǎn)業(yè)附加值低、腰果蛋白市場(chǎng)空缺，對(duì)其制備工藝的探索可以為延長(zhǎng)腰果深加工產(chǎn)業(yè)鏈并實(shí)現(xiàn)腰果碎果仁資源綜合利用提供理論指導(dǎo)，具有重要意義。

由于腰果脫油后的餅粕中含有與蛋白含量相當(dāng)?shù)牡矸?，?duì)腰果蛋白質(zhì)提取和純化具有一定的影響，將酶解技術(shù)應(yīng)用于腰果蛋白的提取工藝，即選取α-淀粉酶將淀粉水解為可溶解于體系液相中的糊精、低聚糖、麥芽糖及葡萄糖，使其得到有效去除，同時(shí)達(dá)到提高蛋白得率、改善蛋白品質(zhì)的目的。本研究對(duì)原料進(jìn)行低溫冷榨結(jié)合溶劑浸提脫除油脂后，通過(guò)α-淀粉酶作用于蛋白提取工藝，探究酶解技術(shù)應(yīng)用于腰果蛋白制備工藝的最優(yōu)參數(shù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

帶殼腰果：山東萬(wàn)思頓農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)園有限公司非洲科特迪瓦種植基地；腰果仁：由該公司經(jīng)其意大利進(jìn)口自動(dòng)化生產(chǎn)線剝殼后所得產(chǎn)品中的等外果及碎腰果果仁。

α-淀粉酶（酶活力20 000 U/g）：諾維信生物技術(shù)有限公司；石油醚、氫氧化鈉、硼酸、五水合硫酸銅硫酸銨、濃硫酸、濃鹽酸、無(wú)水乙醇、甲基紅等（均為分析純）：購(gòu)買(mǎi)于北京化工廠。

1.2主要儀器與設(shè)備

泰航牌液壓式榨油機(jī)180：鄭州泰航機(jī)械設(shè)備有限公司；PB-10Sartorius pH計(jì)：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；LKTC-CZ水浴恒溫振蕩器：金壇市榮華儀器制造有限公司；BSXT-02索氏提取器：上海比朗儀器有限公司；KDY-9820凱氏定氮儀：KETUO公司；DHG-9053A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；HJ-4A數(shù)顯恒溫多頭磁力攪拌器：金壇市杰瑞爾電器有限公司；BSA822電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司等。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1腰果壓榨餅粕的制備

原料經(jīng)過(guò)清理、除雜等工序后，用一層紗布包裹，采用液壓式榨油機(jī)進(jìn)行冷榨處理，升壓速率為4 MPa/ min，升壓至40 MPa，保持3 min后泄壓排渣，重復(fù)2次后，得到壓榨腰果餅粕［6］。

1.3.2腰果脫脂粉的制備

取腰果壓榨出油后餅粕，按照如下步驟制備腰果脫脂粉［7］：壓榨后餅粕→烘干（置于50℃烘箱中烘干24 h）→萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎→過(guò)篩→低溫浸提除油以1∶5（g/mL）的料液比，向物料中加入石油醚，于常溫下置于磁力攪拌器上攪拌浸提12 h，料液分離，重復(fù)3次，最后常溫脫除溶劑→粉碎并過(guò)篩→獲得腰果脫脂粉。

1.3.3腰果蛋白粉提取工藝

腰果脫脂粉→以一定料液比加入蒸餾水?dāng)嚢枵{(diào)漿→調(diào)節(jié)溶液pH（溶解）→加入α-淀粉酶→恒溫水浴震蕩→沸水浴滅酶→冷卻至常溫→鹽酸調(diào)pH（酸沉淀）→離心→取沉淀→冷凍干燥→腰果粗蛋白粉產(chǎn)品［8］。

1.3.4指標(biāo)測(cè)定

水分含量測(cè)定：GB 5009.3-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分的測(cè)定》；蛋白質(zhì)含量測(cè)定：GB 5009.5-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》；脂肪含量測(cè)定：GB/T 14772-2008《食品中粗脂肪的測(cè)定》。

