北京市射線應(yīng)用研究中心（101113）李娜 陳堅(jiān) 燕瑾 郝松松

近年來，食品安全事件頻發(fā)，其中微生物超標(biāo)造成人身傷害在其中占很大比例，在排除產(chǎn)品自身因素影響之外，包裝材料對(duì)于產(chǎn)品的影響是最直接的?，F(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)GB19741：2005針對(duì)《液體食品包裝用塑料復(fù)合膜、袋》類產(chǎn)品日常微生物檢驗(yàn)引用國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T4789.2菌落總數(shù)測(cè)定方法。但在微生物日常檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，此方法對(duì)于液體食品包裝用塑料復(fù)合袋適用性并不強(qiáng)。

本研究選取了三種不同的微生物檢驗(yàn)方法，對(duì)同一廠家生產(chǎn)的不同規(guī)格的液體食品包裝用塑料復(fù)合袋進(jìn)行為期1年的生物負(fù)載量的對(duì)比實(shí)驗(yàn)，同時(shí)每種方法選取兩種洗脫液進(jìn)行微生物洗脫。

通過檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)灌裝薄膜過濾法相較于棉拭子涂抹及稀釋直接傾注法更能有效地將液體食品包裝用塑料復(fù)合袋上的微生物洗脫下來，降低了微生物負(fù)載的檢出限，提高了檢出率。洗脫液的不同種類，對(duì)檢出結(jié)果未有顯著差異。一年四季不同的溫、濕度生產(chǎn)條件下生產(chǎn)的產(chǎn)品，產(chǎn)品生物負(fù)載未顯現(xiàn)季節(jié)性差異。

1 實(shí)驗(yàn)材料和實(shí)驗(yàn)方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 樣品 某一生產(chǎn)廠家液體食品包裝用塑料復(fù)合袋：8L、20L、50L、220L四種規(guī)格。

1.1.2 儀器 ①冰箱（0℃～4℃）：海爾電器提供。②恒溫培養(yǎng)箱（32℃、24℃）：上海一恒科學(xué)儀器有限公司提供。③電子天平：0g～1000g，精確至0.1g。上海精密科學(xué)儀器有限公司提供。④座式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械生產(chǎn)廠提供。⑤電熱鼓風(fēng)干燥箱（10℃～250℃）：上海一恒科學(xué)儀器有限公司提供。

1.1.3 試劑 ①平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基：北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司提供。②PH7.0滅菌氯化鈉蛋白胨緩沖溶液：北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司提供。③滅菌蒸餾水。④大腸埃希菌 CMCC（B）44 102：杭州微球生物技術(shù)有限公司提供。⑤金黃色葡萄球菌 CMCC（B）26 003：杭州微球生物技術(shù)有限公司提供。⑥枯草芽孢桿菌：CMCC（B）63 501：杭州微球生物技術(shù)有限公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 方法一：GB/T4789.2食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定。

1.2.1.1 剪取液體食品包裝用塑料復(fù)合袋內(nèi)雙層透明膜25g分別置盛有225ml生理鹽水及氯化鈉蛋白胨緩沖溶液的無菌三角瓶?jī)?nèi)，置于搖床震蕩30分鐘，制成1：10的樣品勻液。

1.2.1.2 選擇1∶10、1∶100、及1∶1000比例稀釋液，吸取1ml至平皿中，及時(shí)將15mL～20mL冷卻至46℃的平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基傾注平皿，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使其混合均勻。35℃培養(yǎng)2～4天，每天觀察。

1.2.2 方法二：2010版《中華人民共和國藥典》附錄Ⅻ G微生物限度檢查法（薄膜過濾法）。

1.2.2.1 以無菌操作，分別將150ml、250ml、450ml、950ml滅菌生理鹽水及滅菌氯化鈉蛋白胨緩沖溶液，從袋口處加入到8L、20L、50L、220L不同規(guī)格液體食品包裝用塑料復(fù)合袋內(nèi)，震蕩30分鐘備用。

1.2.2.2 以無菌操作，用滅菌孔徑0.45μm，直徑50mm的微孔濾膜過濾浸泡實(shí)驗(yàn)樣品的緩沖液，并用滅菌蛋白胨緩沖溶液沖洗濾膜，將濾膜放到平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。35℃培養(yǎng)2～4天，每天觀察。

1.2.3 方法三：棉拭子擦拭法（10cm×10cm）。

1.2.3.1 以無菌操作，剪開液體食品包裝用塑料復(fù)合袋，將滅菌10cm×10cm規(guī)格板貼在最內(nèi)層膜上，在框內(nèi)用滅菌棉拭子擦拭，裝入100ml滅菌生理鹽水及滅菌氯化鈉蛋白胨緩沖溶液中，震蕩混勻。

