吳新濤　石晶　高樂才　吳新峰　吳文元　龐石磊

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·論著·

柚皮素對(duì)氧化應(yīng)激所致成骨細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制研究

吳新濤石晶高樂才吳新峰吳文元龐石磊

目的觀察柚皮素對(duì)氧化應(yīng)激導(dǎo)致的成骨細(xì)胞凋亡的影響，并探討其機(jī)制。方法體外分離培養(yǎng)成骨細(xì)胞，細(xì)胞分空白對(duì)照組、單純H2O2作用組、H2O2+0.1 μmol/L柚皮素組、H2O2+1 μmol/L柚皮素組、H2O2+10 μmol/L柚皮素組。MTT法檢測成骨細(xì)胞活力；流式細(xì)胞術(shù)檢測成骨細(xì)胞凋亡率；熒光顯微鏡觀察活性氧(ROS)含量；比色法檢測丙二醛(MDA)含量；Real time-PCR 和Western-blot檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3表達(dá)情況。結(jié)果與空白對(duì)照組比較，單純H2O2處理組細(xì)胞活性明顯降低，凋亡率及ROS、MDA含量明顯增加；同時(shí)Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，Bax、Caspase-3 mRNA和蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)。 與單純H2O2處理組比較，柚皮素預(yù)處理24 h能夠明顯增強(qiáng)細(xì)胞活性，降低細(xì)胞凋亡率及ROS、MDA含量，上調(diào)Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)，下調(diào)Bax、Caspase-3 mRNA和蛋白表達(dá)，呈劑量依賴性(P<0.05)。結(jié)論柚皮素在氧化應(yīng)激條件下能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，抑制成骨細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與上調(diào)Bcl-2表達(dá)，下調(diào)Bax、Caspase-3表達(dá)有關(guān)。

柚皮素；成骨細(xì)胞；氧化應(yīng)激；凋亡

近年來，骨質(zhì)疏松癥發(fā)病率逐漸升高，已經(jīng)成為影響人們生活質(zhì)量的主要疾病之一[1]。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為雌激素缺乏是骨質(zhì)疏松癥發(fā)病的主要原因，然而補(bǔ)充雌激素并未明顯改善骨質(zhì)疏松癥。越來越多的研究提出，氧化應(yīng)激在骨質(zhì)疏松癥發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[2]。中草藥柚皮苷屬黃酮類物質(zhì)，具有抗氧化、保護(hù)神經(jīng)、治療骨質(zhì)疏松癥等藥理作用。柚皮素是柚皮苷的主要代謝產(chǎn)物，體外實(shí)驗(yàn)表明柚皮素對(duì)大鼠成骨細(xì)胞促骨形成活性優(yōu)于柚皮苷[3,4]。然而，柚皮素促骨形成的具體機(jī)制尚不清楚。本研究利用體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞，觀察柚皮素對(duì)成骨細(xì)胞增殖、凋亡、活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)含量及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3表達(dá)的影響，旨在闡明柚皮素防治骨質(zhì)疏松癥的具體分子機(jī)制。

1　材料與方法

1.1材料DMEM-H培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司；兔抗鼠 Bcl-2、Bax、Caspase-3、β-actin多克隆抗體購自美國Santa Cruz 公司；細(xì)胞裂解液、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體、BCA蛋白濃度測定試劑盒、高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；Prime Script TM RT Master Mix(Perfect Real Time)反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本Takara公司；Trizol、實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒購自美國Promega公司。

1.2儀器Chemi DocTM XRS+化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(Biorad公司)；頭一回7300 型Real time-PCR擴(kuò)增儀(美國ABI公司)。

1.3成骨細(xì)胞培養(yǎng)參照相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道體外分離培養(yǎng)成骨細(xì)胞[5]。新生24 h大鼠處死后，75%乙醇浸泡10 min，無菌手術(shù)揭去頭皮，分離顱蓋骨，去除表面結(jié)締組織，PBS清洗2～3次后置于無血清DMEM培養(yǎng)基中，組織剪剪碎顱蓋骨，加入0.25%胰蛋白酶預(yù)消化30 min，加入含血清培養(yǎng)基終止消化。加入0.1% Ⅰ型膠原酶消化45 min，加入預(yù)冷PBS 終止消化。過濾后的消化液1 000 r/min 離心10 min，棄上清，培養(yǎng)液沖洗細(xì)胞，在37℃、5% CO2及飽和濕度條件下，將細(xì)胞懸液接種于含10%小牛血清的DMEM-H培養(yǎng)基中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至80%融合時(shí)根據(jù)需要進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測。