1.3.5響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化提取工藝

采用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理［9］，結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，探究酶解pH值、料液比、酶解溫度對(duì)蛋白產(chǎn)品純度的影響，因素及水平見(jiàn)表1。

表1　提取響應(yīng)面優(yōu)化因素水平表Table 1Factors and levels in the RSM of protein extraction

2　結(jié)果與分析

2.1不同加工階段腰果蛋白質(zhì)和脂肪的變化

由于新鮮腰果含油量約50%，若企業(yè)采用液壓式壓榨機(jī)進(jìn)行二次冷壓榨，盡管可獲得大部分油脂，但餅粕殘油率仍高達(dá)28%。加之腰果不同于其他含油原料，其淀粉含量較高，冷榨或熱榨過(guò)程中，淀粉對(duì)出油率的提高帶來(lái)一定限制。為了降低多次壓榨的成本，本試驗(yàn)采用溶劑提取的方法進(jìn)一步將脂肪脫除，不同加工階段腰果的蛋白質(zhì)和脂肪含量見(jiàn)表2。

表2　不同加工階段腰果的蛋白質(zhì)和脂肪含量Table 2Protein and oil content of cashew nut in various stages

由表2可知，通過(guò)不同的脫脂工藝，最終獲得油脂含量2.99%的脫脂腰果粉，其蛋白含量約為35%。

2.2酶解單因素對(duì)蛋白提取的影響

2.2.1α-淀粉酶添加量對(duì)蛋白提取的影響

α-淀粉酶添加量對(duì)蛋白提取率的影響如圖1所示，α-淀粉酶添加量為0%～2.0%時(shí)，蛋白產(chǎn)品的純度隨α-淀粉酶添加量的增加而顯著提高，當(dāng)酶量為2.0%時(shí)，純度可達(dá)54%，可能是加入淀粉酶可有效促進(jìn)淀粉發(fā)生水解［10］，同時(shí)影響到細(xì)胞壁的碳骨架，有助于細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、油脂釋出；加入4.0%、6.0%、10.0%、12.0%的α-淀粉酶酶解，產(chǎn)品差異不顯著，且均顯著低于2.0%的提取率，說(shuō)明在2.0%的α-淀粉酶可以充分與底物作用使淀粉水解［11］，最終確定α-淀粉酶添加量為底物量的2.0%。

圖1　α-淀粉酶添加量對(duì)粗蛋白純度的影響Fig.1Effect of enzyme dosage on purity of cashew protein

2.2.2溶液pH值對(duì)蛋白提取的影響

以試驗(yàn)用酶的參考pH值范圍5.5～7.5進(jìn)行單因素試驗(yàn)，隨著酶解pH值的增加，粗蛋白純度先增加，在酶解pH值7.0處達(dá)到最大，之后又下降。蛋白質(zhì)在低于和高于其等電點(diǎn)pH值，帶有凈的正電荷或凈的負(fù)電荷，帶電的氨基酸殘基的靜電推斥和水合作用促進(jìn)蛋白質(zhì)的溶解［12-13］。由于腰果蛋白質(zhì)大多為酸性蛋白質(zhì)［14］，其在酸性溶液（pH值為5.5～6.5）時(shí)溶解度較低，加上過(guò)低的pH值會(huì)抑制酶的活性，而同時(shí)溶液過(guò)高的pH值會(huì)使得酶失活從而降低蛋白的溶解率和淀粉的水解率［15］，且pH值越高蛋白越容易發(fā)生乳化現(xiàn)象，只有在特定的pH值條件下（6.5～7.5）如圖2，才能處于最佳解離狀態(tài)。