1.2.3.2 以無菌操作，用滅菌孔徑0.45微米，直徑50毫米的微孔濾膜過濾浸泡棉拭子的緩沖液，并用滅菌蛋白胨緩沖溶液沖洗濾膜，將濾膜放到平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。35℃培養(yǎng)2～4天，每天觀察。

附表1 四種規(guī)格液體食品包裝用塑料復(fù)合袋用三種方法，兩種不同的洗脫液進(jìn)行微生物洗脫，在1、2季度培養(yǎng)結(jié)果。

附表2 四種規(guī)格液體食品包裝用塑料復(fù)合袋用三種方法，兩種不同的洗脫液進(jìn)行微生物洗脫，在3、4季度培養(yǎng)結(jié)果。

附表3 同種規(guī)格體食品包裝用塑料復(fù)合袋包裝不同產(chǎn)品反復(fù)洗脫后菌落總數(shù)結(jié)果

1.2.4 反復(fù)洗脫實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 取5件220L液體食品包裝用塑料復(fù)合袋，分別以無菌操作，從注水口分別將定量菌株（50～100cfu）加入液體食品包裝用塑料復(fù)合袋內(nèi)，干燥。

1.2.4.2 以無菌操作，將950ml滅菌生理鹽水從注水口分別加入液體食品包裝用塑料復(fù)合袋中，充分震蕩浸泡產(chǎn)品30分鐘后，用滅菌孔徑0.45微米，直徑50毫米的微孔濾膜過濾浸泡實(shí)驗(yàn)樣品的緩沖液，并用滅菌蛋白胨緩沖溶液沖洗濾膜，將濾膜放到平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。35℃培養(yǎng)2～4天，每天觀察。

1.2.4.3 將這5件產(chǎn)品反復(fù)以1.2.4.1的方法操作五次。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

液體食品包裝用塑料復(fù)合袋4種規(guī)格：8L、20L、50L、220L，按月份，分季度用三種方法，兩種不同的洗脫液進(jìn)行微生物洗脫并培養(yǎng)，結(jié)果如下。第一、二季度結(jié)果（見附表1）。第三、四季度結(jié)果（見附表2）。

2.1 結(jié)果分析 一年當(dāng)中的四季，在不同溫、濕度環(huán)境下生產(chǎn)的液體食品包裝用塑料復(fù)合袋，微生物檢驗(yàn)三種方法中，方法一使用GB/T4789.2中稀釋直接傾注法，其結(jié)果大都處于下限即＜10cfu/g，全年只有兩次的菌落總數(shù)結(jié)果為10cfu/g；方法二使用《中華人民共和國藥典》中提到的薄膜過濾操作方法，結(jié)果從＜1cfu/件到196cfu/件不等；方法三使用GB/T19973.1中提到的棉拭子擦拭的方法，所出結(jié)果大都為＜1cfu/100cm2，全年只有一次的菌落總數(shù)結(jié)果為1cfu/100cm2。三種方法中，每月同樣檢測(cè)方法對(duì)比發(fā)現(xiàn)，結(jié)果差異性不大。

2.2 反復(fù)洗脫結(jié)果（方法二），見附表3。

2.2.1 結(jié)果分析 通過反復(fù)洗脫實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，校正因子為1.32，平均回收率為75.52%，大于50%，符合標(biāo)準(zhǔn)要求。由此證明薄膜過濾方法適用于液體食品包裝用塑料復(fù)合袋的微生物洗脫。實(shí)際檢出率進(jìn)一步提高。

3 結(jié)果討論

3.1 對(duì)于結(jié)果數(shù)據(jù)的討論

3.1.1 歷時(shí)一年的檢測(cè)，對(duì)于上述三種不同的微生物檢驗(yàn)方法，其中方法一：GB/T4789.2是標(biāo)準(zhǔn)GB19741-2005液體食品包裝用塑料復(fù)合袋對(duì)于微生物檢驗(yàn)要求的規(guī)定方法，其中要求檢驗(yàn)“與食品接觸表面的菌落總數(shù)”，實(shí)際稱取的樣品包含與食品接觸表面和與非食品接觸表面，檢驗(yàn)結(jié)果并非與食品接觸表面的菌落總數(shù)，而是與食品接觸表面和與非食品接觸表面兩面的菌落總數(shù)，故與GB19741-2005提出的標(biāo)準(zhǔn)要求不相符。由于所剪面積有限，對(duì)于規(guī)格較大的液體食品包裝用塑料復(fù)合袋的代表性并不充分，以及其稀釋的方法，所有檢出下限的報(bào)告值均為＜10cfu/g，如果樣品中菌落總數(shù)含量在10cfu以下，或者是由于微生物分布不均，所剪部分恰巧沒有微生物存在，都會(huì)導(dǎo)致結(jié)果不能真實(shí)反映產(chǎn)品本身微生物含量。