1.4觀察指標(biāo)及方法

1.4.1MTT法檢測細(xì)胞活力:細(xì)胞消化后將懸液接種于96孔板中，調(diào)整細(xì)胞密度為1×104/孔。細(xì)胞分5組：空白對(duì)照組、單純H2O2作用組(300 μmol/L)、H2O2+0.1 μmol/L柚皮素組、H2O2+1 μmol/L柚皮素組、H2O2+10 μmol/L柚皮素組。5組細(xì)胞均置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。棄培養(yǎng)液，各組于第1，2，3，4天后每孔加入5 mg/L MTT，37℃孵育4 h，棄上清，每孔加入150 μl DMSO，于570 nm波長處測定吸光度值。

1.4.2流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡:細(xì)胞以1×105/孔接種于24孔板，給藥1、2、3、4 d后培養(yǎng)48 h，胰酶消化細(xì)胞，用標(biāo)記熒光素FITC的Annexin V和PI染色，1 h 內(nèi)檢測細(xì)胞凋亡率。

1.4.3熒光顯微鏡觀察細(xì)胞ROS含量:細(xì)胞以5×104/孔的密度接種于放有玻片(多聚賴氨酸包被過夜)的24孔板中，給藥后培養(yǎng)4 h，加入0.5 mmol/L MPP+培養(yǎng)48 h，之后加入10 μmol/L DCFH-DA，37℃培養(yǎng)箱中孵育20 min。用無血清的DMEM-H培養(yǎng)基洗3次。熒光顯微鏡拍照并測定熒光強(qiáng)度。

1.4.4比色法測定細(xì)胞MDA含量:細(xì)胞以2×105/孔的密度接種于6孔板中，給藥后預(yù)培養(yǎng)4 h，加入 0.5 mmol/L MPP+培養(yǎng)48 h。按照MDA檢測試劑盒說明書操作，比色法測定細(xì)胞MDA含量。

1.4.5Real time-PCR:Trizol提取細(xì)胞總RNA，按照試劑盒說明書加樣進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，ABI 7300型熒光定量PCR儀擴(kuò)增。由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。用儀器自帶的分析軟件得到各樣本、各基因擴(kuò)增的Ct值，以β-actin為內(nèi)參照基因，目的基因表達(dá)相對(duì)值RQ=2ΔΔCt。見表1。

表1　Real time-PCR引物序列

1.4.6Western-blot:提取細(xì)胞總蛋白，半干法電泳轉(zhuǎn)移至PVDF膜，10%脫脂奶粉封閉2 h。依次加入特異性一抗和辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG，化學(xué)發(fā)光法顯色、定影。用UVP軟件掃描測定蛋白條帶IOD值，β-actin作為內(nèi)參照，以目的蛋白與β-actin吸光度值的比值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

2　結(jié)果

2.1柚皮素在H2O2介導(dǎo)下對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響與空白對(duì)照組比較，單純H2O2處理組成骨細(xì)胞數(shù)量明顯降低，給予不同劑量柚皮素能夠明顯增加成骨細(xì)胞數(shù)量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，呈劑量依賴性。見表2。

2.2柚皮素在H2O2介導(dǎo)下對(duì)成骨細(xì)胞凋亡的影響與空白對(duì)照組比較，單純H2O2處理組成骨細(xì)胞凋亡率明顯增加，給予不同劑量柚皮素能夠明顯降低成骨細(xì)胞凋亡率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，呈劑量依賴性。見表3。

2.3柚皮素在H2O2介導(dǎo)下對(duì)成骨細(xì)胞氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響與空白對(duì)照組比較，單純H2O2處理組成骨細(xì)胞ROS、MDA含量明顯增加，給予不同劑量柚皮素能夠明顯降低成骨細(xì)胞ROS、MDA含量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，呈劑量依賴性。見表4。

表2　柚皮素在H2O2介導(dǎo)下對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響　±s

注：與空白對(duì)照組比較,*P<0.05;與單純H2O2處理組比較,#P<0.05;與H2O2+0.1 μmol/L柚皮素組比較,△P<0.05;與H2O2+1 μmol/L柚皮素組比較,☆P<0.05

表3　柚皮素在H2O2介導(dǎo)下對(duì)成骨細(xì)胞凋亡的影響　±s

注：與空白對(duì)照組比較,*P<0.05;與單純H2O2處理組比較,#P<0.05;與H2O2+0.1 μmol/L柚皮素組比較,△P<0.05;與H2O2+1 μmol/L柚皮素組比較,☆P<0.05

表4　柚皮素在H2O2介導(dǎo)下對(duì)成骨細(xì)胞氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響　±s

注：與空白對(duì)照組比較,*P<0.05;與單純H2O2處理組比較,#P<0.05;與H2O2+0.1 μmol/L柚皮素組比較,△P<0.05;與H2O2+1 μmol/L柚皮素組比較,☆P<0.05