圖2　酶解pH值對(duì)粗蛋白純度的影響Fig.2Effect of solution pH on purity of cashew protein

2.2.3提取溫度對(duì)蛋白提取的影響

圖3所示，隨著酶解溫度的增加，蛋白質(zhì)含量先增加，在酶解溫度55℃左右達(dá)到最大，之后又迅速下降。一方面，溫度的升高可以提高反應(yīng)速率，另一方面，溫度促使腰果蛋白親水基團(tuán)展開(kāi)，有助于其溶解度升高［16］；酶解溫度過(guò)高粗蛋白純度下降可能是由于淀粉酶被鈍化［17］，或腰果蛋白的疏水基團(tuán)被過(guò)多的展開(kāi)而使得蛋白質(zhì)分子之間相互聚集，溶解度下降所致［18］。

圖3　酶解溫度對(duì)粗蛋白純度的影響Fig.3Effect of temperature on purity of cashew protein

2.2.4酸沉淀pH值對(duì)蛋白提取的影響

蛋白質(zhì)的溶解性受到料液pH的影響，當(dāng)料液pH值接近蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，主要蛋白質(zhì)將不溶于液相中［19］（但仍有少量的低分子蛋白會(huì)溶解，所以會(huì)有部分蛋白質(zhì)的損失），而可溶性糖類(lèi)、淀粉酶作用后的淀粉水解物、其他可溶性物質(zhì)，都可以溶解于水中［20］，因此可利用酸溶液調(diào)節(jié)料液pH值，將脫脂腰果粉中的可溶性非蛋白質(zhì)成分去除，從而獲得腰果蛋白。由圖4可見(jiàn)，隨著酸沉pH值增大，所獲得的蛋白純度先增大，在pH值4.5～5.0處達(dá)到最大，之后又逐漸下降，說(shuō)明腰果蛋白的等電點(diǎn)應(yīng)在pH值4.5～5.0之間，最后選取酸沉淀pH值為4.5。

圖4　酸沉淀pH值對(duì)粗蛋白純度的影響Fig.4Effect of pH of acid extraction solution on purity of cashew protein

2.2.5料液比對(duì)蛋白提取的影響

料液比對(duì)腰果蛋白提取的影響如圖5所示，隨著提取液體積的增加，所得蛋白的含量逐漸增大，但料液比為1∶10（g/mL）和1∶12（g/mL）時(shí)，沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05），說(shuō)明當(dāng)料液比達(dá)到1∶10（g/mL）時(shí)，物料在提取液中已較為完全分散開(kāi)，蛋白質(zhì)溶解達(dá)到飽和，酶解反應(yīng)充分［21］。由于加水量過(guò)多，酸沉?xí)r上清液中殘留的清蛋白量增加，不容易被離心下來(lái)，造成較高的蛋白的損失［22］，試驗(yàn)操作中就可以看出，加水量更多的料液比組合將不再被繼續(xù)探究。

圖5　料液比對(duì)粗蛋白純度的影響Fig.5Effect of solid-to-liquid ratio on purity of cashew protein

2.3響應(yīng)面優(yōu)化酶解提取蛋白工藝

應(yīng)用Design Expert 8.0軟件進(jìn)行分析，得到二次多項(xiàng)回歸模型為：粗蛋白產(chǎn)品純度/%=+62.69+3.47×A+ 3.52×B+5.08×C-2.00×A×B-1.02×A×C+0.65×B×C-2.51× A2-7.69×B2-4.55×C2。ANOVA分析結(jié)果表明，模型P值小于0.01，而失擬的P值大于0.05，方程的相關(guān)系數(shù)R2=0.996 8，CV值為2.43%共同說(shuō)明了模型的可靠性，能夠較好地反映真實(shí)的試驗(yàn)值［23］。

表3　響應(yīng)面分析法的ANOVA分析Table 3ANOVA of the constructed regression model

表3中顯示，3個(gè)因素的線性、平方項(xiàng)影響均為極顯著，酶解pH和料液比的交互影響顯著，說(shuō)明這些因素對(duì)蛋白提取均有顯著性影響。各因素之間的交互作用進(jìn)行響應(yīng)面分析，繪制響應(yīng)面曲線圖，從等高線圖可以直觀反映出兩個(gè)變量間相互的作用。兩因素之間交互作用的等高線和響應(yīng)面圖見(jiàn)圖6。