3.1.2 方法二：《中華人民共和國藥典》中以及GB19973.1中提到對(duì)于樣品的處理可以使用薄膜過濾方法，雖然此方法大部分應(yīng)用于藥品以及醫(yī)療用品，但在長期的工作積累下發(fā)現(xiàn)此方法同樣適用于液體食品包裝用塑料復(fù)合袋以及其它封閉類的食品包裝袋，通過注水口注入洗脫液，封閉注水口反復(fù)震蕩洗脫30分鐘，使洗脫液充分接觸液體食品包裝用塑料復(fù)合袋與食品接觸面，所洗脫下的微生物系整件產(chǎn)品的菌落總數(shù)，相較于“個(gè)/cm2”更有說服力。

3.1.3 方法三：GB19973.1中提到對(duì)于樣品的處理可以使用棉拭子擦拭的方法，通過使用10cm×10cm規(guī)格板貼在與食品接觸面上，在框內(nèi)用滅菌棉拭子擦拭，其報(bào)告結(jié)果雖然符合GB19741-2005中報(bào)告的要求，但是由于擦拭面積小，對(duì)于規(guī)格較大的液體食品包裝用塑料復(fù)合袋代表性不強(qiáng)，或者是由于微生物分布不均，所擦拭部分恰巧沒有微生物存在，都會(huì)導(dǎo)致結(jié)果不能真實(shí)反映產(chǎn)品本身微生物含量，以及有些收集到的微生物可能會(huì)被拭子本身組織所吸附從而不會(huì)檢測(cè)到，所以此方法不能真實(shí)的反映出產(chǎn)品上的微生物含量。

3.1.4 在標(biāo)準(zhǔn)GB19741-2005中要求最終細(xì)菌報(bào)告的單位為“個(gè)/cm2，是不符合的。世界衛(wèi)生組織和新的微生物檢驗(yàn)國家及國際標(biāo)準(zhǔn)中均建議使用“cfu”代表菌落而不是“個(gè)”。建議在GB19741—2005標(biāo)準(zhǔn)修訂時(shí)加以修改。

3.1.5 在使用不同方法對(duì)液體食品包裝用塑料復(fù)合袋微生物洗脫過程中，使用兩種不同的洗脫液，發(fā)現(xiàn)其結(jié)果差異性不大，故此類產(chǎn)品的微生物檢驗(yàn)洗脫液種類對(duì)其的影響可以排除。

3.1.6 歷時(shí)一年的檢測(cè)中，菌落總數(shù)檢出量不因溫度的高低變化發(fā)生顯著地變化，故此可以排除溫度此類產(chǎn)品微生物洗脫的影響。

4 結(jié)論

本課題對(duì)于液體食品包裝用塑料復(fù)合袋微生物檢驗(yàn)，通過對(duì)四種不同規(guī)格，兩種不同的洗脫液，三種不同的洗脫方法，歷時(shí)一年的監(jiān)測(cè)，得出：首先，液體食品包裝用塑料復(fù)合袋在溫、濕度不同的各個(gè)季節(jié)，其菌落總數(shù)測(cè)量結(jié)果不會(huì)發(fā)生顯著地變化；其次，液體食品包裝用塑料復(fù)合袋的菌落總數(shù)測(cè)量結(jié)果不受洗脫液種類影響；第三，采取方法二（灌裝后薄膜過濾法）更能有效地將液體食品包裝用塑料復(fù)合袋與食品接觸面上的微生物洗脫下來，由于其檢出限低，檢出率高，其結(jié)果能更真實(shí)的反映出產(chǎn)品上微生物的含量。

在標(biāo)準(zhǔn)GB19741-2005中菌落總數(shù)測(cè)定規(guī)定的方法相較處于劣勢(shì)，且在標(biāo)準(zhǔn)GB19741-2005中要求最終細(xì)菌報(bào)告的單位為“個(gè)/cm2，與世界衛(wèi)生組織和新的微生物檢驗(yàn)國家及國際標(biāo)準(zhǔn)中均建議使用“cfu”代表菌落而不是“個(gè)”， 是不符合的。建議在GB19741—2005標(biāo)準(zhǔn)修訂時(shí)參考以上結(jié)論。