2.4柚皮素在H2O2介導(dǎo)下對(duì)成骨細(xì)胞Bcl-2、Bax表達(dá)的影響與空白對(duì)照組比較，單純H2O2處理組成骨細(xì)胞Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低，Bax mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯增加，給予不同劑量柚皮素能夠明顯增加成骨細(xì)胞Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)水平，降低Bax mRNA和蛋白表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，呈劑量依賴性。見表5、6。

組別Bcl-2mRNABaxmRNA空白對(duì)照組2.89±0.432.45±0.32單純H2O2處理組0.54±0.07*4.79±0.56*H2O2+0.1μmol/L柚皮素組0.97±0.13*#4.25±0.61*#H2O2+1μmol/L柚皮素組1.56±0.25*△3.67±0.52*△H2O2+10μmol/L柚皮素組2.03±0.34*☆2.98±0.43*☆

注：與空白對(duì)照組比較,*P<0.05;與單純H2O2處理組比較,#P<0.05;與H2O2+0.1 μmol/L柚皮素組比較,△P<0.05;與H2O2+1 μmol/L柚皮素組比較,☆P<0.05

2.5柚皮素在H2O2介導(dǎo)下對(duì)成骨細(xì)胞Caspase-3表達(dá)的影響與空白對(duì)照組比較，單純H2O2處理組成骨細(xì)胞Caspase-3 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯增加，給予不同劑量柚皮素能夠明顯降低成骨細(xì)胞Caspase-3 mRNA和蛋白表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，呈劑量依賴性。見表7。

表6　柚皮素在H2O2介導(dǎo)下對(duì)成骨細(xì)胞Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)的影響　±s

注：與空白對(duì)照組比較,*P<0.05;與單純H2O2處理組比較,#P<0.05;與H2O2+0.1 μmol/L柚皮素組比較,△P<0.05;與H2O2+1 μmol/L柚皮素組比較,☆P<0.05

組別Caspase-3mRNA蛋白空白對(duì)照組0.98±0.120.87±0.12單純H2O2處理組2.99±0.44*2.78±0.41*H2O2+0.1μmol/L柚皮素組2.41±0.35*#2.30±0.31*#H2O2+1μmol/L柚皮素組1.96±0.23*△1.83±0.21*△H2O2+10μmol/L柚皮素組1.41±0.20*☆1.30±0.17*☆

注：與空白對(duì)照組比較,*P<0.05;與單純H2O2處理組比較,#P<0.05;與H2O2+0.1 μmol/L柚皮素組比較,△P<0.05;與H2O2+1 μmol/L柚皮素組比較,☆P<0.05

3　討論

骨質(zhì)疏松癥是由于遺傳、環(huán)境、雌激素缺乏等因素導(dǎo)致成骨細(xì)胞合成新骨不足或破骨細(xì)胞吸收舊骨過多的骨平衡過程失衡，最終導(dǎo)致骨骼完整性的破壞、骨量減少、骨密度降低[6]。研究顯示，激素、炎性因子、生長因子通過影響成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的增殖、分化和成熟影響骨重建過程。近年來多項(xiàng)研究表明，ROS介導(dǎo)的氧化應(yīng)激在骨質(zhì)疏松發(fā)病機(jī)制中占重要地位[7-9]。過多的ROS通過影響細(xì)胞因子、酶活性、受體配體的表達(dá)水平調(diào)控Wnt/β-catenin、PKCβ/p53/p66shc/JNK等信號(hào)通路，誘導(dǎo)與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞增殖、分化、凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，最終造成骨吸收速率超過骨形成速率、破骨細(xì)胞吸收骨組織和成骨細(xì)胞形成骨組織的動(dòng)態(tài)平衡過程失衡及骨質(zhì)疏松癥發(fā)生[10]。目前認(rèn)為，成骨細(xì)胞與骨質(zhì)疏松癥發(fā)病密切相關(guān)，是骨質(zhì)疏松癥治療領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。采用藥物干預(yù)體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞并探討其分子機(jī)制是進(jìn)行抗骨質(zhì)疏松癥并評(píng)價(jià)其藥效學(xué)的重要手段。

