王瑞倉　劉艷芬　楊潔　周潔　李杰　郝洪嶺

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·論著·

IL-23誘導(dǎo)人外周血單個核細(xì)胞增殖及其體外殺傷MUTZ-1細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究

王瑞倉劉艷芬楊潔周潔李杰郝洪嶺

IL-23；MUTZ-1細(xì)胞；殺瘤活性

骨髓增生異常綜合征(MDS)是一種起源于造血干細(xì)胞的克隆性疾病，以病態(tài)或無效造血、一系或多系血細(xì)胞質(zhì)/量異常、易進(jìn)展為急性髓系白血病為特征，患者生存期短[1,2]。目前臨床治療MDS主要采用化療、靶向治療、誘導(dǎo)分化治療等，但療效均不甚滿意，原因主要在于這些方法不能殺滅所有腫瘤細(xì)胞，患者極易復(fù)發(fā)[3]。近年來，隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展和對機(jī)體免疫功能認(rèn)識的不斷深入，免疫療法已經(jīng)成為治療血液腫瘤的重要手段。研究顯示，IL-12是調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫應(yīng)答的關(guān)鍵因子，能夠激活T細(xì)胞、NK細(xì)胞，并促進(jìn)IFN-γ分泌，且無嚴(yán)重毒副反應(yīng)，其中IL-23是IL-12家族的重要成員，主要發(fā)揮抗腫瘤及抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用[4]。然而，有關(guān)IL-23應(yīng)用于MDS治療的報(bào)道尚少。本研究旨在探討IL-23誘導(dǎo)正常人外周血單個核細(xì)胞(PBMNC)對MDS細(xì)胞系MUTZ-1的殺瘤效應(yīng)及作用機(jī)制，以期為MDS的免疫治療提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1藥物與試劑MUTZ-1細(xì)胞購自北京協(xié)和細(xì)胞庫；重組人IL-23購自美國R&D公司；人淋巴細(xì)胞分離液購自武漢博士德生物工程有限公司；RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司；IFN-γ、TNF-α、TGF-β、顆粒酶A、顆粒酶B、穿孔素一抗購自美國Invitrogen公司；PrimeScriptTM RT Master Mix(Perfect Real Time)反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本Takara公司；Trizol、實(shí)時熒光定量試劑盒購自美國Promega公司；細(xì)胞裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2儀器倒置顯微鏡購自日本Nicon公司；Chemi DocTM XRS+化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)購自美國Biorad公司；7300型Real time-PCR擴(kuò)增儀購自美國ABI公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1MUTZ-1的培養(yǎng):MUTZ-1加入含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)MUTZ-1細(xì)胞，每2～3天傳代一次。

1.3.2PBMNC的分離、培養(yǎng)及分組:采集健康人清晨空腹靜脈血5 ml，肝素抗凝，PBS 1∶1稀釋，采用Ficoll密度梯度離心法分離得到PBMNC，加入含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2、飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)。細(xì)胞分4組：陰性對照組(PBMNC培養(yǎng)基中未加IL-23)，3個濃度IL-23組(PBMNC培養(yǎng)基中分別加入2、10、50 ng/ml IL-23)，體外誘導(dǎo)72 h，并與MUTZ-1共培養(yǎng)。

1.3.4PBMNC殺瘤活性的測定:采用LDH釋放法測定。取MUTZ-1細(xì)胞為靶細(xì)胞，加入含3%牛白蛋白無酚紅的RPMI-1640 培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104/ml，PBMNC為效應(yīng)細(xì)胞，按照20∶1效靶比將PBMNC和MUTZ-1細(xì)胞混合，同時設(shè)效應(yīng)細(xì)胞、靶細(xì)胞自然釋放組(50 μl效應(yīng)細(xì)胞/靶細(xì)胞中加入50 μl RPMI 1640培養(yǎng)基)、靶細(xì)胞最大釋放組(50 μl靶細(xì)胞中加入50 μl 1%NP-40)。于酶標(biāo)儀490 nm波長處測D值，按照以下公式計(jì)算PBMNC殺瘤活性：殺傷率(%)=[試驗(yàn)組D值-靶細(xì)胞自然釋放組D值]/[靶細(xì)胞最大釋放孔D值-靶細(xì)胞自然釋放孔D值]×100%。

1.3.5Real time-PCR:Trizol提取細(xì)胞總RNA，按照試劑盒說明書加樣進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，ABI 7300型熒光定量PCR儀擴(kuò)增。引物序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。用儀器自帶的分析軟件得到各樣本、各基因擴(kuò)增的Ct值，以GAPDH為內(nèi)參照基因，目的基因表達(dá)相對值RQ=2-ΔΔCt。見表1。