如圖6所示，酶解pH值和料液比的等高線呈橢圓形表明，交互作用對(duì)腰果蛋白提取影響顯著，其它因素兩兩交互的等高線圖呈圓形，表明其作用不顯著。通過(guò)軟件分析計(jì)算得出理論最佳提取工藝條件為：pH值7.16、溫度57.77℃、料液比1∶10.13（g/mL）。此時(shí)理論提取率為65.21%。為便于實(shí)際控制，選擇提取pH 7.0、溫度60℃、料液比1∶10（g/mL）進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到的粗蛋白純度為64.10%，與理論值差別不大（1.70%）。

圖6　兩因素之間交互作用的等高線和響應(yīng)面圖Fig.6Contour line and curve surface for the effect of two-factor on extraction efficiency

3　結(jié)論與展望

采用壓榨與溶劑浸提結(jié)合的方法對(duì)剝殼后所得的等外果及碎腰果果仁脫除油脂，獲得腰果脫脂粉，其油脂含量降低至2.99%，蛋白含量達(dá)到34.61%；利用酸沉淀法，結(jié)合α-淀粉酶的作用對(duì)腰果蛋白進(jìn)行提取，探究酶添加量、酶解溫度、酶解pH值、酸沉淀pH值、料液比對(duì)粗蛋白純度的影響，確定最佳提取條件為：α-淀粉酶添加量為底物量的2.0%、酸沉pH值為4.5；選取酶解pH值、料液比、溫度3個(gè)因素作為響應(yīng)面優(yōu)化因素進(jìn)一步優(yōu)化了工藝參數(shù)，pH值7.0、溫度60℃、料液比1∶10（g/mL），產(chǎn)品粗蛋白純度可達(dá)到64%。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)腰果蛋白的提取研究，旨在為延長(zhǎng)腰果深加工產(chǎn)業(yè)鏈并實(shí)現(xiàn)資源綜合利用，開(kāi)發(fā)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性好、工藝簡(jiǎn)單且有利于工業(yè)化生產(chǎn)的高附加值腰果蛋白產(chǎn)品提供理論指導(dǎo)，今后還將繼續(xù)對(duì)腰果蛋白粉沖調(diào)性、功能品質(zhì)等做進(jìn)一步探究。

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The Application of Aqueous Enzymatic Technology on Preparation of Cashew Nut Protein

GAO Lin，ZHU Xiao-tian，DENG Jing-jing，LIANG Yu，WU Ji-hong*
（College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agriculture University，National Engineering Research Center for Fruits and Vegetables Processing，Key Laboratory of Ministry of Agriculture Vegetables，Beijing 100083，China）

The cold-pressed technique and low temperature was used to solvent extraction technology to remove oil.Then，the defatted cashew nut（contains 2.99%oil and 34.61%protein）was used to extract crude protein by aqueous enzymatic method.During the process of its extraction，the effect of the enzyme dosage，extracting solution pH，extraction temperature，solid-to-liquid ratio and the acid precipitator pH on the purity of protein were investigated using single factor experiment and response surface experiment，the optimum conditions were obtained as follows：the 2.0%enzyme dosage，7.0 for the extracting solution pH，60°C of extraction temperature，1∶10（g/mL）of solid-to-liquid ratio and 4.5 for the acid precipitator pH，which will provide theoretical direction for the development of cashew nut products.

cashewnut；vegetableprotein；aqueousenzymatictechnology；alphaamylase；processoptimization

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.17.013

2015-10-13

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專(zhuān)項(xiàng)“優(yōu)質(zhì)高效富硒農(nóng)產(chǎn)品關(guān)鍵技術(shù)研究與示范”（201303106）

高林（1988—），女（漢），博士研究生，主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工研究。

吳繼紅（1964—），女（漢），教授，博士生導(dǎo)師，主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)與理論研究。