Bcl-2家族是影響細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素之一。其中Bcl-2分布于線粒體外膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，參與調(diào)控與細(xì)胞凋亡有關(guān)的過程。Hawkins等[11,12]研究顯示，Bcl-2過表達(dá)通過抑制鈣離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、線粒體通透性及通透轉(zhuǎn)換孔的形成，從而抑制凋亡進(jìn)程。Bax定位于細(xì)胞質(zhì)，是Bcl-2家族中發(fā)揮促凋亡作用的重要成員，其中 BH3是Bax發(fā)揮促凋亡作用的必須結(jié)構(gòu)域，凋亡信息激活Bax后可通過末端疏水結(jié)構(gòu)域錨固在線粒體膜上，改變線粒體通透性，從而促使細(xì)胞色素C、凋亡誘導(dǎo)因子和凋亡蛋白酶激活因子1的釋放，進(jìn)而激活Caspase系統(tǒng)及細(xì)胞凋亡進(jìn)程[13,14]。Caspase-3屬于Caspase蛋白家族，是凋亡效應(yīng)子，能夠被上游效應(yīng)子激活作用于特異性底物，從而造成細(xì)胞形態(tài)和生化改變。研究發(fā)現(xiàn)，中草藥柚皮苷能夠?qū)琴|(zhì)疏松小鼠模型發(fā)揮一定程度保護(hù)作用，而柚皮苷經(jīng)口服途徑進(jìn)入體內(nèi)后的主要代謝物為柚皮素。體外實(shí)驗(yàn)表明柚皮素對(duì)大鼠成骨細(xì)胞也具有促骨形成活性，且較柚皮苷有所增加[3,4]。本研究在細(xì)胞水平觀察柚皮素對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞增殖、凋亡及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，柚皮素在氧化應(yīng)激狀態(tài)下能夠明顯促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、抑制成骨細(xì)胞凋亡、上調(diào)凋亡抑制蛋白Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)、下調(diào)凋亡蛋白Bax、Caspase-3 mRNA和蛋白表達(dá)(P<0.05)，呈劑量依賴性。

綜上所述，柚皮素對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡具有拮抗作用，其機(jī)制與上調(diào)Bcl-2表達(dá)、下調(diào)Bax、Caspase-3表達(dá)有關(guān)。本研究闡明了柚皮素促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、抑制成骨細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制，這不僅有助于認(rèn)識(shí)骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)制，還揭示了中藥柚皮素治療骨質(zhì)疏松癥的分子機(jī)制。

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Effects of naringenin on apoptosis of osteoblasts mediated by oxidative stress and its action mechanism

WUXintao,SHIJing,GAOLecai,etal.

DepartmentofOrthopedics,CangzhouHospitalsofIntegratedTCMandWesternMedicine,Hebei,Cangzhou061001,China

ObjectiveTo observe the effects of naringenin on apoptosis of osteoblasts mediated by oxidative stress, and to explore its action mechanism.MethodsThe osteoblasts were separated and cultured in vitro. The experiment was divided into 5 groups: blank control group,simple H2O2group, H2O2+naringenin low-does group (0.1μmol/L), H2O2+naringenin medium-dose group (1μmol/L) and H2O2+naringenin high-dose group (10μmol/L). The cell viabilities of osteoblasts were detected by MTT assay. The cell apoptosis rates were detected by flow cytometry.The levels of reactive oxygen species (ROS) were observed by fluorescence microscopy. MDA contents were measured by colorimetric technique. The expression levels of Bcl-2, Bax and Caspase-3 mRNA and protein were detected by Real time-PCR and Western Blot,respectively.ResultsAs compared with those in blank control group,the cell viabilities in simple H2O2group were obviously decreased,however, the cell apoptosis rates and the levels of ROS and MDA were significantly increased, meanwhile,the expression levels of Bcl-2 mRNA and protein were obviously down-regulated, however, the expression levels of Bax and Caspase-3 mRNA and protein were significantly up-regulated (P<0.05). As compared with those in simple H2O2group, the cell viabilities in naringenin groups pretreated for 24 hours were obviously increased, and the cell apoptosis rates and the levels of ROS and MDA were significantly decreased,moreover, the expression levels of Bcl-2 mRNA and protein were obviously up-regulated, however, the expression levels of Bax and Caspase-3 mRNA and protein were significantly down-regulated,with a dose-dependent manner (P<0.05). ConclusionNaringenin can promote proliferation of osteoblasts and inhibit apoptosis of osteoblasts mediated by oxidative stress, and its action mechanism may be correlated to up-regulating the expressions of Bcl-2 and down-regulating the expressions of Bax and Caspase-3.

naringenin;osteoblasts; oxidative stress; apoptosis

10.3969/j.issn.1002-7386.2016.19.008

061001河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院骨科(吳新濤、石晶、高樂才、吳文元、龐石磊)；河北省鹽山縣人民醫(yī)院外科(吳新峰)

R 681.4

A

1002-7386(2016)19-2915-04

2016-01-17)

項(xiàng)目來源：河北省中醫(yī)藥管理局科研計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào):2016267)