表1　Real time-PCR引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物長度

1.3.6Western-blot:提取細(xì)胞總蛋白，半干法電泳轉(zhuǎn)移至PVDF膜，10%脫脂奶粉封閉2 h。依次加入特異性一抗和辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG，化學(xué)發(fā)光法顯色、定影。用UVP軟件掃描測定蛋白條帶IOD值，GAPDH作為內(nèi)參照，以目的蛋白與GAPDH吸光度值的比值表示目的蛋白相對表達(dá)水平。

2　結(jié)果

2.1PBMNC細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及增殖情況IL-23組于培養(yǎng)第3天開始增殖，隨著培養(yǎng)時間延長，細(xì)胞體積進(jìn)一步變大，呈圓形。之后進(jìn)入對數(shù)生長期，第7天細(xì)胞數(shù)量達(dá)峰值，其中50 ng/ml IL-23組PBMNC細(xì)胞數(shù)量較10 ng/ml IL-23組增多，后者較2 ng/ml IL-23組增多，3組增殖速度均大于陰性對照組(P<0.05)。見表2。

表2　4組不同時間增殖倍數(shù)比較　±s

注：與陰性對照組比較,*P<0.05;與2 ng/ml IL-23組比較,#P<0.05;與10 ng/ml IL-23組比較,△P<0.05

表34組PBMNC細(xì)胞表型比較

組別CD+3CD+4CD+8CD+56陰性對照組 1d69.12±7.2238.65±2.1522.65±3.411.24±0.15 7d10.46±1.348.89±1.2019.11±2.722.98±0.412ng/mlIL-23組 1d67.79±6.1236.86±2.0821.68±3.251.08±0.12 7d23.21±2.26*19.21±1.26*13.70±2.02*15.76±1.62*10ng/mlIL-23組 1d70.51±7.0240.42±3.1220.87±1.251.23±0.12 7d50.75±7.83*#30.75±1.83*#9.56±2.62*#26.47±2.02*#50ng/mlIL-23組 1d68.88±6.5638.90±2.4521.47±3.231.21±0.12 7d77.02±7.77*#△52.02±1.77*#△4.36±0.39*#△38.56±2.12*#△

注：與陰性對照組比較,*P<0.05;與2 ng/ml IL-23組比較,#P<0.05;與10 ng/ml IL-23組比較,△P<0.05

2.34組PBMNC對MUTZ-1細(xì)胞殺瘤活性比較隨著培養(yǎng)時間延長，4組PBMNC對MUTZ-1細(xì)胞殺瘤活性明顯增強(qiáng)，其中50 ng/ml IL-23組PBMNC對MUTZ-1細(xì)胞殺傷活性較10 ng/ml IL-23組增強(qiáng)，后者較2 ng/ml IL-23組增強(qiáng)，3組PBMNC對MUTZ-1細(xì)胞殺傷活性均大于陰性對照組(P<0.05)。見表4。

表44組PBMNC對MUTZ-1細(xì)胞殺瘤活性比較

組別殺瘤活性(%)1357陰性對照組7.12±0.687.00±0.456.91±0.436.80±0.382ng/mlIL-23組7.25±0.7014.11±1.68*17.75±2.16*20.53±2.27*10ng/mlIL-23組7.27±0.6619.87±2.17*#26.88±2.92*#31.58±3.12*#50ng/mlIL-23組7.24±0.8024.69±2.56*△31.60±3.24*△40.05±3.70*△

注：與陰性對照組比較,*P<0.05;與2 ng/ml IL-23組比較,#P<0.05;與10 ng/ml IL-23組比較,△P<0.05

2.44組PBMNC細(xì)胞上清液中IFN-γ、TNF-α、TGF-β、顆粒酶A、顆粒酶B、穿孔素mRNA和蛋白表達(dá)比較4組PBMNC細(xì)胞上清液中IFN-γ、TNF-α、TGF-β、顆粒酶A、顆粒酶B、穿孔素mRNA和蛋白表達(dá)明顯增加，其中50 ng/ml IL-23組IFN-γ、TNF-α、TGF-β、顆粒酶A、顆粒酶B、穿孔素mRNA和蛋白表達(dá)較10 ng/ml IL-23組增多，后者較2 ng/ml IL-23組增多，3組IFN-γ、TNF-α、TGF-β、顆粒酶A、顆粒酶B、穿孔素mRNA和蛋白表達(dá)均大于陰性對照組(P<0.05)。見表5、6。

表54組PBMNC細(xì)胞上清液中IFN-γ、TNF-α、TGF-β、顆粒酶A、顆粒酶B、穿孔素mRNA表達(dá)比較

組別IFN-γmRNATNF-αmRNATGF-βmRNA顆粒酶AmRNA顆粒酶BmRNA穿孔素mRNA陰性對照組0.78±0.110.53±0.060.60±0.510.43±0.040.39±0.030.40±0.052ng/mlIL-23組1.39±0.20*1.20±0.13*1.32±0.14*0.98±0.10*0.78±0.11*0.85±0.12*10ng/mlIL-23組2.23±0.41*#1.97±0.35*#2.15±0.36*#1.96±0.23*#1.88±0.17*#1.70±0.19*#50ng/mlIL-23組3.19±0.45*#△2.91±0.42*#△3.10±0.42*#△2.90±0.37*#△2.76±0.35*#△2.98±0.26*#△

注：與陰性對照組比較,*P<0.05;與2 ng/ml IL-23組比較,#P<0.05;與10 ng/ml IL-23組比較,△P<0.05

3　討論

表64組PBMNC細(xì)胞上清液中IFN-γ、TNF-α、TGF-β、顆粒酶A、顆粒酶B、穿孔素蛋白表達(dá)比較

組別IFN-γ蛋白TNF-α蛋白TGF-β蛋白顆粒酶A蛋白顆粒酶B蛋白穿孔素蛋白陰性對照組0.62±0.080.42±0.050.43±0.360.36±0.030.21±0.020.30±0.032ng/mlIL-23組1.26±0.16*1.02±0.07*1.01±0.03*0.67±0.07*0.60±0.07*0.70±0.08*10ng/mlIL-23組1.88±0.36*#1.77±0.25*#1.77±0.32*#1.75±0.21*#1.67±0.11*#1.49±0.12*#50ng/mlIL-23組2.97±0.39*#△2.69±0.35*#△2.86±0.35*#△2.71±0.26*#△2.53±0.24*#△2.81±0.23*#△

注：與陰性對照組比較,*P<0.05;與2 ng/ml IL-23組比較,#P<0.05;與10 ng/ml IL-23組比較,△P<0.05

T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞活化后可釋放IFN-γ、TNF-α等細(xì)胞因子，不僅能夠增強(qiáng)NK細(xì)胞活性、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，還能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡從而發(fā)揮抗腫瘤作用。此外，T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞在介導(dǎo)細(xì)胞毒過程中通過胞吐作用釋放顆粒內(nèi)容物直接損傷靶細(xì)胞，穿孔素和顆粒酶是其中發(fā)揮主要作用的蛋白質(zhì)[15,16]。穿孔素能夠在靶細(xì)胞膜上聚合形成孔道，以穿孔方式造成靶細(xì)胞的裂解和損傷。顆粒酶是存在于細(xì)胞漿中的絲氨酸蛋白酶，能夠通過激活capase級聯(lián)反應(yīng)、分泌IFN-γ、TNF-α等炎癥因子調(diào)控機(jī)體免疫功能，進(jìn)而裂解細(xì)胞DNA。本研究通過檢測PBMNC殺瘤活性并對PBMNC細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ、TNF-α、TGF-β、顆粒酶A、顆粒酶B、穿孔素mRNA和蛋白表達(dá)進(jìn)行定量檢測，結(jié)果顯示，IL-23組IFN-γ、TNF-α、TGF-β、顆粒酶A、顆粒酶B、穿孔素mRNA和蛋白表達(dá)較陰性對照組明顯增加，說明IL-23與PBMNC細(xì)胞共培養(yǎng)能夠明顯促進(jìn)PBMNC細(xì)胞活化，同時細(xì)胞殺傷力明顯增強(qiáng)。

總之，IL-23體外誘導(dǎo)PBMNC能夠明顯增強(qiáng)PBMNC對MUTZ-1細(xì)胞的殺傷活性，其機(jī)制主要通過促使T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞增殖和活化、釋放IFN-γ、TNF-α、TGF-β、顆粒酶A、顆粒酶B、穿孔素來實(shí)現(xiàn)。本研究不僅加深了我們對IL-23誘導(dǎo)PBMNC細(xì)胞擴(kuò)增后細(xì)胞功能狀態(tài)的認(rèn)識，另外對骨髓增生異常綜合征的臨床治療具有一定參考價(jià)值。利用IL-23進(jìn)行腫瘤生物治療有助于增強(qiáng)骨髓增生異常綜合征患者免疫功能，從而抑制腫瘤細(xì)胞免疫逃逸。

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Experimental study on the effects of IL-23 in inducing proliferation of human peripheral blood mononuclear cell and in killing MUTZ-1 cells in vitro

WANGRuicang*,LIUYanfen,YANGJie*,etal.

*DepartmentofHematology,HebeiProvincialPeople’sHospital,Shijiazhuang050051,China

IL-23；MUTZ-1 cells; killing tumor activity

10.3969/j.issn.1002-7386.2016.20.003

050051石家莊市，河北省人民醫(yī)院血液科(王瑞倉、楊潔、周潔、李杰、郝洪嶺)；河北省唐山市人民醫(yī)院血液科(劉艷芬)

郝洪嶺，050051石家莊市，河北省人民醫(yī)院血液科；

E-mail：h0707@163com

R 551.31

A

1002-7386(2016)20-3055-05

2016-04-11)

項(xiàng)目來源：河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題計(jì)劃(編號：ZD20140444)